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应用蛋白质化学材料
无细胞蛋白表达系统的应用
无细胞蛋白表达系统又称为体外翻译系统，是模拟生物细胞的生命现象，重现胞内蛋白转录翻译过程。
无细胞蛋白质合成体系以外源目的mRNA或DNA为蛋白质合成模板，通过人工控制补加蛋白质合成所需的底物和转录、翻译相关蛋白因子等物质，能实现目的蛋白质的体外蛋白合成。
抗体在治疗、诊断和应用研究领域都起着重要作用，抗体也是检测生物靶标的重要物质。
在临床试验中使用的药物制剂中约有30%为基因工程抗体。
抗体在诊断和治疗中的重要作用促进了生产高特异性抗体的方法和技术的巨大发展。
利用杂交瘤技术生产抗体以及利用原核细胞和哺乳动物细胞生产抗体或抗体片段技术已经发展的相当完善。
然而，基于细胞的蛋白生产比较耗时，花费也高，高效的无细胞蛋白合成体系应运而生。
在过去的十年里，无细胞蛋白表达系统已成功生产了不同来源各种特性的多类蛋白，被证明是可靠、灵活和高效的蛋白生产平台。
无细胞蛋白表达体系已经成功的生产出完整抗体和抗体片段。
无细胞蛋白表达系统合成二硫键蛋白：
抗体是较为复杂的蛋白分子，包含两条同样的重链和轻链。
每条抗体链都包含清晰的功能域，其中β-折叠以二硫键相连，形成β桶状。
二硫键对抗体的折叠和功能起着重要作用。
因此，无细胞蛋白表达体系需要提供能够形成二硫键的环境以表达功能抗体。
在过去的十年里，无细胞蛋白体系已经成功表达了二硫键蛋白。
最初无细胞蛋白体系表达二硫键蛋白时遇到的两个障碍是，第一，还原剂如DTT通常加入体系中以保持细胞裂解液在储存和翻译过程中的活性；第二，缺乏活细胞内那样具有氧化还原条件的区室（如原核细胞中的细胞周质，真核细胞中的内质网）以供二硫键形成。
根据细胞裂解液的来源，采取了不同策略。
例如，大肠杆菌裂解液中添加入还原性和氧化型谷胱甘肽的混合物以建立合适的高氧化还原电位。
其他翻译系统主要采用烷基化试剂如碘乙酰胺对裂解液进行预培养以灭活内源性还原酶。
由于碘乙酰胺的使用可能会导致翻译活性的下降，因而发展了其它预处理方法如使用过量的氧化型谷胱甘肽。
进一步研究发现，加入外源性的酶，如真核蛋白二硫键异构酶（PDI），能够显著提高无细胞蛋白体系合成scFv片段的功能。
加入分子伴侣如DnaK，DnaJ,GroEL和GroES同样也是有益的，因为这些分子伴侣提高了无细胞蛋白表达系统合成的scFv和Fab的可溶性。
最成功的表达二硫键蛋白的大肠杆菌无细胞蛋白表达系统采取了多种策略共同使用的方法。
如，细胞裂解液由突变的大肠杆菌菌株制备，此菌株缺乏一种主要的内源性还原酶（Δ gor strain,KGK10）；细胞裂解液以碘乙酰胺和氧化及还原性谷胱甘肽预处理，建立氧化还原电位以适于二硫键形成。
并且，无细胞蛋白表达系统加入外源蛋白如二硫键异构酶C（DsbC）和PDI，促使二硫键的形成和异构化。
真核系统成功表达二硫键蛋白如tPA（1992年）使用的是兔网织红细胞体系，加入狗胰腺微粒体囊泡和氧化型谷胱甘肽。
随后，利用还原和氧化型谷胱甘肽和PDI，二硫键蛋白大肠杆菌碱性磷酸酶（两个二硫键）和人溶解酵素（四个二硫键）在昆虫系统也表达出来，并具有很好的功能。
然而，机体内蛋白的合成和折叠是在细胞的不同区域进行的，这就是所说的区室化现象，而前文中提到的各种策略就是试图在同一区室内（无细胞蛋白表达系统）完成蛋白的合成和折叠。
相反的是，在昆虫无细胞蛋白表达系统中，以草地贪夜蛾（Sf21）细胞裂解液为基础，目标蛋白合成后，能够进入另一个内源性区室中完成蛋白的折叠和翻译后修饰（如下图所示）。
这是由于昆虫的细胞裂解液包含有起源于内质网的内源性微粒体囊泡。
这些囊泡在细胞裂解液制备过程中形成，内质网破裂，重新组合形成多个较小的区室，成为微粒体囊泡。
如果目标蛋白与合适的信号肽融合，靶蛋白就可以进入这些囊泡的内腔。
因此，利用昆虫细胞的无细胞蛋白表达系统，膜蛋白可以合成并包埋入微粒体膜中。
这方面的研究已有很多报道。
原核无细胞蛋白表达系统表达抗体：
无细胞蛋白表达系统表达重组抗体乃至全长抗体的研究中，原核细胞是主要来源。
