血红蛋白的提取和分离.docx

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血红蛋白的提取和分离

　血红蛋白的提取和分离

目标导航　1.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。

2.理解缓冲液的组成和作用机理。

3.体验提取生物大分子的基本过程和方法。

一、分离蛋白质的基本方法原理

1．蛋白质的分离方法——凝胶色谱法

凝胶色谱法也称做________________，是根据________________的大小分离________的有效方法。

相对分子质量

直径大小

运动方式

运动速度

运动路程

洗脱

次序

大

____凝胶颗粒空隙直径，被排阻在____

垂直向下移动

____

较短

先从凝胶柱洗脱出来

小

____凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部

垂直向下移动，无规则扩散进入凝胶颗粒

____

较长

后从凝胶柱洗脱出来

2.缓冲液的作用和组成

（1）作用

在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界________和________对溶液________的影响，维持pH基本不变。

纯水的pH因加入少量的强酸或强碱而发生很大变化。

然而，1滴浓盐酸加入到1LCH3COOH—CH3COONa混合溶液或NaH2PO4—Na2HPO4混合溶液中，[H＋]的增加不到百分之一（从1.00×10－7mol/L增到1.01×10－7mol/L），pH没有明显变化。

（2）组成

缓冲溶液通常由________种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的____________就可以制得________________________的缓冲液，其类型主要有3种：

①弱酸及其对应盐，如CH3COOH—CH3COONa，H2CO3—NaHCO3。

②多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，如

NaHCO3—Na2CO3，NaH2PO4—Na2HPO4。

③弱碱及其对应盐，如NH3·H2O—NH4Cl。

3．电泳

（1）概念

电泳是指____________在________的作用下发生________的过程。

许多重要的生物大分子，如________、________等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上________或________。

在电场的作用下，这些带电分子会向着________________的电极移动。

（2）原理

在同一电场下，由于各种分子________性质的差异及分子本身________、________的不同，使带电分子产生________________，从而实现样品中各种分子的分离。

（3）常用方法

①____________电泳：

由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大小和形状不同而不同，从而得以分离。

②________________电泳

加入SDS作用：

使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链；与各种蛋白质结合形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

二、粗提取血红蛋白

1．红细胞的洗涤

（1）目的：

____________，以利于后续步骤的分离纯化。

（2）过程

：

为防止血液凝固，需在采血器中加入抗凝血剂柠檬酸钠

：

500r/min，离心2min，这样做的目的是防止红细胞与白细胞一同沉淀，达不到分离效果

：

用胶头吸管吸去上层黄色血浆

：

向盛有暗红色红细胞液体的烧杯中加入五倍体积的生理盐水，缓缓搅拌10min

：

直至上清液中没有黄色，表明红细胞已经洗涤干净，否则需重复洗涤

（3）操作提示：

洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要，洗涤次数少，无法除去血浆蛋白，离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离效果。

2．血红蛋白的____

（1）方法：

将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加______到原血液的体积，再加40%体积的______，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。

（2）目的：

使红细胞吸水____，血红蛋白释放出来。

（3）原理：

渗透作用。

3．分离血红蛋白溶液

（1）方法

①将搅拌好的混合液转移到__________中，以2000r/min的速度____10min。

②将离心管中的液体部分用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层。

③将滤液置于分液漏斗中，静止片刻后，分出下层的红色透明液体，即为血红蛋白溶液。

（2）目的：

使________与大部分杂质分离开，便于后续纯化。

（3）离心后试管中的溶液分为4层，最上面的一层是甲苯层，第二层是脂溶性物质沉淀层，第三层是血红蛋白水溶液层，最下层是杂质沉淀层。

4．粗分离——透析

（1）原理：

______能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。

（2）过程：

取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h。

（3）目的

①除去样品中相对分子质量较小的杂质。

②用于更换样品的缓冲液。

三、纯化蛋白质

1．凝胶色谱柱的制作

（1）取长40cm，内径为1.6cm的________，两端需用砂纸磨平。

（2）柱底部制作：

打孔→挖出________→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将________上部包好。

