还原酶选择性剪接新亚型的鉴定和分析.docx

1、还原酶选择性剪接新亚型的鉴定和分析还原酶选择性剪接新亚型的鉴定和分析还原酶选择性剪接新亚型的鉴定和分析 第23卷第3期 2010 汕头大学医学院 JournalofShantouUnivemtyMedicale V01.23No.3 20lO 人肝癌细胞辅酶?.依赖性视黄醇脱氢/还原酶选择性剪接新亚型的 鉴定和分析 钱程,刘婷,闰银侠,宋旭红,黄东阳 (汕头大学医学院细胞生物学教研室,广东汕头515041) 摘要目的:鉴定人肝癌细胞HepG2中辅酶?.依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)的选择性剪接新亚型DHRS4L1A1,并检 测其在不同细胞中的表达情况.方法:采用快速eDNA末端扩增方法,

2、从HepG2中克隆选择性剪接亚型的eDNA序列;通过 查找开放阅读框架,预测并分析剪接新亚型的蛋白质序列和功能;用半定量RT-PCR法检测8种不同细胞株中新剪接亚型 的相对表达量.结果:DHRS4L1AI全长1ll7bp,为NRDR选择性剪接新亚型;该亚型在卵巢癌细胞SKOV3中的表达量显 着高于其他细胞.结论:DHRS4L1A1表达的蛋白属于SDR家族,该亚型可能参与生殖系统相关酶类的代谢. 关键词NAOP(H).依赖性视黄醇脱氢/还原酶;选择性剪接;HepG2细胞 中图分类号Q493.6文献标识码A文章编号l(X)7.4716(2010)03.0138.04 Identificationa

3、ndAnalysisofaNovelAlternativelySplicedVariantof NADP(H)-dependentRetinolDehydrogenase/ReductaseinHepG2Cell QtANCheng,LIUTing,YANYinxia,SONGXuhong,HUANGDong-yang (DepartmentofCelluarBiology,Sharu如哪MedicalCollege,Slmntou515041,Ctdna) AbstractObjective:Toidentit,NADP(H)一dependentretinoldehydrogenase/re

4、ductase(NRDR)alternativelyspliced variants,andtodetecttheexpressionleve1ofthisahemativelysplicingvariantindifferentcelllines.Methods:Rapid amplificationofcDNAends(RACE).RT-PCRWaSusedtoclone山efulllengthjnHepG2celllineanddetecttheeX pressionindifferentcelllines.Theaminoacidsequenceofthetranslatedprote

5、inofthissplicingvm-iantwaspredicted andanalyzedbysearchingopenreadingfrmne.Results:ThefulllengthofDHRS4L1A1was1117bp.DHRS4L1A1 proteinconservedn1eeoenzymebindingmotifsofSDRfamilyatNterminus,substratebindingmotifsatCterminus,and pemxisome-targetingsigna1.ItsexpressioninovariancancercelllineSKOV3WaSsi

6、gnificantlyhigherthanothercells. Conclusion:ThetranslatedproteinofDHRS4L1A1belongstotheSDRfamily,ithadcloserelationshipwithmetabolic pathwaysofreproductivesystem. KeyWordsNADP(H)一dependentretinoldehydrogenase/reductase,altemativelysplicedvariant,HepG2cel1 人辅酶?依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR, GenBank登录号AB045131)是一

7、种新的维甲酸(RA) 代谢酶.NRDR在生理条件下表现出较已知的短链 脱氢酶(SDR)家族其他成员更强的RA还原活 性【lj.故在维持内环境RA及视黄醇的稳定状态 中发挥重要作用.Genebank中登陆号为AB045131 的cDNA被认为是NRDR的编码基因(称DHRS4). 人DHRS4基因簇有3个基因拷贝(DHRS4(GenelD: 10901),DHRS4L2(DHRS4like2,GeneID:317749) 和DHRS4LI(DHRS4likel,GenelD:728635),串 联排列于人类基因组14ql1.2.本课题组在人肝正 常及多种肿瘤细胞中,发现了DHRS4和DHRSL2

8、 基因的1O余种mRNA选择性剪接亚型,并在人宫 ?138? 颈癌细胞中发现了不同亚型蛋白在细胞内的定位改 变,提示这些选择性剪接亚型可能通过影响RA的 合成,参与细胞内的信号传导,细胞增殖分化,并 与肿瘤的发生,发展密切相关【4J,选择性剪接可能 在NRDR功能调控上有重要作用.本研究在HepG2 细胞中克隆并鉴定了-aat新的NRDR选择性剪接亚 型,对其可能编码的蛋白质序列进行分析,并对新 亚型在正常人肝脏和其它几种肿瘤细胞中mRNA表 收稿日期:20100l一26 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30970626) 作者简介:钱程(1983一).男.湖北省武汉市人,汕头大学 医学院