1997年，Ryabova和合作者一起发表了第一篇利用大肠杆菌无细胞蛋白表达体系合成scFv的详尽的报告，他们分析了不同添加剂对scFv的合成及其功能表现的效果。
在这篇报道里，PDI的加入将有功能的scFv的产量提高了三倍，而且，分子伴侣DnaK和DnaJ有效提高了可溶蛋白的量，但是并没有提高功能蛋白的量。
最后一点，各类添加剂的组合使用（还原和氧化型谷胱甘肽，PDI和分子伴侣）效果最好。
随后，其他一些研究小组陆续报道了大肠杆菌无细胞蛋白表达体系合成scFv的成功案例。
Jiang及其合作者于2002年报道了首例转录翻译偶联的大肠杆菌无细胞系统表达Fab的案例，并发现产量低的原因是内源性丝氨酸蛋白酶对靶蛋白的降解导致，他们随后采用缺乏丝氨酸蛋白酶的大肠杆菌突变体BW25113进行无细胞蛋白表达，解决了这一问题。
2008年全长IgG（鼠单克隆抗体MAK33）在大肠杆菌无细胞蛋白表达体系中的合成是一个里程碑意义的进展。
随后Yin等（2012）合成IgG1曲妥单抗以每升反应体系获得几百毫克的产量将前者超越。
很显然，无细胞蛋白表达体系可以将反应体系由毫升扩大到升，因此，Fab和全长抗体能够在标准的生物反应器（大至5L）以高产量（scFv~800ug/mL,Fab~250ug/mL,IgG~400ug/mL）进行合成。
2014年，利用大肠杆菌工程菌，使用分子伴侣优化的裂解液，全长抗体的合成进一步提高到每升反应液获得克级抗体的产量。
对于抗体合成，除了二硫键的形成，多个功能域蛋白的正确组装对于无细胞体系和细胞内的蛋白合成都是一个挑战。
由于密码子或者mRNA二级结构的因素，不同的模板以不同的速度进行翻译，因此对抗体重链和轻链比例的经验性优化是很重要的。
真核无细胞蛋白表达系统表达抗体：
1993年，兔网织红细胞来源的无细胞蛋白表达系统用来合成scFv-毒素融合蛋白。
除了大肠杆菌提取液，兔网织红细胞裂解液也是利用核糖体展示生产抗体片段的基本翻译系统。
2003年首例scFv抗体片段在麦胚来源的无细胞蛋白表达体系中合成。
发现用DTT缺乏的麦胚提取液加入PDI可获得最优的反应体系，1毫升batch系统中合成13ugscFv。
同年发展了基于昆虫sf21的真核翻译系统。
和其它真核系统相比，昆虫系统包含微粒体囊泡。
目标蛋白融合信号肽序列，可转运进微粒体囊泡进行蛋白的折叠，类似于体内环境。
2012-2014年间连续报道了两例成功利用昆虫无细胞蛋白表达系统合成功能scFv抗体片段的案例。
和其它成功表达二硫键蛋白的体系相比，昆虫系统只需要进行适当的优化即可：
除去还原性试剂DTT，加入谷胱甘肽，融合信号肽诱导靶蛋白转运进微粒体囊泡。
和其它体系相比，昆虫系统既不需要裂解液的预处理，也不需要加入其它外源性酶和分子伴侣。
无细胞蛋白表达系统对抗体的修饰：
蛋白与功能基团如荧光分子、亲和标签、药物分子等的连接在生物物理、生物技术和生物医学应用中具有特殊的意义。
例如，抗体-药物复合物有助于靶向癌细胞，降低药物副作用，提高治疗效果。
抗体与细胞因子或免疫刺激多肽连接可被用于疫苗（Kanter,2007）。
在这项研究里，利用无细胞蛋白表达体系合成的两个scFv融合蛋白成功用做抗鼠B细胞淋巴瘤的疫苗。
无细胞蛋白表达系统在生产个性化疫苗方面表现出了巨大潜力。
将来，我们可能能够利用PCR直接扩增病人自己的免疫球蛋白可变区段，生产个性化疫苗。
无细胞蛋白表达体系还可以为目标蛋白共表达并标记上一个或多个非必须氨基酸。
在这方面，体内不可避免的会有很多限制，特定修饰的氨基酸可能会表现出毒性或者根本不能进入细胞，体外的开放系统不受氨基酸类似物毒性的限制。
无细胞蛋白表达系统在抗体合成方面的发展很快。
从第一个scFv的全面报道到全长IgG分子的合成，间隔不到11年的时间。
在这样的发展速度下，相信对于目前仍然存在的问题，很快就会有解决方案。
浅述蛋白质分离纯化的新技术
摘要：
本文主要介绍了浊点萃取法、置换色谱法、亲和层析法、亲和色谱法、凝胶电泳、双水相萃取等蛋白质的最新分离纯化技术，综和近年来国内外的一些研究结果，结合实际应用的例子，分析了各种分离纯化方法的优点，同时指出其不足之处。
文章最后展望了蛋白质分离纯化技术的发展趋势。
关键词：
分离纯化蛋白质进展
