重组蛋白和多肽的分离纯化.docx
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重组蛋白和多肽的分离纯化
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2007-09-0316:
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重组蛋白和多肽的分离纯化
1. 概述
分离纯化组成了基因工程的下游处理(downstreamprocessing)阶段,这一过程又和上游过程紧密相联系,上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化,所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计,并充分考虑上游因素对下游的影响,如是否带有亲和标签,是否进行分泌表达。
目前应用最广泛的表达系统有三大类,分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统,不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程,目标蛋白表达是否形成包涵体,目标蛋白表达的定位(胞内、细胞内膜、周质空间和胞外),蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。
选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤,并且由于蛋白质种类少,目标蛋白容易纯化;而在细胞质内表达蛋白,可能是可溶性表达,可能形成包涵体,可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤,而包涵体易于分离,纯度较高,但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难,需要对聚集的蛋白进行变复性,通常活性蛋白的得率比较低,表1列出了不同策略对表达、纯化的影响,对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免,如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签,有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化,并能保护目标蛋白不被降解(96)。
表1重组蛋白不同表达策略的优点和缺点
表达策略 优点 缺点
分泌表达至细胞外 增强正确二硫键的形成
降低蛋白酶对表达蛋白的降解
可获得确定的N末端
显著减少杂蛋白水平,简化纯化
不需要细胞破碎 表达水平低
多数蛋白不能进行分泌表达
表达蛋白需要进行浓缩
细胞周质空间表达 增强正确二硫键的形成
可获得确定的N末端
显著减少杂蛋白水平,简化纯化 好些蛋白不能分泌进入周质空间
没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术
周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解
胞内包涵体表达 包涵体易于分离
保护蛋白质不被降解
蛋白质不具有活性对宿主细胞生长没有大的影响,通常可获得高的表达水平 需要体外的折叠和溶解,得率较低
具有不确定N末端
胞内可溶性蛋白表达 不需要体外溶解和折叠
一般具有正确的结构和功能 高水平的表达常难以得到
需要复杂的纯化
可发生蛋白质的酶解
具有不确定的N末端
在细胞的提取物中,除了目标蛋白外,还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。
在这样一个混合体系中,蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离,得到一定的量,达到一定的纯度,同时要尽可能保留蛋白的生物活性,并使蛋白保持完整。