9、在读硕士生. 通信作者:黄东阳E-umil:huangdy 箜翅垡墨笠:旺瘪塑堕酸?:塑性视黄醇脱氢/还原酶选择性剪接新亚型的鉴定和分析 达情况进行了检测,研究结果将为深入研究新亚型 的功能提供实验依据. l材料与方法 1.1细胞株,试剂及仪器 Hela,HepG2,HL7702,M17,BEL7402细胞株 (上海生物学细胞研究所,中国),HOS,EC109细 胞株(中国医学科学院细胞中心,中国).RP MI1640,DMEM,FI2培养基,胎牛血清(GIBCO公 司,美国).Trizol试剂(Invitrogen公司,美国), QuantscriptRTMix,2XTaqPCRMaster

10、Mix(Tiangen 公司,中国),DNALadder(NewEnglandBiolabs公 司,美国),3RACE试剂盒(TakaRa公司,日本), DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒,T4连接酶,pGEM.T Easy载体(Promega公司,美国). 1.2方法 1.2.1总RNA提取及纯度鉴定各种细胞总RNA 提取按riftzol试剂说明完成,紫外分光光度计对所 提取的RNA进行纯度鉴定和定量. 1.2.23.RACE按试剂盒说明,以2g总RNA 为模板,用3RACEAdaptor引物进行反转录反应, 合成1stStrandcDNA,反应条件42qC,60nfin;70 ?.15min.反应

11、结束后进行巢式PCR,用3. RACE外侧引物:5nCC.GTCGTrCCACTACT. GATIT-3和上游外侧NRDR特异性引物GSP1:5. A1?CAcAAGCCGGGCCIGCTAG-3,进行第一轮PC 反应;用3一RACE内侧引物:5一CGCGGATCCTC. CACTACrI?A,兀I?ACnTAGG.3和上游内侧NRDR特 异性引物GSP2:5GCCICQCCGACGGGATCGG.3, 进行第二轮PCR反应,2次PCR反应条件均为:94 ?,3Injn;94?,30s,55?,30s,72?,2min, 30个循环;72qc,10min,以此获得3末端. 1.2.3DGEM.

12、TEasy重组体的构建及DNA片段克 隆将3RACE法扩增得到的PCR产物经质量分数 1.5%的琼脂糖凝胶电泳,用DNA琼脂糖凝胶回收 试剂盒回收DNA片段,用T_A克隆法将其克隆至 pGEMTEasy质粒载体,转化入JM109感受态大肠 杆菌,在含氨苄青霉素,IPTG和XGal的LB平皿 上涂菌,37?培养18h以上,进行蓝白筛选,挑 选白色菌落进行菌落PCR,鉴定是否插入目的片 段,菌落PCR引物为T7:5一TAATACGACTCAC TATAGGG-3,SP6:5.TATITAGGTGACACTATAG一 3,菌落PCR反应条件为:94?,3min;94?, 30s,55oC,30s,7

13、2oC,30s,25个循环;72?, 10min.将含有目的片段的阳性克隆进行测序分 析. 1.2.4生物信息学方法序列分析用NCBIBLAST 及Jellyfish软件比对新发现的DHRS4L1选择性剪接 亚型序列,查找开放阅读框架,推测其蛋白质序 列,与NCBI网站中DHRS4,DHRS4L1基因参考蛋 白序列相对比,分析该蛋白质可能具有的功能. 1.2.5cDNA合成及半定量PCR分别取HepG2, HL7702,BEL7402,HOS,Hela,EC109,M17SK- OV一3细胞总RNA1,在QuitReverseTranscrip tase作用下反转录合成cDNA第一链.针对 4

14、1选择性剪切亚型e1.e2一insertione8.e9.el0, 跨外显子e2和insertion设计上游引物:5.CACAGT GAGC11CCAGGGAAATG.3,在外显子e8上设计下游 弓物:5-ACTGACA,IIGTAAGGACTGAAGCC.3.扩 增片段长度125bp.采用CAPDH作为内参基因. 上游引物:5一GCACCGTCAAGGCTGAGAAC.3,下游 引物:5-TGGTGAAGACGCCAC,I?GA.3,扩增片段 长度138bp.PCR反应条件均为:94?,3min;94 ?,30S,60?,30s,72?,30s,30个循环;72 ?,10rnin.PCR产物

