RSV感染诱导的TLR4NFκB信号通路激活及PPARγ激动剂的抑制作用.docx

RSV感染诱导的TLR4NFκB信号通路激活及PPARγ激动剂的抑制作用.docx

《RSV感染诱导的TLR4NFκB信号通路激活及PPARγ激动剂的抑制作用.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《RSV感染诱导的TLR4NFκB信号通路激活及PPARγ激动剂的抑制作用.docx（125页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

RSV感染诱导的TLR4NFκB信号通路激活及PPARγ激动剂的抑制作用

RSV感染诱导的TLR4NFκB信号通路激活及PPARγ激动剂的抑制作用

温州医学院硕士学位论文

RSV感染诱导白,OTLR41NF-KB信号通路激活及PPARY激

动剂的抑制作用

研究生：

张同强导师：

董琳主任医师陈小芳高级实验师李昌崇教授李孟荣教授（温州医学院附属育英儿童医院呼吸科浙江温州325027）

中文摘要

目的：

1．通过观察呼吸道合胞病毒（RSV）感染人肺癌上皮细胞（A549细胞）12h、24h、48h后Toll样受体4（toll—likereceptor4，TLR4）／核因子一KB（Nuclearfactor-kappaB，NF—KB）信号通路中TLR4、NF—KB抑制蛋白（inhibitorofNF-KB，IKBQ）、IKB激酶B（IKBkinaseB，IKKB）蛋白及mRNA的表达情况，探讨RSV感染对TLR4／NF—KB信号通路的激活作用。

2．进一步观察不同剂量过氧化物酶体增殖物活化受体y（PPARY）激动剂

15一脱氧前列腺素J：

（15d—PGJ。

）、罗格列酮、NF—KB抑制剂（PDTC）和PPARy抑制剂（GW9662）干预对RSV感染A549细胞上述蛋白及mRNA表达的影响，探讨PPARY激动剂对RSV感染时TLR4／NF—KB信号通路激活的抑制作用及其机制，并比较两种PPARY激动剂的抑制效果。

3．为临床应用PPARY激动剂治疗RSV感染提供实验依据，为RSV感染治疗药物的研发提供新的途径。

方法：

A549细胞传代培养后接种于六孔板，F12K培养液培养过夜，再随机分为6

组；A组（15d—PGJ2+RSV组），B组（罗格列酮+RSV组）、C组（DMSO+RSV组）、D组（PDTC+RSV组）、E组（GW9662+罗格列酮+RSV组）和F组（细胞对照组）。

C组以含0．01％DMSO维持液预处理0．5h，再加维持液培养。

A-E组以i00半数组织培养感染量（TCID50）RSV吸附2h后加维持液培养以制作RSV感染的细胞模型。

造膜开始前A、B、D组分别给予15d-PGJ：

（10—20lamol／L）、罗格列酮（i0—30I-Imol／L）、PDTC（10umol／L）预处理0．5h；E组在罗格列酮预处理前先以同等剂量的GW9662预处理0．5h，余步骤同D组；F组未予处理在培养液中正常培养。

各组分别在培养12h、24h、48h时收获细胞提取蛋白和RNA，应用Westernblot检测各组TLR4、IKKB及工KBQ蛋白表达情况；实时荧光定量PCR检测各组TLR4、IKKB及IKBQmRNA表达情况。

温州医学院硕士学位论文

结果：

1．病毒滴度测定：

RSV的TCID50通过Reed—Muench公式计算为10‘4‘5／50u1。

造模采用的病毒攻击量为100TCID50，即i012’5／50pl。

2．RSV感染后TLR4、IKKB和IKBQ蛋白及mRNA表达的变化：

与F组相比，C组在12h、24h、48hTLR4矛NIKK13蛋白及mRNA明显升高（均P<0．01），IKBQ蛋白及mRNA表达量明显降低（22P<0．01）。

TLR4和IKKB蛋白及mRNA表达量在感染后24h达高峰，IKBQ蛋白及mRNA表达量在24h最低，TLR4、IKKB、IKBQ蛋白和mRNA随时间的变化趋势基本一致。