所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程,总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位,而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。
当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定,对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度,并对处方有活性和稳定性的要求,对于某些酶的纯度则要求较低,需要在纯度和得率之间进行一个平衡,所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。
蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构,对于有生物活性的蛋白质,在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点,采用合适的操作条件和方法,保证目标蛋白的活性尽量不损失。
除了在分离纯化的初期,要采用快速的方法除去影响目标蛋白稳定性的杂质,还要严格控制涉及蛋白质变性的各种因素,来避免蛋白质失去活性。
蛋白质的构象稳定性可以通过测定蛋白质变性反应时折叠(f)和去折叠(u)间自由能的变化(ΔGf→u)来衡量,ΔGf→u越大蛋白质就越稳定。
根据报导蛋白质的ΔGf→u在5—20kcal/mol范围之间,单个氢键可造成0.5—2kcal/mol自由能的变化,一个离子对可造成0.4—1.0kcal/mol自由能的变化,因此ΔGf→u相对比较小,这样天然状态仅仅比去折叠状态稳定一点,所以必须克服蛋白质内在的不稳定性,保留蛋白的活性。
这一点在分离纯化和蛋白质储存中都很重要,影响蛋白质稳定性的因素有温度、pH、离子强度、某些添加剂、表面吸附、震摇、剪切力、冻融、蛋白浓度、压力等,这些因素对折叠的影响有的是可逆的,有的是不可逆的,而且相互之间也有影响,在实际处理中应选择合适的条件,尽量避免不利因素的影响
(2),并利用活性跟踪的方法对处理进行评价,指导分离纯化。
在进行任何纯化工作时,第一步必须针对目标蛋白建立特异性的分析方法。
这些特异性的分析方法都是基于目标蛋白的一些特性,如酶的活性,免疫学活性,物理特性(如分子量、等电点、光谱学特征等),生物学活性。
在理想的情况下,我们希望所选择的分析方法具有特异、快速、灵敏和可定量的特点。
特异性要求分析方法反映目标蛋白的独特性,以排除假阳性。
快速则要求能很快的给出定性和定量结果,以便更好的与分离纯化的工作相衔接。
灵敏的分析方法仅需要少量的样品,这就给操作带来了极大的方便。
在分离纯化的每一步,都需要对蛋白和活性进行定量,这就要求分析方法有准确可定量的特点,以对分离纯化的效果进行评价。
如通过SDS-PAGE电泳测定蛋白质分子量来鉴定蛋白质,由于电泳的分辨率限制,常常不能确定收集部位中是否含有目标蛋白或目标蛋白是否得到了富集,这时就需要运用更特异的分析方法,如Westernblotting就可以从复杂的混合物中描述蛋白的分子量,并对蛋白进行定量。
另外当一些蛋白没有方便可用的生物学活性测定方法,或者由于干扰物质的存在不能测活,可应用一些免疫学的方法进行检测。
在纯化的过程中,需要监测以下几个参数:
总的样品体积,样品中总的蛋白,目标蛋白的活性单位,通过这些基本的信息,就可以跟踪每步纯化的效率,计算出目标蛋白的回收率,目标蛋白的比活性,以及纯化的倍数,从而对纯化的每一步,乃至整个流程进行定量评价。
Richard等在纯化重组大肠杆菌RNA聚合酶σ32亚基的工作中给出了很好的范例,在定量测定项中,包括了蛋白质的定量测定、定量SDS-PAGE、定量蛋白质斑点印迹和酶活测定,使用这些方法对操作的每一个阶段取样进行纯化效果的评价,从而确保每一步纯化的有效性
(1)。
正是由于分析方法在分离纯化中的指导性作用,所以有效的分析方法是分离纯化是否能够成功的前提。
2. 分离纯化的方法策略及其应用