15、经1.5%琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙啶染色,用凝胶成像系统扫描分析电泳条带 的光密度值,目的条带光密度值与内参条带光密度 值之比值为相对表达量. 2结果 2.1总RNA提取 在培养的HepG2中提取总RNA,琼脂糖凝胶 电泳结果见图1,可见清晰的l8S和28SrRNA条 带,且28S:18S约为2:1.紫外分光光度计测得C (RNA)=I.146fL,D26o/D2so=1.9238. Ml 图ltlepG2中总PdqA电泳图 Fig.1AgamsegelelectmphoresisoftotalRNAinHepG2cell 第3期钱程等.人肝癌细胞辅酶?.依赖性视黄醇脱氢/还原酶选择性剪接新亚

16、型的鉴定和分析 2.23一RACE法扩增得到3末端cDNA序列 经逆转录和巢式PCR扩增后琼脂糖电泳结果 显示单一条带(图2)长度约为1000bp,常规克隆, 菌落PCR鉴定(图3),Lanel和Lane2对应的克隆 送测序公司测序. M1 图2DHRS4L1A13RACE产物 Fig.2DHRS4LIA13RACEproduct(LaneM100bpDNAlaldcr lane13RACEproduct1003bp) 54321M 图3DHRS4L1Al菌落PCR Fig.3TheresultofcolonyPCRofDHRS4L1A1(Lane5Negative contro1) 2.3e

17、DNA序列分析 经BLAST比较发现,该eDNA序列与 DHRS4L1基因高度同源,命名为DHRS4L1A1.经 JeUsh软件对其阅读框架进行分析,结果发现编 码区的起始密码子位于13bp,终止密码子位于 697699bp.其可读框架在1699bp之间(图3), 共699bp,3非编码区在700,1107bp之间,多聚 腺苷酸信号aataaa位于1073,1078bp. 图4DHRS4L1A1编码的蛋白质 Fig.4DeducedproteinsequenceofDHRS4L1A1 ? 140? 2.4DHRS4L1基因与DHRS4L1Al外显子组成分 析 DHRS4L1基因共有10个外显子

18、,而人 DHRS4LIAl由选择性剪接造成了第3,7外显子丢 失,并有第2,3外显子之间一段长度为85bp内含 子序列保留,结构为e1.e2.Insertion.e8.e9一el0(图 5). DHRM-厂百口一?r口口口口口|II_ 图5人DHRS4L1A1选择性剪接亚型的外显子剪接组成图 Fig.5ExonscompositionofhumanDHRS4L1A1anditsaltema- tivesplicingvariant 2.4.3DHRS4L1A1编码蛋白质的序列分析 DHRS4基因簇中,DHRS4是NRDR的编码基 因,NRDR属于一种SDR,含有SDR家族2个 (TAXXXGX

19、G与YxXSK)保守的模序,并具有过氧 化物酶体定位信号SRL.DHRS4L1编码的蛋白由 282个氨基酸组成,具有YXXSK模序及SRL. DHRS4L1A1cDNA编码的蛋白由232个氨基酸组 成,具有TAXXxCxG与YXXSK模序及SRL(图6). DHRS4 DHRS4L】 DHRS4L1Al Consensus klhgidilvsngfeewdIdinkaaimkavvpeme 1912012ll221231 图6人DHRS4,DHRS4L1及DHRS4L1A1的蛋自质序列比 较结果 Fig.6Multipleproteinsequencesali/pamentofhumanDH

20、RS4, DHRS4L1andDHRS4L1A1 2.5DHRS4L1A1mRNA在各种细胞中的表达情况 对8种细胞株进行RT-PCR,并且以H作 为内参,结果显示,DHRS4L1A1在正常肝,肝癌, 骨肉瘤和卵巢癌细胞中均有表达,但在神经母细胞 瘤和食管癌细胞中未检测到其表达.在SKOV3中 的表达量显着高于其他细胞(图7,表1),提示该 剪接亚型有可能参与生殖系统相关酶类的代谢. 坠一一 翅丛猩笠!厶旦王疸绁堕塑酶:塑丝塑董醒氢厦酶选择性剪接新亚型的鉴定 200bp 100bp 200bp 100bp 图7DHRS4L1A1在不同细胞中的表达情况 Fig.711leexpressionso

