荧光法测定油菜中的维生素E.docx

1、荧光法测定油菜中的维生素E密 级 公 开 学 号 201240600133 衡水学院毕业论文（设计） 荧光法测定油菜中的维生素E论文作者：程青青指导教师：周晓霞系别：应用化学系专业应用化学年级：2012级提交日期：2016年5月20日答辩日期：2016年6月1日毕业论文学术承诺本人郑重承诺：所呈交的毕业论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不存在抄袭情况，论文中不包含其他人已经发表的研究成果，也不包含他人或其他教学机构取得的研究成果。作者签名： 日 期： 毕业论文使用授权的说明本人了解并遵守衡水学院有关保留、使用毕业论文的规定。即：学校

2、有权保留或向有关部门送交毕业论文的原件或复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公开论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文及相关资料。作者签名： 指导教师签名： 日 期： 日 期： 论文题目：荧光法测量油菜中的维生素E摘 要：本实验采用荧光法为测定方法，对油菜中的维生素E含量进行测定。荧光光度法利用维生素E吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对其进行定性或定量分析。本实验通过单一变量法对实验条件进行控制，进而探讨对油菜的不同浸泡时间、萃取液的不同pH、不同温度等实验条件对实验结果的影响。实验表明，对油菜的浸泡时间为25min效果最好，超过此时间维生素E会受到空

3、气的氧化；测量最佳pH为2.0；水浴的温度应为75，低于此温度不利于维生素E的浸出。使用荧光法所得最佳参数为：激发波长（ex）:293nm,发射波长（em）:324nm。标准曲线方程I=16.488+1.1138，I为荧光强度，为质量浓度，相关系数r为0.9986，检出限为0.0030mgL-1。该方法选择性好，灵敏度高。关键词：荧光法；维生素E；油菜 Title：The Study About Vitamin E Content in Rape With the Method of Fluorescence Abstract: The vitamin E of rape in this ex

4、periment is evaluated by fluorescence method. vitamin E is able to absorb the energy of light which change shorter wave length into longer waves and make an analysis of its quality and nature. This experiment is controlled by single variable method exploring factors such as different soaking time of

5、 rape, pH and temperature influencing the results of experiment.It takes 25 minute to immerse rape, which is enough. Otherwise ,vitamin E could be oxidize by air if the time is a little longer than the regular time. The suitable pH is 6.5. It isnt good for vitamin Es leaching if it is below the temp

6、erature of water bath.The best parameters are excitation wavelength equals 263nm and emission wavelength equals 324nm. The standard equation is I=16.488+1.1138，I is fluorescence , is mass concentration ,the correlation is 0.9986,detection is 0.0030mgL-1. The method has good selectivity and high sens

7、itivity.Keywords: Fluorescence method;Vitamin E;rape1 绪论1.1 维生素E的理化性质和用途 维生素E是一种粘稠状液体，呈微黄色或黄色透明，是一种脂溶性维生素，根据相似相溶原理，维生素E易溶于有机溶剂中，例如无水乙醇、丙酮、乙醚、石油醚、正己烷中，在水中则不易溶。天然的维生素E（又称生育酚）多存在于绿色植物的油脂中，是一种组成较为复杂的混和物。维生素E作为一种抗氧化剂及营养剂其性能十分优良，同时又具有食用安全、生物活性高的特点1，在医药、保健品、食品、化妆品等领域有着极为广泛的应用，近年来成为倍受关注的热点产品。维生素E是到目前为止科学家所发

8、现的唯一一种对身体无毒害的油脂类食品的天然抗氧化剂，它由8种异构体（、生育酚和三烯生育酚等）构成，不溶于水，易溶于多种有机溶剂2。维生素E在隔绝氧气的条件下对热相对是稳定的，加热温度达到200 也不发生结构上的破坏，但对氧十分敏感，在和空气接触的条件下可以被氧化。维生素E是高效的抗氧化剂，在食品、医疗、化妆品方面有着重要应用3。维生素E在身体内可以保护组织细胞免受自由基损害，具有很好的抗氧化作用；因此，维生素E可以起到预防衰老，促进身体内蛋白质更新及合成的作用4；此外，进一步的研究表明维生素E还与动物的精子生成和生殖功能有关，并具有调节血小板粘附力和聚集的作用；维生素E有时候能起到代替微量元素

