还原酶选择性剪接新亚型的鉴定和分析.docx

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还原酶选择性剪接新亚型的鉴定和分析

还原酶选择性剪接新亚型的鉴定和分析

还原酶选择性剪接新亚型的鉴定和分析第23卷第3期

2010

汕头大学医学院

JournalofShantouUnivemtyMedicaleV01.23No.3

20lO

人肝癌细胞辅酶?

.依赖性视黄醇脱氢/还原酶选择性剪接新亚型的

鉴定和分析

钱程,刘婷,闰银侠,宋旭红,黄东阳

（汕头大学医学院细胞生物学教研室,广东汕头515041）

[摘要]目的:

鉴定人肝癌细胞HepG2中辅酶?

.依赖性视黄醇脱氢/还原酶（NRDR）的选择性剪接新亚型DHRS4L1A1,并检

测其在不同细胞中的表达情况.方法:

采用快速eDNA末端扩增方法,从HepG2中克隆选择性剪接亚型的eDNA序列;通过

查找开放阅读框架,预测并分析剪接新亚型的蛋白质序列和功能;用半定量RT-PCR法检测8种不同细胞株中新剪接亚型

的相对表达量.结果:

DHRS4L1AI全长1ll7bp,为NRDR选择性剪接新亚型;该亚型在卵巢癌细胞SKOV3中的表达量显

着高于其他细胞.结论:

DHRS4L1A1表达的蛋白属于SDR家族,该亚型可能参与生殖系统相关酶类的代谢.

[关键词]NAOP（H）.依赖性视黄醇脱氢/还原酶;选择性剪接;HepG2细胞

[中图分类号]Q493.6[文献标识码]A[文章编号]l（X）7.4716（2010）03.0138.04IdentificationandAnalysisofaNovelAlternativelySplicedVariantof

NADP（H）-dependentRetinolDehydrogenase/ReductaseinHepG2Cell

QtANCheng,LIUTing,YANYin—xia,SONGXu—hong,HUANGDong-yang（DepartmentofCelluarBiology,Shar~u如哪MedicalCollege,Slmntou515041,Ctdna）

[Abstract]Objective:

Toidentit~,NADP（H）一

dependentretinoldehydrogenase/reductase（NRDR）alternativelysplicedvariants,andtodetecttheexpressionleve1ofthisahemativelysplicingvariantindifferentcelllines.Methods:

Rapid

amplificationofcDNAends（RACE）.RT-PCRWaSusedtoclone山

efulllengthjnHepG2celllineanddetecttheeX—

pressionindifferentcelllines.Theaminoacidsequenceofthetranslatedproteinofthissplicingvm-iantwaspredicted

andanalyzedbysearchingopenreadingfrmne.Results:

Thefull—

lengthofDHRS4L1A1was1117bp.DHRS4L1A1

proteinconservedn1eeoenzymebindingmotifsofSDRfamilyatNterminus,substratebindingmotifsatCterminus,and

pemxisome-targetingsigna1.ItsexpressioninovariancancercelllineSKOV3WaSsignificantlyhigherthanothercells.

Conclusion:

ThetranslatedproteinofDHRS4L1A1belongstotheSDRfamily,ithadcloserelationshipwithmetabolic

pathwaysofreproductivesystem.

[KeyWords]NADP（H）一

dependentretinoldehydrogenase/reductase,altemativelysplicedvariant,HepG2cel1人辅酶?

依赖性视黄醇脱氢/还原酶（NRDR,

GenBank登录号AB045131）是一种新的维甲酸（RA）

代谢酶.NRDR在生理条件下表现出较已知的短链

脱氢酶（SDR）家族其他成员更强的RA还原活

性【lj.故在维持内环境RA及视黄醇的稳定状态

中发挥重要作用.Genebank中登陆号为AB045131

的cDNA被认为是NRDR的编码基因（称DHRS4）.

人DHRS4基因簇有3个基因拷贝（DHRS4（GenelD:

10901）,DHRS4L2（DHRS4like2,GeneID:

317749）

和DHRS4LI（DHRS4likel,GenelD:

728635））,串

联排列于人类基因组14ql1.2.本课题组在人肝正常及多种肿瘤细胞中,发现了DHRS4和DHRSL2基因的1O余种mRNA选择性剪接亚型,并在人宫?