下游的分离纯化步骤不仅要在可替换的分离技术间进行选择,如细胞的破碎可选择高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎或酶溶法,分离细胞、细胞碎片、包涵体和沉淀物,可选择离心或过滤,需要进行浓缩的时候,可选择沉淀或超滤;另一方面,设计的纯化工艺包括特定的层析步骤,及层析的先后顺序,以期得到最大的得率。
吸附层析,如离子交换层析,疏水层析和亲和层析,可基于特定的选择性达到对目标蛋白的纯化,适用于大量样品的处理。
凝胶过滤层析用于后续的精制步骤,如去除少量的杂蛋白或聚合体,在纯化过程中用于脱盐和缓冲液交换。
在分离纯化中对每个步骤的选择,可以遵循以下原则:
1应尽可能的利用蛋白质的不同物理特性选择所用的分离纯化技术,而不是利用相同的技术进行多次纯化;2不同的蛋白质在性质上有很大的不同,这是能从复杂的混合物中纯化出目标蛋白的依据,每一步纯化步骤应当充分利用目标蛋白和杂质成分物理性质的差异。
所以在分离纯化的开始阶段,要尽可能的了解目标蛋白的特性,不仅如此还要了解所存在杂质成分的性质,如大肠杆菌的蛋白大多是一些低分子量的蛋白(<50000Da),而且酸性蛋白较多;3在纯化的早期阶段要尽量减少处理的体积,方便后续的纯化;4在纯化的后期阶段,再使用造价高的纯化方法,这是因为处理的量和杂质的量都已减少,有利于昂贵纯化材料的重复使用,减少再生的复杂性(84)。
在下游的纯化工艺中为了提高蛋白的得率和处理的效率,应当使用最少的纯化步骤,经典的纯化过程如图1所示。
在初始的纯化阶段,除了使目标蛋白和细胞内的DNA、RNA、多糖以及性质差别较大的蛋白质成分分离,采用的分离方法要能除去影响目标蛋白稳定性的杂质,保护目标蛋白不被蛋白酶降解,进行目标蛋白的捕获和浓缩。
在这一阶段的纯化中,盐析沉淀仍然应用,但共沉淀的杂质常常很多,离子交换层析和疏水层析具有操作上的优点,可以再生使用,成为这一步通常选用的层析方法;中间阶段纯化是最为关键的阶段,这时要能达到和大量的杂蛋白分离,利用蛋白质不同的性质选择不同的纯化方法,每一步的方法要有足够的选择性,提高目标蛋白质的纯度;最后进行精制纯化,常用凝胶层析,使目标蛋白的纯度进一步提高达到要求。
对于包涵体蛋白质,由于涉及包涵体蛋白质的变复性,其纯化步骤和方法与可溶性蛋白不同,需要对每一种包涵体蛋白质建立相应的复性方法,将在后面作介绍。
图1经典的蛋白质纯化流程图
在工业上,为了尽可能提高过程的通量和减少生产的成本,发展的方法与传统的方法不同。
双水相萃取和扩张床吸附技术,可以处理全细胞培养液,通过整合技术的使用,能达到萃取、浓缩和初步纯化的目的。
另外这两种技术和亲和相互作用结合可进一步提高处理的选择性。
相似的,亲和相互作用还可以整合进其它的高通量处理,如亲和膜过滤和亲和沉淀
(2)。
生产上使用的非线性色谱,如置换色谱,一次层析的载量很大,得到的蛋白纯度很高,近年来也有很大的发展和应用(85,36)。
2.1包涵体蛋白质的折叠复性
在过去几十年的发展过程中,重组DNA技术为大规模生产目标蛋白提供了新的途径,尽管有不同的宿主系统可供选择,如果翻译后修饰不是蛋白质功能所必需的话,大肠杆菌和其它的原核宿主系统仍然是生产重组蛋白的首选(17)。
细菌如大肠杆菌可以在短时间里得到高水平表达的蛋白质,但同时表达的蛋白质常常形成非活性的包涵体。
包涵体的形成是一个由许多蛋白质参与的极端复杂的动力学过程,依赖于蛋白质的折叠速率和聚集速率,并且与蛋白质的合成和降解程度相关(35)。
强的表达系统,高的诱导剂浓度,相对较高的培养温度常常造成包涵体的形成。
除了外界因素,包涵体的形成依赖于蛋白质特异的折叠行为,而不是蛋白的通常特性,如大小,融合标签,相对的疏水性。
尽管如此,限制折叠速率的结构特性,如二硫键的形成常常是含有二硫键蛋白质正确折叠的限速步骤(并不绝对,因为有些蛋白质二硫键的破坏并不影响其功能),富含二硫键的蛋白质具有更为复杂的结构,当高水平表达时,由于大肠杆菌细胞质是一个偏还原性的环境,蛋白质容易形成错配的二硫键,这常常是包涵体形成的主要原因。
膜蛋白具有暴露的疏水区,表达时易于聚集形成包涵体,也有可能由于降解或对细胞的毒性作用使得表达水平极低(45)。
蛋白质的糖基化可以影响到蛋白质的折叠行为和溶解性,当它们在原核系统进行表达时,也容易聚集(4)。
蛋白质进行可溶性表达和表达形成包涵体各有利弊,对许多蛋白,再折叠很困难,或者不可能,进行可溶性的表达就是首选。