3．PPARy激动剂干预对TLR4蛋白及mRNA表达的影响：

A组和B组24hTLR4蛋白及mRNA表达量与C组相比呈剂量依赖性下降（均尺O．05），其中20umol／L15d—PGJz和30umol／L罗格列酮干预后TLR4蛋白表达量最低，但仍高于细胞对照组（P；O．05）。

20umol／L15d-PGJ。

$n30umol／L罗格列酮在12h、24h、48hTLR4mRNA表达量与F组相比差异无统计学意义（乃0．05）。

10l-tmol／L15d—PGJ：

和同剂量的罗格列酮干预后24hTLR4蛋白及mRNA表达量的差异无统计学意义（D0．05）。

20umol／L15d—PGJ。

干预后各时间点TLR4蛋白及mRNA表达量均明显低于同剂量罗格列酮干预后的表达量（均P（O．05）。

D组与C、E组相比，TLR4蛋白及mRNA表达量在12h、24h、48h均明显下降（均P（O．05），但仍高于F组（均P（O．05）。

4．PPARy激动剂干预对IKKB蛋白及mRNA表达的影响：

A组、B组24hIKK13蛋白及mRNA表达量与C组相比呈剂量依赖性降低（均P（0．05）；20“mol／L15d—PGJ：

和30umol／L罗格列酮干预后24hIKKB蛋白及mRNA表达量最低，与细胞对照组相比差异无统计学意义（均P）O．05），而以上剂量PPARY激动剂干预后12h及48hIKKBmRNA表达量与F组相比无明显升高（均P>O．05）。

20umol／L15d—PGJ2干预后12h、24h和48hIKKB蛋白及mRNA表达量均明显低于同剂量的罗格列酮干预后的表达量（均尺0．05）。

D组与C、E组相比，IKKB蛋白及mRNA表达量在各时间点均明显下降（均P（0．05）；D组48hlKKBmRNA表达量与F组相比差异无统计学意义（均乃O．05）。

5．PPARY激动剂干预对IKBQ蛋白及mRNA表达影响：

A组和B组24hiKBQ蛋白及mRNA表达量与C组相比呈剂量依赖性升高（均P（O．05）。

24h

20umol／L15d-PGJ。

和30umol／L罗格列酮干预后工KBQ蛋白及mRNA表达量最高，

20umol／L15d-PGJ：

干预后各时间点工KBQ蛋白及mRNA表达量均明显高于同剂量罗格列酮干预后的表达量（均P（0．05），与细胞对照组相比差异无统计学意义（均侈O．05）。

24h10umol／L15d-PGJ。

干预后IKBQ蛋白及mRNA表达量与相同剂量的罗格列酮干预后的表达量相当（]bO．05）。

D组与C、E组相比，工KBa蛋白及mRNA表达量在各时间点均明显升高（均P

温州医学院硕士学位论文

结论：

1．RSV感染可导致TLR4／NF—KB信号通路激活，TLR4、IKK13蛋白和mRNA表达升高，以感染后24h最高；IKBQ表达降低，以感染后24h最低。

2．PPARY激动剂15d—PGJ2、罗格列酮及PDTC能降低TLR4、IKKB蛋白和mRNA

表达，升高IKBQ蛋白和mRNA表达，GW9662能够完全拮抗罗格列酮的作用，提示15d—PGJ2和罗格列酮可通过抑制TLR4／NF—KB信号通路的激活而发挥抗炎作用。

3．15d—PGJ。

和罗格列酮能以剂量依赖性方式抑制TLR4／NF—KB信号通路的激活，最佳剂量分别为20Iamol／L和30umol／L，并且20umol／L15d—PGJ。

的抑制作用优于同剂量的罗格列酮。

【关键词】PPARy激动剂；TLR4／NF—KB信号通路；呼吸道合胞病毒；A549

细胞

温州医学院硕士学位论文

RespiratorysyncytialvirusinfectioninducetheactivationofTLR4／NF—vd3signalingpathwayinhumanlungepithelialcellsandtheinhibitioneffectofPPARyagonists