9、硒，提高人体免疫力，抑制肿瘤细胞的作用。近年来，维生素E的研究逐渐为人们所关注，对其检验方法、定量分析方法也逐渐成为人们关注的焦点。1.2 测定油菜中维生素E含量的方法维生素E作为一种在多个领域用途广泛的营养物质和药用物质，常被用于改善人体内分泌、血管疾病和美容等方面并取得了较为满意的效果。油菜是我国人民较常食用的一种蔬菜。油菜中维生素E含量的测定和研究，对病理学、营养学、临床医学和人民的膳食生活水平的改善都有着重要的意义。进入20世纪以来，维生素E的研究方法日益增多，越来越受到研究学者的重视。其分析方法和技术也日趋完善、成熟。李英丽等5-7论述测定维生素E 常用的分析方法有紫外分光光度法、荧

10、光光度法、高效液相色谱法、生物测定法、比色法、铈量法、近红外光谱法、气相色谱法等。国外Mehboall8等已经使用比色法测定了维生素E在血液中的含量，其使用联苯菲啰啉为显色剂，FeCl5做氧化剂，该方法不但成本低，且简单实用，测定20份样本只需要不到2h。国外Tutem等9则以新亚铜试剂为显色剂，CuCl2为氧化剂在450nm处测定药用试剂中维生素E的含量，测定的结果表明CuCl2做氧化剂时反应条件比较温和，而且还能够克服样品中所含有的某些还原剂如维生素C的干扰，测定结果与FeCl5-联苯菲啰啉比色法及HPLC法相比并无显著性的差异，以此证明此比色法可以作为实验室对维生素E分析的常规方法。气相

11、色谱法是一种对多组分混合物适用的定性定量分析方法10。此法具有不但高度的选择性，且集分离和测定于一体。可以具有选择性的对维生素E及其异构体进行测定。测定时多采用内标法，测定结果不受操作条件和进样量的影响。中国药典多采用气相色谱法。刘悍11等阐述了电化学测定的原理：在碳和电极上维生素E分子上的酚羟基会发生会被不可逆的氧化，其氧化还原电势可测。维生素E分子所具有的这种电化学特性是电化学法测定待测物质中维生素E含量的原理。这种检测方法比高效液相色谱法还要快速。本实验对油菜中维生素E的测定所采用的方法是荧光法。一般情况下荧光法的检测下限可以达到0.10.001gmL-1 。因此，荧光法具有较高的灵敏度

12、，是目前最灵敏的分析检测技术之一。此外，荧光法具有较好的选择性和物质鉴定能力，因为荧光分析法能够同时兼顾荧光发射光谱和激发光谱。但是，由于待测物质的化学结构需要满足荧光分析方法的特殊要求使得荧光分析法的通用性不如紫外可见分光光度法。测定维生素E的其他方法中使用色谱法装置比较复杂，步骤繁琐，不适合用于大量样品的测定，分光光度法干扰因素较多，准确性相对较差12。程功等13红外光谱法吸收强度较弱，谱带较宽用于维生素E的测定具有低成本、快速、简便的优点，但主要用于成分单一、干扰少的植物油中维生素E的测定。本实验采用荧光光度法利用维生素E吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对其进行定性或定量

13、分析。可以从发射光谱或激发光谱进行分析。该法灵敏度高，选择性好且简便、快捷。1.2.1 荧光法荧光法是测定维生素E含量的一种常见方法。到目前为止荧光法是最灵敏的分析技术之一，具有较高的灵敏度。近年来，荧光分析技术的方法和理论不断完善，荧光分析仪器持续发展已经使得荧光分析法成为一种重要的光谱分析方法。荧光现象是一种由光导致的发电发光现象，由于维生素E分子对光具有选择性吸收，使不同波长的激发光具有不同的激发效率。当维生素E分子受到不同波长的入射光的激发，并且在固定的波长处测量激发出来的荧光强度，在绘制光谱曲线时，以荧光强度为纵坐标，以激发强度为纵坐标所绘制出的光谱为维生素E的荧光激发光谱。当绘制维