138?

颈癌细胞中发现了不同亚型蛋白在细胞内的定位改变,提示这些选择性剪接亚型可能通过影响RA的合成,参与细胞内的信号传导,细胞增殖分化,并与肿瘤的发生,发展密切相关【4J,选择性剪接可能在NRDR功能调控上有重要作用.本研究在HepG2细胞中克隆并鉴定了--aat~新的NRDR选择性剪接亚型,对其可能编码的蛋白质序列进行分析,并对新亚型在正常人肝脏和其它几种肿瘤细胞中mRNA表收稿日期:

2010—0l一26

基金项目:

国家自然科学基金资助项目（30970626）作者简介:

钱程（1983一）.男.湖北省武汉市人,汕头大学医学院在读硕士生.

通信作者:

黄东阳E-umil:

huangdy@

箜翅垡墨笠:

旺瘪塑堕酸?

:

塑性视黄醇脱氢/还原酶选择性剪接新亚型的鉴定和

分析

达情况进行了检测,研究结果将为深入研究新亚型的功能提供实验依据.

l材料与方法

1.1细胞株,试剂及仪器

Hela,HepG2,HL7702,M17,BEL7402细胞株

（上海生物学细胞研究所,中国）,HOS,EC109细胞株（中国医学科学院细胞中心,中国）.RP—

MI1640,DMEM,FI2培养基,胎牛血清（GIBCO公司,美国）.Trizol试剂（Invitrogen公司,美国）,QuantscriptRTMix,2XTaqPCRMasterMix（Tiangen

公司,中国）,DNALadder（NewEnglandBiolabs公司,美国）,3RACE试剂盒（TakaRa公司,日本）,DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒,T4连接酶,pGEM.TEasy载体（Promega公司,美国）.

1.2方法

1.2.1总RNA提取及纯度鉴定各种细胞总RNA提取按riftzol试剂说明完成,紫外分光光度计对所提取的RNA进行纯度鉴定和定量.

1.2.23.RACE按试剂盒说明,以2g总RNA

为模板,用3RACEAdaptor引物进行反转录反应,合成1stStrandcDNA,反应条件42qC,60nfin;70?

.15min.反应结束后进行巢式PCR,用3.

RACE外侧引物:

5nCC.GTCGTrCCACTACT.GATIT-3和上游外侧NRDR特异性引物GSP1:

5.A1?

CAcAAGCCGGGCCIGCTAG-3,进行第一轮PC反应;用3一RACE内侧引物:

5一CGCGGATCCTC.CACTACrI?

A,兀I?

ACnTAGG.3和上游内侧NRDR特异性引物GSP2:

5GCCI'CQCCGACGGGATCGG.3,

进行第二轮PCR反应,2次PCR反应条件均为:

94?

3Injn;94?

30s,55?

30s,72?

2min,30个循环;72qc,10min,以此获得3末端.

1.2.3DGEM.TEasy重组体的构建及DNA片段克隆将3RACE法扩增得到的PCR产物经质量分数1.5%的琼脂糖凝胶电泳,用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA片段,用T_A克隆法将其克隆至pGEM—TEasy质粒载体,转化入JM109感受态大肠杆菌,在含氨苄青霉素,IPTG和X—Gal的LB平皿上涂菌,37?

培养18h以上,进行蓝白筛选,挑

选白色菌落进行菌落PCR,鉴定是否插入目的片

段,菌落PCR引物为T7:

5一TAATACGACTCAC—TATAGGG-3,SP6:

5.TATITAGGTGACACTATAG一3,菌落PCR反应条件为:

94?

3min;94?

30s,55oC,30s,72oC,30s,25个循环;72?

10min.将含有目的片段的阳性克隆进行测序分析.