Abstract

objective：

1．Inthestudyherein，weobservedtheexpressionof（toll—likereceptor4，TLR4），11（Bkinasep（IKKp）andIvd30tbothatthelevelsofproteinandmRNAinhumanlungepithelialcells（A549）infectedwithrespiratorysyncytialvirus（RSV），andexploredtheactivationofTLR4／NF—r．BsignalingpathwayintheRSVinfectedA549cells．

2．Theeffectsofperoxisomeproliferator-activatedreceptor丫（PPAR?

）agonists15一deoxy-deltal2，14prostaglandinJ2（15d-PGJ2），Rosiglitazone，inhibitorofNF-r_B（PDTC）andinhibitorofPPAR7（GW9662）ontheexpressionofTLR4，IKKpand

Iv．BaproteinandmRNAinA549cellsinducedbyRSVinfectionwereobserved．We

alsoexploredtheinhibitioneffecttotheactivationofTLR4／NF—rd3signaling

pathwayinPPAR?

agonists，andcomparedtheinhibitioneffectin15d-PGJ2and

Rosiglitazone．

3．WeprovidedexperimenttheoreticalbasisforclinicalapplicationofPPAR7agonistsandnewapproachesforthetreatmentofRSVinfectionindrugresearchanddevelopment。

Methods：

A549cellswereseededin6-wellcultureplatesandculturedovemight

inF12Kculturesolutionandthenrandomlydividedintosixgroups，whichweredesignatedasgroupA（15d-PGJ2+RSVgroup），groupB（Rosiglitazone+RSVgroup），groupC（DMSO+RSVgroup），groupD（PDTC+RSVgroup），groupE（GW9662+Rosiglitazone+RSVgroup）andgroupF（cellcontrolgroup）．GroupCwaspretreatedwithcellmaintainedmediumcontaining0．01％（v／v）DMSOfor30rain，thenincubated．GroupA、B、C、D、andEwereinfectedwithRSV（100（median

tissuecultureinfectiondose，TCID50））for2handthenincubatedwithmaintainedmediumtoconstructthecellsmodelforRSVinfection．GroupA、BandDwerepretreatedwith15d-PGJ2（10-209mol／L），Rosiglitazone（10—309mol／L）andPTDC（109mol／L）for30minbeforeinfectedwithRSV．GroupEwaspretreatedwithGW9662（309mol／L）for30min，andtheotherstepsalikeGroupB（30pmol／L）．GroupFwasjustculturedinthemediumwithouttreatment．Afterincubatedfor12h，

气

温州医学院硕士学位论文

24hand48hlateqtheexpressionofTLR4、II姒13andIv,BotatmRNAandproteinlevelsinthegroupswasdeterminedbyreal-timeRT-PCRandWesternblot．

Results：

1．Measuringviraltiters：

Thevirusinhalfoftheinfected（TCID50）wasl0—4．5／509lbycalculatedwithReed—Muenchformula．Experimentgroupswiththeamountofvirusattackingwas100TCID50，whichwas10—2．5／5091．

2．RSV-inducedexpressionofTLR4．IKK13andIKBQproteinandmRNAinA549cells：

TheexpressionofTLR4andIKKBingroupCat12h，24hand48hwerebothsignificantlyhigherthangroupFbothatproteinandmRNAlevels，andwithpeakat24h（allP<0．o1）．Concomitantly,andecreasedcellularamountofIvd30【proteinandmRNAwasobservedingroupCwhencomparedwiththegroupFateachtime，andwithbottomat24h（P

