环境微生物综合性实验报告.docx
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环境微生物综合性实验报告
环境微生物综合性实验报告
官洲河段不同断面微生物群落分布的测定
见习类型
专业见习
院别
化学与环境学院
专业
环境工程
指导教师
成文老师
班级
2010级环境工程
姓名
翟锦亮
学 号
20102400132
2012年12月
目录
1.前言3
2.实验方案与思路3
3.实验方法3
3.1仪器3
3.2试剂4
3.3内容4
4.实验结果8
4.1水样观察8
4.2水样细菌总数的计算9
4.3水样菌落的培养观察9
4.4水样菌落数的计算11
4.5微生物个体菌种形态的观察12
5.实验分析13
5.1实验结果分析13
5.2实验存在问题14
5.3实验改进意见15
6.实验结论15
7.实验收获15
参考文献16
1.前言
微生物的群落结构与功能是微生物生态学的研究主题之一。
水体中微生物与区域环境有着密切的联系,其数量及种群分布与水的类型、有机物含量、微生物的拮抗作用等多种因素密切相关。
对它的研究将有助于了解水体的富营养现状及水域中C、N、P循环方式,并可为水体的整体治理方案提供依据[2]。
本实验将大学城官洲河段到入珠江段分为三个断面（对照断面，控制断面，消减断面），在同一天同一时间段对各断面水体的水样分别采样比较，测定水体中微生物的种类和数量，了解官洲河段不同断面的水体中存在的微生物的种类和数量，分析各断面中微生物群落的分布特点，了解各断面水体污染情况以及污染物对水体中微生物群落的影响。
2、实验方案与思路
2.1采样容器的洗涤和灭菌
2.2水样的采集
2.3水样微生物的观察
2.4培养基的制备
2.5微生物的纯种分离与培养
2.6微生物菌种的革兰氏染色
2.7微生物菌种的观察与鉴定
3.实验方法
3.1实验仪器
高压灭菌类：
培养皿（12个）、试管（9支）、移液管（3支，1mL）、高压蒸汽灭菌器、
锥形瓶（1个）
制备培养基类：
烧杯（1000mL）、药物天枰、玻璃棒、药匙、pH试纸、加热器、超净工作室、恒温培养箱
观察类：
显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、血球计数板、滴管、烧杯、
量筒（1个，10mL）
3.2实验试剂
肉膏胨淀粉培养基配方[1]：
牛肉膏3g，蛋白胨10g，淀粉2g，氯化钠5g,琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH：
7.4~7.8,。
灭菌条件：
0.101MPa（121oC，15~20min）。
革兰氏染色液一套：
草酸铵结晶染色液，革兰氏碘液，体积分数为95%的乙醇，番红染液
其他：
去离子水、无菌水
3.3实验内容
①实验器材的洗涤与灭菌【1】
将培养皿、试管、移液管用洗衣粉洗刷并用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗1—2次，然后用报纸包好放入高压蒸汽灭菌器中灭菌（121oC，相对蒸汽压力0.103MPa，15—20min），灭菌后放入无菌室备用。
②水样的采集
按下图所示分别到三个采样点进行采样。
采样时，应小心开启包装纸或瓶盖，避免瓶盖或瓶颈受到杂菌污染。
③水样的保存
为防止微生物发生质的改变,装好的样品瓶要在绝热箱中运送。
当外界温度较高时还要冷却,采样容器也不要受任何直接阳光照射,以免紫外线杀死微生物。