生物技术的发展非常迅速，基因工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术，已经能设计、制造、生产人们急需的多种蛋白质。
和其它生物产品的生产过程一样蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。
上、中游过程是运用生物技术生产目标产物，下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、纯化、加工目标产物。
本文主要综和近年来国内外的研究结果，介绍了蛋白质的最新分离纯化技术。
2.蛋白质的分离纯化方法：
2.1浊点萃取法（CPE）：
2.1.1概念及原理：
浊点萃取法（cloudpointextraction，CPE）〔1〕是近年来出现的一种新兴的液—液萃取技术，它不使用挥发性有机溶剂，不影响环境。
它以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础，改变实验参数引发相分离，将疏水性物质与亲水性物质分离。
目前该法已成功地应用于金属螯合物、生物大分子的分离与纯化及环境样品的前处理中。
CPE法除了利用增溶作用外，还利用了表面活性剂另一个重要性质——浊点现象。
溶液静置一段时间（或离心）后会形成两个透明的液相：
一为表面活性剂相（约占总体积的5％）；另一为水相（胶束浓度等于CMC）。
外界条件（如温度）向相反方向变化，两相便消失，再次成为均一溶液。
溶解在溶液中的疏水性物质如膜蛋白，与表面活性剂的疏水基团结合，被萃取进表面活性剂相，亲水性物质留在水相，这种利用浊点现象使样品中疏水性物质与亲水性物质分离的萃取方法就是浊点萃取。
图1显示了由温度变化引发的这种相分离现象。
温度的改变，引起水化层的破坏，增强了表面活性剂的疏水性。
2.1.2蛋白质分离纯化中的应用：
CPE法可用于分离膜蛋白、酶、动物、植物和细菌的受体，还可以替代一些分离方法如硫酸铵分级法作为纯化蛋白的第一步，与色谱方法联用。
另外，CPE法分离纯化蛋白质已经可以实现大规模操作。
Minuth等人成功地进行了胆固醇氧化酶浊点萃取的中试研究。
虽然使用离心分离器可以使CPE大规模连续进行，但商品离心分离器用于CPE的效率和容量仍需进一步研究。
而且，他们发现相分离操作受细胞培养时产生的表面活性物质影响较大，体系两相间密度差较小，表面张力较小，含产物的表面活性剂相的流变学行为较复杂，操作较难。
表1列出了CPE法近几年来在蛋白质分离纯化中的应用。
（1）CPE法用于分离纯化膜蛋白
膜蛋白（内嵌膜蛋白、外围膜蛋白）硫水性强、难溶于水，抽提内嵌膜蛋白时，既要削弱它与膜脂的硫水性结合，又耍使它保持硫水基在外的天然状态，较难分离纯化。
由于表面活性刑具有两亲性，它一直作为腹蛋白理想的增溶剂。
增溶时，膜蛋白琉水部分嵌入胶束的硫水核中而与膜脱离，又保持了膜蛋白表面的废水结构。
相分离后，膜蛋白与表面活性剂共同析出，与亲水性蛋白质分离。
所以，CPE法在分离纯化膜蛋白方面极有优势。
（2）与其它分析技术的联用
CPE可以作为高效液相色谱（HPLC）、流动注射分析（FIA）、毛细管电泳（CE）等仪器分析的样品前处理方法，提高检出灵敏度。
表面活性别可以防止样品吸附在玻璃容器上，易于与FIA中的载液及HPLC中的有机流动相或胶束流动相混合，可以直接进样。
但是在很多应用中需要除去表面活性剂后再与仪器联用。
将萃取物与表面活性剂分离的方法很多。
对于CMC＞1mM的表面活性剂如两性离子表面活性剂可用透析法，但操作时间较长（24h左右）。
对于CMC较小的表面活性剂可通过色谱柱分离除去，如凝胶柱、毛纫管柱等，分离出的表面活性剂可以再利用，也可以作焚烧处理。
但CPE作为HPLC的样品前处理方法有两个缺点：
第一，常用的表面活性剂在UV区域有很强的背景吸收。
第二，操作时间较长，从色谱柱上需用几个小时洗脱表面活性剂。
表面活性剂的洗脱可能会干扰分析物的测定[3]。
2.2置换色谱法：
2.2.1概念及分离机理：
置换色谱（displacementchromatography）〔6〕作为一种非线性色谱技术，是指样品输入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的置换剂（displacer）通人色谱柱，去替代结合在固定相表面的溶质分子。