21、fDHRS4L1A1mRNAindifferentcell lines LaneMDNAladderLanelHL7702L丑ne2 BELT402Iane3HepG2Lane4HosLane5Hela Lan05EC109Lane/M17,nne8SK-Ov-3 表1不同细胞中DHRS4L1A1rIlIA的相对表达量 1.ab】e1IIeexpressionsofD忍兄S4L1A1mRNAindifferentcell lines 3讨论 从结构上讲,NRDR属于一种SDR5J.SDR家 族在功能上复杂多样,且常是一种具有多种功能的 酶.现已发现60个以上的家族成员,尽管成员间 的氨基酸的一

22、致性仅10%一30%,但共同点是:有 2个SDR家族保守模序,一个是辅酶结合模序 TAXXXGXG,与辅酶NAD(H)或NADP(H)的结合有 关.还有相当一部分SDR家族成员包括NRDR有 YXXSK模序,被认为是底物结合区域的一部分【6J. 本研究中.我们使用NRDR的特异引物,用3 RACE法,克隆了人DHRS4L1A1的3末端cDNA序 列,获得DHRS4L1基因的选择性剪接新亚型 DHRS4L1A1.该亚型在3845位氨基酸保留了辅 酶结合模序,在136,140位氨基酸保留了底物结合 区.人,小鼠,兔,大鼠和猪的NRDRC.末端的3 个氨基酸均为SRL,被认为是过氧化物酶体的靶向 信

23、号(PTSI),DHRS4L1A1编码蛋白质的C一末端具 有SRL.从结构上说,它具备了SDR家族的特征, 提示人DHRS4L1A1编码的蛋白也应该属于SDR家 族. 本研究在肝癌HepG2中发现的NRDR新选择性 剪接亚型,其在正常肝细胞和其他多种肿瘤细胞中 都有表达,但在神经母细胞瘤和食管癌细胞中未见 表达,提示该亚型的表达具有组织性差异,并且我 们还发现新亚型DHRS4L1A1在SKOV3细胞中的表 达量远高于其它细胞,提示该亚型有可能参与生殖 系统相关酶类的代谢. 选择性剪接是真核生物的一个重要的转录调节 方式.40%,60%的人类基因具有选择性剪接的亚 型,为人类基因组功能复杂性的原

24、因之一.选择性 剪接被认为和多种疾病发生和发展尤其是肿瘤疾病 密切相关.NRDR基因的第1个clusterDHRS4也 被证实有众多的选择性剪接方式.同时,有研究显 示肿瘤组织中的选择性剪接亚型的数量显着高于正 常组织,提示异常的选择性剪接与肿瘤发生相关. 因此,选择性剪接在作为一种增加蛋白多样性的方 式的同时也为肿瘤的发生提供了机会.本研究在 HepG2中克隆了一个DHRS4L1A1亚型,进一步证 实了选择性剪接在调控NRDR(DHRS4)基因功能和 增加基因产物多样性方面的重要作用,但这些亚型 究竟是正常还是异常的剪接现象以及它们的确切功 能等问题还有待进一步深入研究. 参考文献: 1OP

25、PERMANNU,FILLINGC,HULTM.eta1.Short-chain dehydrogenase/reduetase(SDR):the2002updateJ.Chem BiolInteract,2003,1:247253. 2JOSEPHMJ,MILANIEJB,BR/ANPC,eta1.Reviewarti. ele:Comparativeanatomyofthealdo-ketoreductasesuperfa- milyJ.BiochemJ,1997,326:625636. 3KAIJBERGY,OPPERMANNU,JORNVALLH,eta1. Short-chainde

26、hydrogenase/reductase(SDRs)coenz3mle-based functionalassigrmmntsincompletedgenomesJ.EurJ Biochein,2002,269:44O94417. 4SONGXH,HANGB,LIUGF,eta1.Expressionofanovel alternativelysplicedvariantofNADP(H)-dependentrefinolde- hydrogenase/reductasewithdeletionofexon3incervicalsqua inouscarcinomaJ.Internation

27、alJotmralofCancer,2007. 120:16181626. 5YMYANG,DYHUANG,GFLIU,eta1.Intfibitoryeffects ofvitaminAOnTCDD-inducedcytochromeP-4501A1enzyme activityandexpressionJ.ToxicologicalSciences,2005,85: 727734. 6宋旭红,梁斌,刘戈飞,等.宫颈鳞癌组织中NRDR选 择性剪切新亚型的鉴定及意义J.肿瘤,2006,26 (12):10881092. 7WANGY,LEUNGFC.AnevaluationofnewcriteriaforcIjG islandsinthehmnangenomeasgenemarkersJ.Bioinforma- tics.2004.20:11701177.