现在发展了许多方法减少包涵体的形成,如使用中等强度或弱的启动子,低温培养,有限的诱导,优化培养基条件,进行融合表达(49),与伴侣分子和折叠酶共表达(3,5),表达定位于不同的空间(7,58),选择突变的菌株(6,43)或其他的原核表达系统(34)。
由于影响蛋白质细胞合成和折叠的因素太多,优化结果不可预测,如对于抗体Fab片段,尽管只有可变区序列不同,也不能预测新的Fab片段在体内是否可以正确折叠(4),所以即使采用了促进可溶性表达的方法,也不能保证不形成包涵体。
从另一方面来讲形成的包涵体易于和细胞的其它成分分离,而且过量表达的目标蛋白在包涵体中得到了富集,提高了纯度,降低了分离纯化的难度。
所以如果包涵体蛋白可以进行体外的正确折叠,那么形成包涵体就可以接受,对易受细菌蛋白酶降解的蛋白质或对细菌有毒性的蛋白质来说,表达产生包涵体是绝对必要的。
内皮抑素(endostatin)可以特异性的抑制内皮细胞的增殖,具有抑制新生血管生成和抑制肿瘤生长的作用,已进入临床研究阶段。
采用酵母表达系统,可直接产生具有活性的蛋白质,但是表达的水平和蛋白质的回收率较低,采用大肠杆菌表达则形成包涵体,包涵体蛋白质的折叠复性非常困难,改善蛋白质的折叠复性具有实际的应用意义。
通过对内皮抑素折叠机制的研究表明,紧密折叠的内皮抑素对酸耐受,在酸性条件下有可能得到大量的正确折叠的蛋白质(15)。
所以如果对于包涵体蛋白质,通过机制的研究,能够解决折叠复性的问题,那么利用包涵体的高水平表达,就可以得到大量的蛋白质,降低生产的成本。
在包涵体蛋白质的变复性中,不管是采用什么方法进行折叠,都要用变性剂溶解包涵体,最终又都要去除变性剂,理解变性剂对蛋白质的影响可以指导我们设计复性过程。
图2:
在各种变性剂浓度条件下蛋白质的溶解性和构象。
如图2所示,随着变性剂浓度的变化,不仅具有天然构象状态蛋白质的比率在改变,而且蛋白质的溶解性也在改变。
在高的变性剂浓度条件下,蛋白质的极性和非极性侧链都是可溶的,但是蛋白质却是去折叠的,如图2中d所标的区段。
在低的变性剂浓度条件下,如图2中a区段所示,天然构象的蛋白质是稳定的,但也会稳定部分折叠的中间体,这些部分折叠的中间体易于自我缔合形成沉淀。
所以选择b区段所在的变性剂浓度来进行蛋白质的折叠更为有效,这一区段即可以稳定蛋白质的天然构象,而且可以增加天然构象蛋白质的溶解性,对于部分折叠的中间体却没有稳定作用。
避免选择c区段所在的条件进行折叠,因为这一区段天然和变性的蛋白质都只有有限的溶解性,折叠速度也很慢(13)。
这一图示所展示的规律对所有蛋白并不是统一的,但它向我们描述了一个大概的情况,在这一过程,不仅仅要考虑变性剂对天然构象和折叠中间体的稳定作用,还要考虑对蛋白溶解性的影响。
在高的变性剂浓度,蛋白质是去折叠的,充分溶剂化的,柔性的,在折叠缓冲溶液中,蛋白质是折叠的,具有刚性的,将蛋白质从高变性剂浓度条件变为折叠缓冲溶液,就会使蛋白质坍塌形成紧凑的结构,但蛋白的这一过程不总能有效进行,常常存在错误折叠和聚集,所以在包涵体的变复性过程中,除了要控制上面所讲的参数,还有两方面的参数需要控制,一是应用添加剂,来促进折叠、减少聚集,二是控制溶液的氧化还原状态促进二硫键的正确配对。
通常从包涵体中回收活性蛋白质包括三个步骤:
包涵体的分离和洗涤,包涵体蛋白质的溶解和溶解蛋白质的再折叠。
前两个步骤效率较高,但是再折叠的效率率常常不能令人满意,折叠的方法和折叠的条件需要通过实验来进行筛选。
2.1.1蛋白质折叠的过程和机理
对蛋白质折叠机理的研究,对保留蛋白质活性,维持蛋白质稳定性和包涵体蛋白质折叠复性都具有重要的意义(21)。
早在上世纪30年代,我国生化界先驱吴宪教授就对蛋白质的变性作用进行了阐释(8),30年后,Anfinsen通过对核糖核酸酶A的经典研究表明去折叠的蛋白质在体外可以自发的进行再折叠,仅仅是序列本身已经包括了蛋白质正确折叠的所有信息(9,10),并提出蛋白质折叠的热力学假说,为此Anfinsen获得1972年诺贝尔化学奖。
这一理论有两个关键点:
1蛋白质的状态处于去折叠和天然构象的平衡中;2天然构象的蛋白质处于热力学最低的能量状态。