采好的水样应立即送往实验室,一般从取样到检验不宜超过两小时,否则应使用10oC以下的冷藏设备保存样品,但不得超过6小时,实验室接到送检样品后,应将样品立即放入冰箱,并在两小时内进行检验,如果因路途遥远,送检时间超过6小时,应考虑采用延迟培养法[4]。
④水样微生物的观察与计数
A.水样微生物的观察
（1）观察比较从三个断面（对照断面、控制断面、削减断面）取回来的水样，简单描述三个水样的外观特征。
（2）用压滴法分别制片观察三个断面的原水样水中微生物的种类、数量和形态。
*压滴法制片方法[1]：
如下图所示，取一片干净的载玻片放在实验台上，用滴管吸取样品于载玻片中央，用干净的盖玻片覆盖在液滴上（注意不要有气泡）即成标本片，用低倍镜和高倍镜观察，要充分利用显微镜的移片夹的移动，注意观察微生物组成。
B.水样细菌总数的测定【1】
（1）血球计数板的细胞计数
1）稀释：
将样品稀释至合适的浓度，一般将样品稀释至每一中格约有15~20个细胞数为宜。
本实验为了方便操作，故直接使用用于水样细菌稀释培养的稀释水样观察。
因此，水中微生物计数应该在水中微生物纯种分离之后，以防止污染稀释水样。
2）加被测水样至血球计数板：
取已洗净的血球计数板，将盖玻片盖住中央计数室，用细口滴管吸取少量已经充分摇匀的稀释水样于盖玻片的边缘，水样则自行渗入计数室，静止5~10min，待水样自然沉降并稳定后即可计数。
实验过程中，可根据各断面水样的外观初步判断取用的稀释倍数。
如控制断面的水样明显较浑浊，则应先选取1000倍的稀释液计数。
3）计数：
先用低倍镜寻找大方格网的位置，找到计数室后将其移至视野的中央，再换高倍镜观察和计数。
需不断地上、下旋动细调节轮，以便看到计数室内不同深度的菌体。
为了减少误差，所选的中格位置应布点均匀，如规格为25个中格的计数室，通常取4个角上的4个中格及中央的1个中格共5个中格进行计数。
当样品的细胞数较少时，应计算所有中格的细胞数。
（2）计算方法
结果计算：
先求得每中格菌数的平均值，乘以中格数（16或25），即为一大格（0.1mm3）中的总菌数，再乘以104，则为每毫升稀释液的总菌数。
如要换算成原液的总菌数，乘以稀释倍数即可。
两种不同规格的血球计数板的计算方法如下：
①16×25的计数板计算公式：
细胞数（mL）＝（100小格内的细胞数/100）×400×10000×稀释倍数
②25×16的计数板计算公式：
细胞数（mL）＝（80小格内的细胞数/80）×400×10000×稀释倍数
④培养基的制备
a.成分：
牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15-20g，淀粉2g，蒸馏水1000ml。
b.方法：
取牛肉膏0.5g，加水100ml，再加入蛋白胨、氯化钠、加热使之完全溶解，调整pH值至7.2～7.4，分装，高压灭菌后备用。
c.向灭菌后冷却至50—60oC的培养皿倒入一定量的灭菌后的溶液，将培养皿放置于无菌室冷却备用。
⑤水样微生物的纯种分离与培养
水样稀释
取一个试管架，将9支高压灭菌过的试管依次摆好，分别贴上标签：
水样断面+稀释倍数。
在无菌操作条件下，用“十倍稀释法”【1】将三个水样分别稀释10、100、1000倍。
稀释时，先在无菌试管中加入9mL无菌水，然后用无菌移液管移取1mL原水样于试管中，将移液管吹洗3次，塞上橡皮塞摇匀，即为10-1浓度的水样；用1mL移液管吸取1mL10-1浓度的水样于9mL无菌水中，将移液管吹洗3次，摇匀，即为10-2浓度的水样；同理稀释得到浓度为10-3的水样；注意，每个水样只用一根移液管。
稀释过程如图所示。
水样微生物的培养