样品在置换剂的推动下沿色谱柱前进，使样品中各组分按作用力强弱的次序，形成一系列前后相邻的谱带，并在置换剂的推动下流出色谱柱[7]。
置换色谱的分离行为与样品组分和置换剂在实验条件下的吸附等湿线有直接的联系。
置换色谱要求样品组分及置换剂的吸附等湿线应为Langmuir型，而且置换剂相对于被分离的各组分应有最强的吸附能力，其吸附等温线位于所有组分的吸附等温线的上方[7]，见图1（A）。
根据物料平衡方程，置换剂在柱中的移动速度uD有下列关系：
式中uD为流动相的线速，ф为相比，qD和cD分别为置换剂在固定相和流动相中的浓度，qD／cD是直线OD的斜率，称之为操作线（operatingline）。
当操作线的斜率小于被分离组分等温线的起始斜率，样品才能进行置换展开，最终形成如图l（中的置换序列，这是在理想的情况下（假定无轴向扩散及二次化学平衡）获得的置换色谱图。
每一组分形成矩形的平台（Plateau）洗脱峰，相邻各组分的平台洗脱峰组成了一个台
状的色谱图。
此时，样品中不同的组分以置换剂的速度前进，即达到等速状态（isobathicconditions）：
uD＝u2；u3＝u4式中u2、u3、u4指被置换的三组分的速度
蛋白质特性与分离纯化技术的选择
摘要：
蛋白质的一级、二级、三级和四级结构决定了它的物理、化学、生物化学、物理化学和生物学性质，综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具有差异，利用一种同时多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择蛋白质提纯的方法。
关键词：
蛋白质分离纯化
前言
蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。
蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。
蛋白质提纯的总目标是设法增加制品纯度或比活性，对纯化的要求是以合理的效率、速度、收率和纯度，将需要蛋白质从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来，同时仍保留有这种多肽的生物学活性和化学完整性。
能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因，是不同的蛋白质在它们的许多物理、化学、物理化学和生物学性质有着极大的不同，这些性质是由于蛋白质的氨基酸的序列和数目不同造成的，连接在多肽主链上氨基酸残基可是荷正电的、荷负电的、极性的或非极性的、亲水的或疏水的，此外多肽可折叠成非常确定的二级结构（α螺旋、β折叠和各种转角）、三级结构和四级结构，形成独特的大小、形状和残基在蛋白质表面的分布状况，利用待分离的蛋白质与其它蛋白质之间在性质的差异，即能设计出一组合理的分级分离步骤。
可依据蛋白质不同性质与之相对应的方法将蛋白质混合物分离：
1．分子大小
不同种类的蛋白质在分子大小方面有一定的差别，可用一些简便的方法，使蛋白质混合物得到初步分离。
1．1透析和超滤
透析在纯化中极为常用，可除去盐类（脱盐及置换缓冲液）、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。
透析膜的截留分子量为5000左右，如分子量小于10000的酶液就有泄露的危险，在纯化中极为常用，可除去盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。
超滤一般用于浓缩和脱色
1．2离心分离置换缓冲液
许多酶富集于某一细胞器内，匀浆后离心得得到某一亚细胞成分，使酶富集10~20倍，再对特定的酶进行纯化。
差速离心，分辨率较低，仅适用于粗提或浓缩。
速率区带法，如离心时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳分离时间，可得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题，但容量较小，只能用于少量制备。