尽管蛋白质的氨基酸序列在蛋白质的正确折叠中起着核心的作用,各种各样的因素,包括信号序列,辅助因子,分子伴侣,环境条件,均会影响蛋白质的折叠,新生蛋白质折叠并组装成有功能的蛋白质,并非都是自发的,在多数情况下是需要其它蛋白质的帮助,已经鉴定了许多参与蛋白质折叠的折叠酶和分子伴侣(3,16,86),蛋白质“自发折叠”的经典概念发生了转变和更新,但这并不与折叠的热力学假说相矛盾,而是在动力学上完善了热力学观点。
在蛋白质的折叠过程中,有许多作用力参与,包括一些构象的空间阻碍,范德华力,氢键的相互作用,疏水效应,离子相互作用,多肽和周围溶剂相互作用产生的熵驱动的折叠(12,52),但对于蛋白质获得天然结构这一复杂过程的特异性,我们还知之甚少,许多实验和理论的工作都在加深我们对折叠的认识,但是问题仍然没有解决。
在折叠的机制研究上早期的理论认为,折叠是从变性状态通过中间状态到天然状态的一个逐步的过程,并对折叠中间体进行了深入研究,认为折叠是在热力学驱动下按单一的途径进行的。
后来的研究表明折叠过程存在实验可测的多种中间体,折叠通过有限的路径进行。
新的理论强调在折叠的初始阶段存在多样性,蛋白质通过许多的途径进入折叠漏斗(foldingfunnel),从而折叠在整体上被描述成一个漏斗样的图像,折叠的动力学过程被认为是部分折叠的蛋白质整体上的进行性装配,并且伴随有自由能和熵的变化,蛋白质最终寻找到自己的正确的折叠结构,这一理论称为能量图景(energylandscape),如图3所示,漏斗下方的凹凸反映蛋白质构象瞬间进入局部自由能最小区域(13,14)。
图3:
能量图景(Theenergylandscape)的示意图,高度代表能量尺度,宽度代表构象尺度,在漏斗(funnel)的下方存在别的低能量状态,共存的不同能量状态的蛋白质种类也降到最小(14)。
这一理论认为结构同源的蛋白质可以通过不同的折叠途径形成相似的天然构象,人酸性成纤维生长因子(hFGF-1)和蝾螈酸性成纤维生长因子(nFGF-1)氨基酸序列具有约80%同源性,并且具有结构同源性(12个β折叠反向平行排列形成β折叠桶),在盐酸胍诱导去折叠的过程中,hFGF-1可以监测到具有熔球体样的折叠中间体,而nFGF-1经由两态(天然状态到变性状态)去折叠,没有检测到中间体的存在,折叠的动力学研究也表明两种蛋白采用不同的折叠机制(38)。
对于同一蛋白质,采用的渗透压调节剂(osmolytes)不同,蛋白质折叠的途径也不相同,说明不同的渗透压调节剂对蛋白质的稳定效应不同(11)。
这两个例子都说明折叠机制的复杂性,也与上面所介绍的理论相吻合。
2.1.2包涵体的分离和溶解
分离包涵体的第一步是对细菌进行最大限度的溶解,将几种细胞破碎技术相结合,如联合使用溶菌酶处理,高压匀浆细胞破碎和含表面活性剂的高盐溶液处理,可以使膜碎片和细胞壁碎片最大限度的分解。
细胞破碎后,通过离心的方法可以很方便的回收包涵体,再用洗涤液(通常含有低浓度的变性剂,表面活性剂,还原剂,EDTA)对包涵体进行清洗,就可以得到较纯的包涵体(4,74)。
通常要选用强的变性剂使蛋白质完全变性溶解,如6M的盐酸胍和8M的尿素,蛋白质浓度多采用1-10mg/ml(22)。
由于盐酸胍溶解包涵体蛋白质能力比尿素强,而且尿素中的异氰酸酯可以使自由氨基氨甲酰化(这种作用在碱性条件下表现的更强),所以常常首选盐酸胍作为解离剂。
对含有分子间二硫键或非天然二硫键的包涵体蛋白质,在溶解过程中需要加入还原剂,如二硫苏糖醇,β-巯基乙醇,还原型谷胱甘肽,加入螯和剂,如EDTA,可以防止金属催化的半胱氨酸氧化。
除此之外,改变pH和使用表面活性剂也被用于溶解包涵体蛋白质(22),相对而言,这两种方法的应用较少,而且只有具有正确二硫键的包涵体蛋白质才可以用表面活性剂进行溶解,否则可同时形成正确的和非正确的二硫键,表明用尿素、盐酸胍变性和用表面活性剂变性对蛋白质的结构和动力学有不同的影响,Tsumoto在这方面做了详细的论述(25)。
Panda等在高pH条件下使用低浓度的尿素溶解包涵体蛋白质,用于重组牛生长激素、重组人生长激素和猕猴透明带糖蛋白的变复性,认为在变性时蛋白质所保留的天然二级结构有助于蛋白的折叠,减少蛋白质的聚集。
但采用的高pH条件可以使氨基酸残基发生化学修饰,还需要更多的验证(73)。