在超净工作室中，用1mL无菌移液管按从低浓度到高浓度的顺序分别移取1mL稀释倍数为1000倍、100倍、10倍以及原水样4个水样于制备好的培养基上，按“水样断面+稀释倍数”的格式贴上标签，然后将培养皿平放在桌上，顺时针和反时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于37oC的恒温培养箱中恒温培养24—48h，然后观察结果。
⑥微生物菌种的革兰氏染色
通过涂片染色观察微生物个体形态。
用接种环按号码顺序选择几种细菌（单菌落）做涂片，进行革兰氏染色，并作镜检，确定其革兰氏染色反应，并绘出其形态图。
由于只做一次分离实验，得到的单菌落可能还不太纯，镜检时会出现多种形态。
a.涂片、固定
干燥过程最好在空气中自然晾干，为了加速干燥，也可在微小火焰上方烘干。
烘干后再在火焰上方快速通过3~4次，使菌体完全固定在载玻片上。
但不宜在高温上长时间烤干，否则急速失去会使菌体变形。
b.初染
滴加草酸铵结晶染色液染色1~2min，水洗。
c.媒染
滴加革兰氏碘液，染1~2min，水洗。
d.脱色
滴加体积分数为95%的乙醇，约45s后即水洗；或滴加体积分数为95%的乙醇后将玻片摇晃几下即倾出乙醇，如此重复2~3次后即水洗。
e.复染
滴加沙黄液（番红），染2~3min，水洗并使之干燥。
⑦微生物菌种的观察与鉴定
观察菌落的大小、形状、表面结构、隆起度、边缘结构、菌从高度、表面性状、颜色、透明度、气味、质地软硬情况、表面光滑与粗糙情况和干湿度等综合情况。
将上述步骤染色的微生物按显微镜的操作步骤观察菌体形态，及时记录，并进行形态图的绘制。
4、实验结果
4.1水样观察
（1）对照断面（小洲村）：
水样较清，无色透明；用显微镜观察，可观察到很多藻类，藻类种类不多，体积比较大，以圆形藻，球形藻为主。
（2）控制断面（中大）：
水样呈浅绿色，可明显观察到有绿色丝状悬浮生物；用显微镜观察，可观察到很多不同种类的藻类；藻类的体积普遍比较小，形状有长杆状、链球状等。
（3）削减断面（商业北区）：
水样无色，有轻微白色浑浊；用显微镜观察，可观察到藻类；藻类的种类不多，体积较大，以线状发散生长的藻类为主。
4.2水样细菌总数的计算
水样来源
中格1（个）
中格2（个）
中格3（个）
中格4（个）
中格5（个）
平均值（个）
总数（个/mL）
对照断面（小洲）（稀释10倍）
20
12
25
29
21
22
5.5×107
控制断面（中大）（稀释1000倍）
26
42
27
58
19
35
8.75×109
削减断面（商业北区）（稀释100倍）
27
36
33
22
29
30
7.5×108
小结：
各断面细菌总数关系：
控制断面>削减断面>对照断面，说明水体污染程度越高，细菌总数越多。
4.3水样菌落培养观察
（1）对照断面（小洲村）：
水样菌落培养基照片:
说明：
由于倒平板时水样扩散不均匀，所以恒温培养时培养基分离出来的菌落大多呈片状生长，分离出来的纯种菌落数目较少。
4个培养基都有一定的臭味，以原水样培养基的臭味最浓；不同稀释浓度分离出的纯种菌落差异不大，下面挑选一些特征比较明显的菌落描述：
特征
编号
菌落大小
菌落形状
菌落颜色
边缘特征
纵剖面特征
表面（粗糙/光滑）
菌落一
中等
粒状成团
乳黄色
不规则
边缘波浪
粗糙
菌落二
较大
半球形
乳黄色
规则，圆滑
边缘圆滑，高突起
光滑
（2）控制断面（中大）：
水样菌落培养基照片:
说明：
4个培养基都有一定的臭味，以原水样培养基的臭味最浓。
由于水样扩散不均，原水样和10倍稀释度的水样菌落呈片状生长，没有分理出纯种菌落。