14、生素E荧光发射光谱时，保持激发光的强度和波长不变，测量维生素E在不同波长处发射的荧光强度，再绘制荧光强度随发射波长变化的关系曲线。在激发光谱中最大激发波长所对应的点是光谱中曲线的最高点。该波长所对应的光具有最强的激发能力。在激发光谱中最大发射波长所对应的点是激发光谱中的最高点。1.3 本实验研究内容本实验主要内容为测定油菜中的维生素E，所用的方法是荧光法。荧光法具有选择性好，灵敏度高的优点。本实验通过单一变量法对实验条件进行控制，进而探讨对油菜的不同浸泡时间、萃取液的不同pH、不同浸泡温度等实验条件对实验结果的影响。通过对得出的荧光谱图和数据进行分析进而确定出最佳的反应温度、萃取液的pH和对油

15、菜的浸泡时间。在实验进行的过程中，使用经过洗涤、干燥的油菜做样品，经过萃取得到萃取液后，对萃取液进行荧光测定，根据荧光测定得到的数据，探讨对油菜的不同浸泡时间、萃取液的不同pH、不同浸泡温度等实验条件对实验结果的影响。并依次绘制出油菜浸泡时间和维生素E荧光强度关系图、不同pH萃取液同维生素E荧光强度关系图、不同提取温度和维生素E荧光强度关系图，分别得出了对油菜进行浸泡的最佳时间、荧光测定的最佳pH和对油菜的最佳提取温度，同时通过测定不同浓度系列维生素E的无水乙醇溶液绘制出维生素E的标准曲线。通过对维生素E标准曲线的拟合，得出了回归方程和相关系数。结果表明维生素E溶液浓度小于10mgL-1时与荧

16、光强度呈现较好的关系。2 实验部分2.1 实验仪器与试剂2.1.1 主要仪器 表2-1 实验主要仪器仪器名称型号生产厂家日立荧光分光光度计F-4500722上海光谱仪器有限公司电子天平FA2004N上海精科仪器有限公司容量瓶50mL广东顺德美的电器有限公司分析天平UW4200S上海精科仪器生产有限公司移液管1mL苏州柏科仪器有限公司电恒温水浴锅HH-2重庆四达实验仪器有限公司2.1.2 主要试剂实验药品规格生产厂家抗坏血酸溶液AR.天津天大化学试剂有限公司氢氧化钠溶液AR.西安化学试剂厂盐酸溶液AR.西安化学试剂厂无水乙醇AR.济南试剂总厂无水乙醇AR.石家庄化工厂无水乙醇 AR.北京化工厂无

17、水硫酸钠 AR.广西百合化工厂重蒸水 AR.济南清岸化工厂维生素E标准液 AR.北京科华新技术有限公司表2-2 实验主要试剂2.1.3 样品油菜（购自衡水学院东家园超市）2.2 荧光法 2.2.1 溶液的配制(1)抗坏血酸溶液（2.5）：用吸量管准确量取抗坏血酸2.50mL于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，避光保存备用。(2) 氢氧化钠溶液（50）：准确称取药品氢氧化钠50g于烧杯中，用50mL蒸馏水溶解，转移至容量瓶中 ，定容，留待使用。(3)盐酸溶液（0.1molL-1）：准确移取分析纯浓盐酸8.5mL，用二次蒸馏水稀释至1000mL14。(4)维生素E标准溶液： 吸取0.5

18、0mL母液，用无水乙醇定容至10.00 mL,避光保存。2.2.2 样品的处理1、样品的处理：准确称取经过洗涤、干燥、粉碎的油菜样品大约1.5000g，放入50mL棕色容量瓶中，加入2.00mL的2%抗坏血酸溶液，5mL的2molL-1盐酸，20mL无水乙醇，在65水浴中恒温振荡25min，取出在流水下冷却至室温。2、皂化：在上述容量瓶中加人1.0mL55%氢氧化钾溶液，在65水浴中恒温振荡20min，取出在流水下冷却至室温，加入5.0mL蒸馏水，摇匀，用无水乙醇定容至50mL。3、提取：移取上述容量瓶皂化液5.00mL于20mL棕色带塞试管中，加入5.0mL无水乙醇(30一60)振荡1min

19、，静置，待分层后(如有乳化现象，加少许无水乙醇)，用注射器移去下层，上层无水乙醇液分别用蒸馏水洗涤2-3次，即可用于测定。2.2.3标准曲线的绘制准确移取维生素E标准溶液0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00mL至100mL容量瓶中，用无水乙醇定容，编号1、2、3、4、5、6、7，浓度分别为0.000、2.000、4.000、6.000、8.000、10.00、12.00gmL-1各取 10.00mL，置比色管（编号1、2、3、4、5、6、7）中，立刻进行测量。测量结果如图：荧 光 强 度浓度（mgL-1）维生素E标准曲线经测定不同质量浓度的维生素E溶液，得出