等密度梯度离心常用的离主介质有蔗糖、聚蔗糖、氯化铯、溴化钾、碘化钠等等
1．3凝胶过滤
这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一，注意使要离的蛋白质分子量落在凝胶的工作范围内。
选择不同的分子量凝胶可用于脱盐、置换缓冲液及利用分子量的差异除去热源。
2．形状
蛋白质在离心通过溶液运动时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时，都会受到形状的影响：
对两种相同质量的蛋白质而言，球状蛋白质具有较小的有效半径（斯托克半径），通过溶液沉降时遇到的摩擦力小，沉降较快而显得比其它形状的蛋白质大；反之，在体积排阻色谱时，斯托克半径较小的球状蛋白质更容易扩散进入凝胶过滤填料颗粒内部，较迟洗脱出来，因而显得比其它形状的蛋白质要小。
3．溶解度
利用蛋白质的溶解度的差别来分别各种蛋白质常用的方法。
影响蛋白质溶解度的外界因素很多，其中主要有：
溶液的pH、离子强度、介电常数和温度，但在同一的特定外界条件下，不同的蛋白质具有不同的溶解度。
适当改变外界条件，控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度
3．1pH控制和等电点沉淀
蛋白质在其等电点一般较不易溶解。
3．2蛋白质的盐溶和盐析
3．3有机溶剂分级法
蛋白质在不同的溶剂中的溶解度有很大不同，从基本不溶（＜10μg/ml）直至极易溶解（＞300mg/ml）不等。
影响蛋白质溶解度的可变因素包括温度、pH、溶剂的极性、离子性质和离子强度。
引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，故控制有机溶剂的浓度可分离蛋白质。
水溶性非离子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白质的沉淀。
3．4温度
不同的蛋白质在不同的温度具有不同的溶解度和活性。
大多数蛋白质在低温下比较稳定，故分离操作一般在0℃或更低温度下进行。
4．电荷
蛋白质净电荷取决于氨基酸残基所带的正负电荷的总和，如中性溶液中带净负电荷则称为酸性蛋白质，
4．1电泳
不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要手段，而且也是研究蛋白质性质很有用的方法。
等电聚焦分辨率很高，pI有0.02pH的差异就能分开。
2D-PAGE分离蛋白质分辨率已经发展到100000个蛋白点。
4．2离子交换层析
改变蛋白质混合物溶液中的盐离子强度、pH和（阴、阳）离子交换填料，不同蛋白质对不同的离子交换填料的吸附容量不同，蛋白质因吸附容量不同或不被吸附而分离。
洗脱可采用保持洗脱剂成分一直不变，也可采用改变洗脱剂的盐度或pH的方法洗脱，后一种可分分段洗脱和梯度洗脱。
梯度洗脱一般效果好，分辨率高，特别是使用交换容量小，对盐浓度敏感的离子交换剂，多用梯度洗脱。
控制洗脱剂的体积（与柱床体体积相比）、盐浓度和pH，样品组分能从离子交换柱上分别洗脱下来。
蛋白分子暴露在外表面的侧链基团的种类和数量不同，故在一定的PH值和离子强度的缓冲液的所带的电荷不同
5．电荷分布
电荷的氨基酸残基可均匀地分布于蛋白质的表面，既可以适当的强度与阳离子交换柱结合也能以适当强度与阴离子结合，因多数蛋白质都有不能在单一的溶剂条件下同时与两种类型的离子交换柱结合，故可得用此性质纯化；电荷的氨基酸残基亦可成簇分布，使某一区域带强正电荷而另一区域带强负电荷，呈强酸性或强碱性，只能在极端pH与阳离子交换树脂或阴离子交换树脂结合，如钙调蛋白只能在pH2时与阳离子交换树脂结合。
6．疏水性
多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些在表面。
蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的能力。
因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性，是一种通用性的分离和纯化蛋白质的工具。