3．TheeffectsofPPAR7agonistsontheexpressionofTLR4proteinandmRNA：

TheproductionofTLR4proteinandmRNAat24hingroupAandBweresignificantlylowerthangroupCinadose-dependentmanner（allP<0．01）．15d．PGJ2at20pMandRosiglitazoneat30gMledtoamostdecreaseinTLR4proteinproductionat24hwhencomparedwithgroupC，butstillhigherthangroupF（allP<0．05）．TheexpressionofTLR4mRNAatconcentrationof209mol／LofgroupAand309mol／LofgroupBat12h，24hand48hwerenodifferenceswhencompared

withgroupF（all胗0．05）．1Opmol／Lof15d．PQJ2andRosiglitazonehadtheequal

expressionofTLR4proteinandmRNAat24h仔'<0．05）．Attheconcentrationof20pmol／L，theexpressionofTLR4proteinandmRNAat12h，24hand48hin15d—PGJ2waslowerthanRosiglitazone妒<0．05）．TheproductionofTLR4proteinandmRNAingroupDat12h，24hand48hweresignificantlylowerthangroupCandE（all尸<0．05），whilehigherthangroupF（allP<0．05）．

4．TheeffectsofPPAR7agonistsontheexpressionofIKKl3proteinandmRNA：

TheproductionofII张13proteinandmRNAat24hingroupAandBwere

significantlydecreasedinadose-dependentmannerwhencomparedwithgroupC（all

氏0．o1）．15d·PGJ2at20州andRosiglitazoneat30gMledtoalowestproductionofIKXl3proteinandmRNAat24hwhencomparedwithgroupC（allP<0．o1），andwerenodifferencewhencomparedwithgroupF（P>0．05）；furthermore，theexpressionofII妯K13mRNAinPPAR7agonistattheabovementionedconcentrationat12hand48h

hadnosignificantlyincreasewhencomparedwithgroupF（all胗0．05）．Attheconcentrationof20pmol／L，theexpressionofIKK]3proteinandmRNAat12h，24h

6

温州医学院硕士学位论文

and48hin15d-PGJ2waslowerthanRosiglitazonerP<0．05）。

TheproductionofIKKl3proteinandmRNAingroupDat12h，24hand48hweresignificantlylowerthangroupCandE（all氏0．05），whilehigherthangroupFexceptforgroupat48hinrnRNA

expression（P<0．05）．

5．TheeffectsofPPAR7agonistsontheexpressionofIr,_BaproteinandmRNA：

TheproductionofIrBetproteinandmRNAingroupAandBweresignificantly

higherthangroupCinadose-dependentmanner（allP

Rosiglitazoneat30州ledtoahighestproductionoflr．BaproteinandmRNAat24hwhencomparedwithgroupCr（both氏O．01）．TheexpressionofIrd30【proteinand

mRNAat12h，24hand48hin15d-PGJ2at20州werenodifferencewhencompared

withgroupF（all胗0．05），andsignificantlyhigherthanRosiglitazone（a11P<0．05）．109mol／Lof15d—PGJ2andRosiglitazonehadtheequalproductionofIvd30tproteinandmRNAat24h仔）>0．05）．Theproductionoflv．13aproteinandmRNAingroupDat12h，24hand48hweresignificantlyhigherthangroupCandE（a11P<0．05），andwerenosignificantlylowerthangroupFfP<0．05）．

Conclusions：

1．RSVcaninducetheactivationofTLR4／NF—r．Bsignalingpathway,andtheexpressionofTRL4，IKKl3wasincreasedandIvd3awasdecreasedbothatmRNAandproteinlevelsinA549cellsinfectedwithRSV,withpeakat24h．

2．OurdatapresentherefirstshowthatboththePPAR7agonistes15d．PGJ2，

RosiglitazoneandPDTCpossessanti—inflammatorypropertiesbydecreasetheexpressionofTLR4andIKXl3，andincreasetheexpressionofIvd3abothinproteinandgenelevels，andGW9662canfullyantagonizedthesuppressivepropertiesofthe

Rosiglitazone，whichindicatedthatblockingtheactivationofTLR4／NF—v,BsignalingpathwaymaybeoneofthemechanismsbythePPARyagonists．

3．15d—PGJ2andRosiglitazoneinhibitstheactivationofTLR4／NF—vd3signalingpathwayinadose—dependentmanner，andattheconcentrationof20州and30州，respectively，ledtoahighesteffects．15d-P