20、回归方程I=16.488+1.1138，I为荧光强度，为质量浓度，相关系数r为0.9986，检出限为0.0030mgL-1。2.2.4维生素的激发光谱和发射光谱 准确量取维生素E的标准液1mL于10mL比色管中，使用无水乙醇定容 。然后，将比色管中的溶液倒入荧光比色皿中，用擦镜纸擦去比色皿外侧溶液，打开仪器盖，将比色皿放入仪器，盖好盖子。开始测量。测量时，固定其他实验条件及发射波长，只改变激发波长，测量得到维生素E的激发光谱。然后，固定激发波长在维生素E最强激发波长295nm处，固定其他实验条件，改变发射波长，测量维生素E的荧光发射光谱15。实验测得最佳激发波长（ex）:293nm,最佳发射波

21、长（em）:324nm。荧 光 强 度/nm图2-1维生素E激发光谱荧 光 强 度/nm图2-2维生素E发射光谱2.2.5最佳萃取时间的选择 准确称取经过洗净、烘干的油菜五等份，按照2.2.2的处理方法，保持其他实验条件不变，水浴时间分别控制在10min、15min、20min、25min、30min,得出的维生素E提取液分别进行荧光测定，根据所得到的荧光强度数据绘制油菜水浴处理时间和荧光强度的关系。实验发现对油菜进行萃取的最佳时间为25min。荧 光 强 度/nm图2-3浸泡时间与荧光强度关系图2.2.6维生素E荧光测定最佳酸度的测定取七只比色管编号，在七只比色管中各移取1mL维生素E标准液

22、，使用0.1molL-1盐酸调节pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，调节完成后，放入荧光测量池进行荧光测定。根据荧光测定的数据，绘制出荧光强度与萃取液pH的关系曲线。测定结果表明最佳pH=2.0。荧 光 强 度pH图2-4pH与维生素E荧光强度关系图2.2.7最佳水浴温度的测定 按照2.2.2的样品处理方法，保持其他实验条件固定，水浴温度分别控制为65、70、75、80、85，将得出的维生素E萃取液放入荧光测量池进行测定。根据测量数据绘制水浴温度和维生素荧光强度关系曲线，实验结果表明最佳水浴温度为75。荧 光 强 度温度（）图2-5温度与维生素E荧光强度关系图2.

23、2.8样品中维生素E含量的测定 在按照2.2.2的样品处理方法，控制实验水浴时间25min，水浴温度保持在75，荧光测定时pH调节为2.0。提取出维生素E萃取液后，在295nm处进行荧光测定。记录样品重量m1荧光强度I1。对上述样品液完成荧光测定后，再按照2.2.2的样品处理方法准备空白液（不加油菜，控制实验水浴时间25min，水浴温度保持在75，荧光测定时pH调节为2.0），在295nm处进行荧光测定。记录空白液的荧光强度I0。最后，记录维生素E标准品用量m2，在295nm处对标准液进行荧光测定，记录标准液的荧光强度I2。根据所得数据计算油菜中维生素E的含量。计算公式采用阴季悌16：维生素E

24、含量（mgg-1）：I0-空白试剂的荧光强度I1-样品液的荧光强度I2-标准维生素E溶液的荧光强度m1-样品重量m2-标准维生素E重量3 结果与讨论3.1 荧光法测定结果3.1.1 荧光法法测定油菜中维生素E含量的结果 采用荧光法对油菜中维生素E 含量进行测定，测得100g油菜中含有12.46mg维生素E。表3-1 荧光法测定油菜样品中维生素E的含量序号123样品重量m1/g1.50001.50041.5002标准维生素E重量m2/mg0.16690.16810.1679I0121212I1123.6123.9123.7I2111.9120.1120.0维生素E含量12.4212.5412.5