100倍和1000倍稀释度的水样分离出的纯种菌落种类比较多，大小差异也比较大，下面挑选一些特征比较明显的菌落描述：
特征
编号
菌落大小
菌落形状
菌落颜色
边缘特征
纵剖面特征
表面（粗糙/光滑）
菌落一
较大
针状成团
乳黄色
不规则
有小突起
粗糙
菌落二
较大
半球状
乳黄色
规则
隆起
光滑
菌落三
较小
球状
黄色透明
规则
隆起
光滑
菌落四
较小
球状
白色
规则
隆起
光滑
（3）削减断面（商业北区）：
水样菌落培养基照片:
说明：
本组培养基的水样培养的比较好，有明显的纯种菌落独立分离出来。
4个培养基都有一定的臭味，以原水样培养基的臭味最浓。
随着稀释倍数的增大，培养基上的菌落数目也不断增加，各菌落的差异性也比较大，下面挑选一些特征比较明显的菌落描述：
特征
编号
菌落大小
菌落形状
菌落颜色
边缘特征
纵剖面特征
表面（粗糙/光滑）
其他
菌落一
较大
圆形
白色
规则
扁平
光滑
/
菌落二
较大
圆形
黄色
规则
扁平
光滑
中间有下凹点，枚红色
菌落三
中等
球状
乳黄色
规则
隆起
光滑
/
菌落三
较小
球状
黄色
规则
隆起
光滑
中间有一个枚红色的下凹点
4.4水样菌落数的计算：
不同稀释倍数的菌落数/个
菌落总数/（CFU/mL）
报告方式/（CFU/mL）
10倍
100倍
1000倍
对照断面（小洲）
无法计算
32
无法计算
3200
3.2×103
控制断面（中大）
无法计算
无法计算
186
186000
1.9×105
削减断面（商业北区）
无法计算
114
30
20700
2.1×104
小结：
随着断面污染程度的增加，培养基的菌落数目也随之增多。
说明水体污染程度在一定程度上影响了水中微生物的数量与种类。
4.5微生物个体菌种形态的观察
在三个水样的培养基中分别选出3个纯种菌落进行革兰氏染色观察，结果如下表所示：
（1）对照断面（小洲）：
细菌形态
细菌颜色
G+/G-细菌
图片
菌落一
链杆状
紫红色
革兰氏阴性
菌落二
圆形
紫蓝色
革兰氏阳性
菌落三
圆形
紫红色
革兰氏阴性
（2）控制断面（中大）：
细菌形态
细菌颜色
G+/G-细菌
图片
菌落一
长杆状
紫红色
革兰氏阴性
菌落二
圆形
紫蓝色
革兰氏阳性
菌落三
/
紫蓝色
革兰氏阳性
（3）削减断面（商业北区）：
细菌形态
细菌颜色
G+/G-细菌
图片
菌落一
短杆状
紫蓝色
革兰氏阳性
菌落三
/
紫蓝色
革兰氏阳性
5.实验分析
5.1实验结果分析
各断面的水体污染程度不同，其外观、微生物种类与数量、细菌总数、菌落种类与数量等各种参数都有明显的差异。
从实验结果可见，控制断面的水体由于污染源来源最多，污染程度最深，因此各参数也最高；对照断面的水体污染程度最轻，因此各参数最低；削减断面由于河流本身的自净作用以及污染物的扩散减少，相对污染程度比控制断面低，各参数较之控制断面都明显降低。
（1）查看资料可知,线虫是水体净化程度差的指示生物；钟虫、轮虫、苔藓虫都要求较高的溶解氧量，是污水生物处理效果好的指示生物；而胞囊是原生动物抵抗不良环境的休眠体。
通过对水样的观察，发现三种水样中的原生动物种类都差不多，无法通过原生动物的种类看出三种水样分别位于河流的哪一个位置。
（2）同一水样，不同稀释倍数所培养的细菌种类各异，大小各异。
虽随着稀释倍数的增加，菌落种类有减少，但无规律变化，菌落总数无较大区别。
不同水样，细菌总数有明显的差异，所培养的菌落总数稍有差异，菌落种类也各有差异，水样三最多，水样二次之，水样三最少，但最后经染色观察，不同水样中的微生物形态无较大差异。