高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱，故特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后的含有目标产品的溶液直接进样到柱上，当然也适用7mol/盐酸胍或8mol/L脲的大肠杆菌的治疗蛋白质提取液直接进样到柱上，在分离的同时也进行了复性。
7．密度
多数蛋白质的密度在1.3~1.4g/cm3之间，分级分离蛋白质时一般不常用此性质，不过对含有大量磷酸盐或脂质的蛋白质与一般蛋白质在密度上明显不同，可用密度梯度法离心与大部分蛋白质分离。
8．基因工程构建的纯化标记
通过改变cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。
8．1GST融合载体
使要表达的蛋白质和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用GlutathioneSepharose4B作亲和纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。
8．2蛋白A融合载体
使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgGSepharose纯化。
8．3含组氨酸标记（Histidine-tagged）ChelatingSepharose
最通行的标记之一，是在蛋白质的氨基端加上6~10个组氨酸，在一般或变性条件（如8M尿素）下借助它能与Ni2+螯合柱紧紧结合的能力，用咪唑洗脱，或将pH降至5.9使组氨酸充分质子化，不再与结合Ni2+使之得以纯化。
重组蛋白在设计、构建时已融入纯化构想。
样品多夹杂了破碎细胞或可溶产物，扩张床吸附技术STREAMLINE适合做粗分离。
9．亲和能力
结合效率高，分离速度快的特点。
配基可是酶的底物、抑制剂、辅因子、特异性的抗体、
吸附后可改变缓冲液的离子强度和PH的方法，洗耳恭听脱下来，也可用更高浓度的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液洗脱
亲和层析固定相的配基与生物分子之间的特殊的生物大分子亲和能力不同来进行相互分离的，依亲和选择性的高低分为：
基团性亲和层析，固定相上的配基对一类基团的极强的亲和力。
如含有糖基的一类蛋白质或糖蛋白对三嗪染料显示特别强的吸附能力；高选择性（专一性）亲和层析，配基仅对某一种蛋白质有特别强的亲和性。
如单克隆抗体对抗原的特异性的吸附。
亲和层析除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。
与超滤结合起来，将两者优点集中形成超滤亲和纯化，具有高分离效率和大规模工业化的优点，适用于初分离。
按配基的不同可分为：
（1）金属螯合介质
过渡金属离子Cu2＋、Zn2＋和Ni2＋等以亚胺络合物的形式键合到因定相上，由于这些金属离子与色氨酸、组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键，从而形成了亚胺金属—蛋白螯合物，使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱的固定相吸附。
螯合物的稳定性受单个组氨酸和半胱氨酸解离常数所控制，从而亦受流动相的pH和温度的影响，控制条件可以使不同蛋白质相互分离。
（2）小配体亲和介质
配体有精氨酸、苯甲酰胺、钙调因子、明胶、肝素和赖氨酸等等。
（3）抗体亲和介质
即免疫亲和层析，配体有重组蛋白A和重组蛋白G，但蛋白A比蛋白G专一，蛋白G能结合更多不同源的IgG。
（4）颜料亲和介质
染料层析的效果除主要取决于染料配基与酶的亲和力大小外，还与洗脱缓冲液的种类、离子强度、PH值及待分离的样品的纯度有关。
配体有CibacronBlue和ProcionRed两种。
在一定的条件下，固定化的染料能起阳离子交换剂的作用，为了避免此现象的发生，最好要离子强度小于0。
1和PH大于7时操作。
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