25、0维生素E平均含量mg/100g12.46RSD %0.623.1.2 荧光法测定油菜中维生素E加标回收率的结果 表3-2 荧光法测定油菜中维生素E的加标回收率编号样品维生素E含量（mg/100g）加标量（mg）测定量（mg/100g）回收率（%）平均回收率（%）112.42100108.596.1195.53212.54100107.895.28312.50100107.795.20由上表可知，使用荧光法测定油菜中维生素E的含量，平均加标回收率为95.53%。荧光法测定维生素E的RSD 大于1，说明其方法可行，且仪器简便。结 语 维生素E是一种用途广泛的营养物质。其被广泛用于改善人体内分泌，

26、血管疾病和美容等方面。油菜是我国人们较常食用的一种蔬菜。油菜中维生素E含量的检测和研究，对营养学、病理学、临床诊断和人民的膳食生活都有着重要的意义。 在荧光法测定油菜中的维生素E含量的试验中，容易影响实验结果准确度的主要因素包括对油菜的浸泡时间、进行荧光测量的维生素E提取液pH以及水浴的温度。荧光法测定油菜中的维生素E时，在对油菜的提取过程中要均匀的摇晃，否则会影响维生素E的提取效果，导致实验结果偏低17。由于维生素E和空气接触会被氧气氧化，因此，在实验的过程中加入一些还原剂是必要的，本实验采用抗坏血酸溶液做还原剂。能够很有效的避免维生素E被氧化。在对油菜的处理过程中，皂化时容易产生浑浊，静置

27、处理就会分层，能得到澄清的维生素E提取液。从而得到正确的实验结果。经测定不同质量浓度的维生素E溶液，得出当维生素标准液浓度在0-10mgL-1范围内，浓度和荧光强度成交好的线性关系，回归方程为I=16.488+1.1138，I为荧光强度，为质量浓度，相关系数r为0.9986，检出限为0.0030mgL-1。本实验的实验结果表明在75，对油菜提取25min，将所得提取液pH控制为2.0，能得出油菜中维生素E的含量为12.46mg100g-1。荧光法该法灵敏度高，选择性好且简便、快捷。参考文献1朱圣东,吴迎.天然维生素E的制备及应用J.精细石油化工进展，2011,2,(1):30-34.2向慧敏,

28、代志凯,吴阳丰,等.维生素E检测技术的研究进展J.中国食品添加剂，2011,（3）:180-181.3王丰玲,张英锋,郑向美,等.天然维生素E的制备、抗氧化机理及应用前景J.化学教育,2007,（12）:10-12.4郭健,李敏,孟岩.测定食品中维生素E荧光分光光度法的探讨J.中国卫生检验杂志,2013,（13）:348-349.5李英丽,邓连琴,果秀敏,等.同步荧光法测定蔬菜中维生素E含量J.河北大学学报，2009,24(29):412-414.6李书国,薛文通,陈辉,等.食用油维生素E分析检测技术研究进展J.粮食与油脂，2006.（10）:26-27.7黄旭.食品中维生素E的检测方法综述J

29、.分析与检测，2015.（2）:83-84.8 MehbooaliN Perwaiz Iqbalm. Asimple micro method for determination of plasma levels oftocopherol (vitamin E) in pakistan inormal adults J.Pak J. Pham. Scj. 2008.21.(4):361-3659 TutemE Apak R GunaydE etaJ Spectrophotometric determination of vitamin E (-tocopherol) using copper

30、()-neocuproine reagentJ.Talanta.1997.(44): 249-25510白旸.维生素E的检测技术J.河北职业技术学院学报，2006.9(6):12-13.11刘悍,汤建国,倪朝敏,等.天然维生素E的提取工艺与检测技术.J化工时刊，2008.22(11):53-55.12李艳飞,王振勇,石发庆,等.饲料中维生素E的含量测定J.黑龙江畜牧兽医，2001,（2）:18-19.13程功,赵国屹.关于食品中维生素E的常用检测方法研究J.食品安全导刊，2015.10(30):112-113.14周松,阚建全,周桦.食品中维生素E含量的快速荧光测定J.安顺师专学报，1997,（4）:58-63.15游联勤,吴国强,田笠卿,等.荧光分光光度法测定茶叶中维生素EJ.南京医学院学报,1987,7,(4):304-305.16阴季悌.用荧光法测定饲料添加剂中的维生素EJ.东北农学院学报，1988.3(19):90-91.17俞巧玲,熊书亭,段秀泰.食品饲料中维生素E的荧光测定J.江苏农业学报，1989,5(2):45-48.致 谢在论文即将完成之际，我向曾经给予我帮助和支持的人表示衷心的感谢。首先