造成的原因可能是水样不具代表性，或是实验操作不当，具体叙述如下。
5.2实验存在问题
（1）水样采集：
由于实验条件有限，因此各断面水样只能在岸边水面采集，采样地点位置不精准，因此水样代表性不够高。
（2）水样观察：
由于水样是水面采集，所以在显微镜下观察到的微生物只有一些藻类，水体中比较常见的一些微生物无法看到。
（3）细菌总数：
由于水样不均匀，进行水体细菌总数计算时，往往会有一些沉淀、大颗粒干扰试验观察计数。
（4）微生物培养：
稀释水样时没有使用灭菌的无菌水，直接使用去离子水，破坏了无菌环境，给实验带来了较大误差。
而且培养基恒温培养时，没有倒置培养基，导致大部分培养基出现积水问题，没能分离出纯种菌落。
（5）革兰氏染色：
部分菌种在革兰氏染色时不够均匀，无法看出菌种的具体形态。
而且当脱色不完全时，整个视野都呈紫色，连细菌也找不到。
（6）菌落种类和特征：
三个断面的水体污染程度不同，理论上培养出来的菌落种类以及数量应该有明显的差别。
但是由于实验操作比较粗糙，所以三个水样培养出的菌落形态并没有明显的区别，而且革兰氏染色时观察到的细菌形态也没有明显的差别。
5.3实验改进意见
（1）改善取水条件，增加设备采样。
（2）显微镜观察前充分摇匀水样，以便观察结果更具代表性。
（3）提高无菌操作精度，使用无菌水作稀释水。
（4）恒温培养要严格倒置培养基，因此要等水样在培养基上风干再倒置在培养箱培养。
（5）革兰氏染色要严格按步骤执行，每次脱色要完全，使每个涂片可以清晰分辨细菌形态颜色。
6.实验结论
本实验对官洲河段三个断面的水体进行分析比较，从实验结果可知，水体污染程度：
控制断面>削减断面>对照断面。
同时，随着污染程度的不同，各水体的微生物群落分布也有差异，表现在微生物种类与数目、细菌总数以及菌落数目随着污染程度的加深而增加。
由此可见，污染物对于微生物的繁殖和分布有着重要的影响，污染越严重，污染物越多，给微生物提供了生长和繁殖的营养来源，使微生物得以大量繁殖和分布。
因此，在实际应用中，可以根据水体中微生物群落的种群及数量简单判别水体污染程度。
而根据不同污染程度水体微生物群落的差别，可以选取一些各断面有代表性的微生物作为指标。
7.实验体会
之前对知识的认知，只是停留在书本上。
经过本次试验后，对树上内容的认知不再停留在书本上，而是在脑海里的记忆里，在我们需要的时候可以提取出来。
这一次实验，让我们接触到了具体化的理论知识，提升了我的分析能力和操作能力。
在进行本次综合实验的过程中，遇到了许多外部和内部的困难，但是我们小组终究较为完满地完成了实验。
通过这一次实验，虽然我们做出来的结果还有很多纰漏，许多实验过程需要改进，但是这次实验提高了我们的动手能力，培养了我们去发现问题、分析问题和处理实验中各种问题的能力，更重要的是培养了我们的创新意识和创新能力。
这对于我们将来从事相关工作积累了经验，有着莫大的帮助。
总体上说，我们的实验还是完整的。
希望以后多一些这样的动手机会，让我们在实践中自行掌握。
参考文献
[1]周群英,王士芬.环境工程微生物学[M].第3版.北京:
高等教育出版社,2008
[2]吴根福,宣晓冬,汪富三.杭州西湖水体中微生物生理群生态分布的初步研究[J].生态学报,1999,19（3）:
435-440
[3]陈绍铭,郑福寿.水生生物学实验法.北京:
海洋出版社,1985.
[4]刘红霞,王祥峰,韩金枝.水中细菌测定方法研究[J].福建分析测试,2006,15（4）:
41-42.
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