1.2.4生物信息学方法序列分析用NCBIBLAST及Jellyfish软件比对新发现的DHRS4L1选择性剪接亚型序列,查找开放阅读框架,推测其蛋白质序列,与NCBI网站中DHRS4,DHRS4L1基因参考蛋白序列相对比,分析该蛋白质可能具有的功能.1.2.5cDNA合成及半定量PCR分别取HepG2,HL7702,BEL7402,HOS,Hela,EC109,M17SK-

OV一3细胞总RNA1,在QuitReverseTranscrip

tase作用下反转录合成cDNA第一链.针对

41选择性剪切亚型e1.e2一insertion—e8.e9.el0,跨外显子e2和insertion设计上游引物:

5.CACAGT—GAGC11CCAGGGAAATG..3,在外显子e8上设计下游弓』物:

5'-ACTGACA,I'IGTAAGGACTGAAGCC.3.扩增片段长度125bp.采用CAPDH作为内参基因.上游引物:

5一GCACCGTCAAGGCTGAGAAC.3,下游引物:

5'-TGGTGAAGACGCCAC,I?

GA.3,扩增片段长度138bp.PCR反应条件均为:

94?

3min;94?

30S,60?

30s,72?

30s,30个循环;72

?

10rnin.PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色,用凝胶成像系统扫描分析电泳条带的光密度值,目的条带光密度值与内参条带光密度值之比值为相对表达量.

2结果

2.1总RNA提取

在培养的HepG2中提取总RNA,琼脂糖凝胶

电泳结果见图1,可见清晰的l8S和28SrRNA条带,且28S:

18S约为2:

1.紫外分光光度计测得C（RNA）=I.146f』L,D26o/D2so=1.9238.Ml

图ltlepG2中总Pd'qA电泳图

Fig.1AgamsegelelectmphoresisoftotalRNAinHepG2cell

第3期钱程等.人肝癌细胞辅酶?

.依赖性视黄醇脱氢/还原酶选择性剪接新亚型的

鉴定和分析

2.23一RACE法扩增得到3末端cDNA序列

经逆转录和巢式PCR扩增后琼脂糖电泳结果

显示单一条带（图2）长度约为1000bp,常规克隆,菌落PCR鉴定（图3）,Lanel和Lane2对应的克隆送测序公司测序.

M1

图2DHRS4L1A13RACE产物

Fig.2DHRS4LIA13RACEproduct（LaneM100bpDNAla'ldcr

lane13RACEproduct1003bp）54321M

图3DHRS4L1Al菌落PCR

Fig.3TheresultofcolonyPCRofDHRS4L1A1（Lane5Negative

contro1）

2.3eDNA序列分析

经BLAST比较发现,该eDNA序列与

DHRS4L1基因高度同源,命名为DHRS4L1A1.经JeUsh软件对其阅读框架进行分析,结果发现编码区的起始密码子位于1—3bp,终止密码子位于697—699bp.其可读框架在1—699bp之间（图3）,

共699bp,3非编码区在700,1107bp之间,多聚腺苷酸信号aataaa位于1073,1078bp.图4DHRS4L1A1编码的蛋白质

Fig.4DeducedproteinsequenceofDHRS4L1A1

?

140?

2.4DHRS4L1基因与DHRS4L1Al外显子组成分析

DHRS4L1基因共有10个外显子,而人

DHRS4LIAl由选择性剪接造成了第3,7外显子丢失,并有第2,3外显子之间一段长度为85bp内含子序列保留,结构为e1.e2.Insertion.e8.e9一el0（图5）.

DHRM-厂百口一?

r口口口口口]|II_图5人DHRS4L1A1选择性剪接亚型的外显子剪接组成图Fig.5ExonscompositionofhumanDHRS4L1A1anditsaltema-

tivesplicingvariant2.4.3DHRS4L1A1编码蛋白质的序列分析

DHRS4基因簇中,DHRS4是NRDR的编码基因,NRDR属于一种SDR,含有SDR家族2个（TAXXXGXG与YxXSK）保守的模序,并具有过氧化物酶体定位信号SRL.DHRS4L1编码的蛋白由282个氨基酸组成,具有YXXSK模序及SRL.DHRS4L1A1cDNA编码的蛋白由232个氨基酸组成,具有TAXXxCxG与YXXSK模序及SRL（图6）.DHRS4