以上变性的方法属于化学变性,使用高的静力压提供了蛋白质变性的另外一种物理变性方法,静力压促进蛋白质变性解离,是因为蛋白质在变性条件下,系统整体趋向于更小的体积。
联合使用高压和低浓度的变性剂已用于包涵体蛋白质和蛋白质聚集体的变性,是一种有前景的变性方法(31,83)。
2.1.3溶解后包涵体蛋白质的折叠复性
蛋白质分子变性后,通过改变折叠的条件使蛋白质恢复其天然构象的过程,称为复性。
已经发展了很多的方法用于包涵体的折叠复性,但是这些方法的结果并不可预测,每一种方法都需要对各种实验条件,如变性剂浓度、pH、温度、蛋白质浓度、离子强度、添加剂的浓度,进行优化选择。
通常包涵体在变性溶解后具有高的纯度,可以直接进行复性。
但由于包涵体还含有其它的细胞成分,如膜蛋白、磷脂、核酸,可能影响蛋白质的复性(53,54),为了进一步提高纯度,有些研究工作在包涵体变性后先进行蛋白的纯化,如亲和层析(47,55,57,60,63,64,65,68)、离子交换层析(47,56)、凝胶过滤层析、反相层析(62),再进行变性蛋白质的复性,层析在变性条件下应用为这一策略提供了技术支持。
为了控制折叠、错误折叠和聚集的速率,一种方法是降低变性剂的浓度,降低的速度和操作的时间都决定折叠的效率。
另一种方法就是加入添加剂来减少聚集,促进折叠,如L-精氨酸,盐,有机溶剂,一些表面活性剂,渗透压调节剂(osmolytes),硫代甜菜碱类物质(NDSBs),这些物质或稳定蛋白质的天然构象,或使部分折叠的中间体不稳定,表2列出了这些化合物和它们可能的作用机制,它们在蛋白质的折叠中起着重要的作用,已得到广泛的应用(13,25,32,4,74),但对于其中的好些化合物参与折叠的作用机制我们还了解不多。
表2增加蛋白质折叠的添加剂
添加剂 可能的作用机制
甘油 对蛋白质具有优先的水合作用/增加黏度
L-精氨酸 两亲分子/渗压剂
甘氨酰甜菜碱/山梨糖醇 对蛋白质具有优先的水合作用
阿拉伯聚糖 增加黏度
木糖醇 增加黏度
乙醇 调节极性
DMSO 调节极性
两性离子表面活性剂(Zwitterionicdetergents) 保护非极性表面
TritonX-100 保护非极性表面
硫代甜菜碱类物质(NDSBs) 保护非极性表面
蔗糖/海藻糖 对蛋白质具有优先的水合作用/增加黏度
N-氧化三甲胺(TMAO) 对蛋白质具有优先的水合作用/渗压剂
三氟乙醇(TFE) 促进二级结构的形成
低浓度盐酸胍 使部分折叠的中间体不稳定/增加天然构象蛋白质的溶解性
低浓度尿素 使部分折叠的中间体不稳定/增加天然构象蛋白质的溶解性
配体 稳定天然结构状态
聚乙二醇 保护熔球体(moltenglobule)/增加黏度
在折叠过程中另一个关键的问题是正确二硫键的形成,一旦形成了错误的二硫键,就不能再折叠形成正确的结构,所以在折叠时不仅要氧化促进二硫键的形成,还要加入还原剂促进二硫键改组(disulfide-bondreshuffling),使蛋白质最终折叠成正确的结构。
常用的方法有:
1使用金属催化的空气氧化,并添加还原剂促进二硫键改组,由于氧在蛋白质溶液中溶解性低,这种方法的效率较低,改用搅拌促进氧的质量传输,又会造成蛋白质的聚集;2使用小分子还原型和氧化型的巯基试剂对,包括还原型和氧化型的谷胱甘肽(GSH/GSSG)、半胱氨酸和胱氨酸(cysteine/cystine)、半胱胺和胱胺(cysteamine/cystamine)、二硫苏糖醇和氧化型谷胱甘肽(DTT/GSSG),二流赤藓糖醇和氧化型谷胱甘肽(DTE/GSSG),这一方法是目前常用的方法,通常使用的巯基试剂总浓度为5-15mM,还原剂和氧化剂的比为5:
1―1:
1(4,74)。
3在复性前将巯基保护起来,有两种方法可以选择,一是通过谷胱甘肽和蛋白的半胱氨酸残基形成二硫键来保护巯基,二是进行半胱氨酸磺酸化,从而减少复性过程中不正确的二硫键的形成,复性后再加入还原剂使形成正确二硫键。
人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)含有35个半胱氨酸残基,可形成17对二硫键,即使在天然状态下也只具有低的溶解性,进行原核表达时这两种巯基保护方法都被用于该蛋白质的折叠复性,由于在蛋白质的巯基上引入了带电荷的残基,增加了变性蛋白和部分折叠中间体的溶解性,减少了复性过程中蛋白质的聚