DHRS4L】

DHRS4L1Al

Consensus

klhgidilvsngfeewdIdinkaaimkavvpeme

1912012ll221231

图6人DHRS4,DHRS4L1及DHRS4L1A1的蛋自质序列比较结果

Fig.6Multipleproteinsequencesali/pamentofhumanDHRS4,

DHRS4L1andDHRS4L1A1

2.5DHRS4L1A1mRNA在各种细胞中的表达情况

对8种细胞株进行RT-PCR,并且以H作

为内参,结果显示,DHRS4L1A1在正常肝,肝癌,

骨肉瘤和卵巢癌细胞中均有表达,但在神经母细胞

瘤和食管癌细胞中未检测到其表达.在SKOV3中

的表达量显着高于其他细胞（图7,表1）,提示该

剪接亚型有可能参与生殖系统相关酶类的代谢.

坠一一

翅丛猩笠!

厶旦王疸绁堕塑酶:

塑丝塑董醒氢厦酶选择性剪接新亚型的鉴定200bp

100bp

200bp

100bp

图7DHRS4L1A1在不同细胞中的表达情况

Fig.711leexpressionsofDHRS4L1A1mRNAindifferentcell

lines

LaneMDNAladder'LanelHL7702L丑ne2

BELT402'Iane3HepG2Lane4HosLane5HelaLan05EC109Lane'/M17,nne8SK-Ov-3

表1不同细胞中DHRS4L1A1rIlIA的相对表达量

1.ab】e1'II~eexpressionsofD忍兄S4L1A1mRNAindifferentcell

lines

3讨论

从结构上讲,NRDR属于一种SDR[5J.SDR家族在功能上复杂多样,且常是一种具有多种功能的酶.现已发现60个以上的家族成员,尽管成员间的氨基酸的一致性仅10%一30%,但共同点是:

有2个SDR家族保守模序,一个是辅酶结合模序TAXXXGXG,与辅酶NAD（H）或NADP（H）的结合有关.还有相当一部分SDR家族成员包括NRDR有YXXSK模序,被认为是底物结合区域的一部分【6J.本研究中.我们使用NRDR的特异引物,用3RACE法,克隆了人DHRS4L1A1的3末端cDNA序列,获得DHRS4L1基因的选择性剪接新亚型DHRS4L1A1.该亚型在3845位氨基酸保留了辅酶结合模序,在136,140位氨基酸保留了底物结合区.人,小鼠,兔,大鼠和猪的NRDRC.末端的3个氨基酸均为SRL,被认为是过氧化物酶体的靶向信号（PTSI）,DHRS4L1A1编码蛋白质的C一末端具有SRL.从结构上说,它具备了SDR家族的特征,提示人DHRS4L1A1编码的蛋白也应该属于SDR家族.

本研究在肝癌HepG2中发现的NRDR新选择性剪接亚型,其在正常肝细胞和其他多种肿瘤细胞中都有表达,但在神经母细胞瘤和食管癌细胞中未见表达,提示该亚型的表达具有组织性差异,并且我们还发现新亚型DHRS4L1A1在SKOV3细胞中的表达量远高于其它细胞,提示该亚型有可能参与生殖系统相关酶类的代谢.

选择性剪接是真核生物的一个重要的转录调节方式.40%,60%的人类基因具有选择性剪接的亚型,为人类基因组功能复杂性的原因之一.选择性

剪接被认为和多种疾病发生和发展尤其是肿瘤疾病

密切相关[.NRDR基因的第1个clusterDHRS4也

被证实有众多的选择性剪接方式.同时,有研究显

示肿瘤组织中的选择性剪接亚型的数量显着高于正

常组织,提示异常的选择性剪接与肿瘤发生相关.

因此,选择性剪接在作为一种增加蛋白多样性的方

式的同时也为肿瘤的发生提供了机会.本研究在

HepG2中克隆了一个DHRS4L1A1亚型,进一步证

实了选择性剪接在调控NRDR（DHRS4）基因功能和

增加基因产物多样性方面的重要作用,但这些亚型

究竟是正常还是异常的剪接现象以及它们的确切功

能等问题还有待进一步深入研究.

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