（3）柱顶部制作：

打孔→安装玻璃管。

（4）将上述三部分按相应位置组装成一个整体。

2．凝胶色谱柱的装填

（1）计算：

根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量

　↓

（2）凝胶________：

凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬液

　↓

（3）________：

将色谱柱垂直固定在支架上

　↓

（4）________：

将凝胶悬液一次性装填入色谱柱内

　↓

（5）________：

用20mmol/L的磷酸缓冲液（pH＝7.0）洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密

3．样品的加入和洗脱

（1）调整缓冲液面：

打开色谱柱下端的流出口，调整缓冲液与凝胶面________

（2）________透析样品：

关闭下端出口，用吸管小心将1mL样品加到色谱柱顶端

（3）样品渗入凝胶床：

加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

（4）再调整________：

关闭出口，小心加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度

（5）________：

打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱

（6）收集：

待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集

四、实验操作提示

1．红细胞的洗涤：

________________________________。

2．凝胶的预处理：

_________________________________________________________。

3．色谱柱的装填：

___________________________________________________________。

4．色谱柱成功的标志：

________________________。

五、蛋白质纯度鉴定及实验结果分析与评价

1．纯度鉴定——________________________________

判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。

鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2．结果分析与评价

项目

分析

血液样品的处理

分层____→样品处理完成

凝胶色谱柱的装填

放一个与凝胶柱垂直的日光灯→直接检查；

加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整→装填成功

血红蛋白的分离

血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出→分离成功

知识点一　分离蛋白质的基本方法原理

1．利用凝胶色谱法分离蛋白质时，蛋白质洗脱出来的顺序是（　　）

①相对分子质量最大的　②相对分子质量最小的

③相对分子质量适中的

A．①②③B．③②①C．①③②D．②①③

2．凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法，但并非所有的蛋白质都可以用此方法进行分离，能分离的蛋白质分子之间必须（　　）

A．具有相同的相对分子质量

B．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子

C．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子

D．具有不同的相对分子质量

知识点二　分离蛋白质的实验操作

3．对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作，不正确的是（　　）

A．加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐

B．让吸管管口沿管壁环绕移动，贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面

C．打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱

D．待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，每5mL收集一管，连续收集流出液

4．在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程的分析无误的是（　　）

A．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐

B．洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果

C．洗涤过程选用0.1%的生理盐水

D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质

答案

一、1.分配色谱法　相对分子质量　蛋白质　大于　外面

较快　小于　较慢

2．

（1）酸　碱　pH　

（2）1～2　使用比例　在不同pH范围内使用

3．

（1）带电粒子　电场　迁移　多肽　核酸　正电　负电　与其所带电荷相反　

（2）带电　大小　形状　不同的迁移速度　（3）①琼脂糖凝胶　②聚丙烯酰胺凝胶

二、1.

（1）去除杂蛋白　

（2）②离心　③血浆　④洗涤

2．释放　

（1）蒸馏水　甲苯　

（2）涨破

3．

（1）①离心管　离心　

（2）血红蛋白

4．

（1）透析袋

三、1.

（1）玻璃管　

（2）凹穴　橡皮塞

2．

（2）溶胀　（3）固定　（4）装填　（5）洗涤平衡

3．

（1）平齐　

（2）滴加　（4）缓冲液面　（5）洗脱

四、1.洗涤次数不能过少；低速、短时离心

2．沸水浴法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物和气泡

3．装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流

4．红色区带均匀一致地移动

五、1.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳　2.明显

对点训练

1．C　[分子很大，完全不能进入凝胶内的任何孔隙的蛋白质洗脱出来的时间最短；分子大小适中，能进入凝胶内孔隙中孔径大小相应部分的蛋白质，洗脱出来的时间次之；分子很小，能进入分子筛全部孔隙内的蛋白质，洗脱出来的时间最长。

]

联想　凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，相对分子质量很小，能进入分子筛的全部孔隙，运动速度最慢，路程最长；相对分子质量较大的，不能进入凝胶颗粒内，运动速度最快，路程最短。

所以，蛋白质可以按不同顺序洗脱出来。

规律链接　凝胶色谱中分子彼此间较易分开的原因

在凝胶色谱中会有三种情况：

一是分子很小，能进入分子筛的全部内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。

三类分子彼此间较易分开。

2．C　[若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。

对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的，分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶。

]

3．C　[打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，在用同样的方法小心加入适量的20mmol/L的磷酸缓冲液，然后连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱。

]

规律链接　血红蛋白提取与分离过程中的注意事项

1．红细胞的洗涤

（1）离心速度与离心时间十分重要，离心转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离的效果。

（2）重复洗涤三次，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法清除血浆蛋白。

2．血红蛋白的释放

（1）蒸馏水的作用：

使红细胞的细胞膜和核膜破裂。

（2）甲苯的作用：

溶解细胞膜。

3．色谱柱填料的处理

为了加速干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，通常只需1～2h。

这种方法不仅节约时间，还可除去凝胶中可能带有的微生物，排出胶粒内的空气。

4．凝胶色谱柱的装填

在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。

（1）在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。

因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

（2）在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。

一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。

5．蛋白质的分离

滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。

根据红色区带的移动状况判断收集流出液的时间。

4．D　[洗涤红细胞的目的是去除血浆中除血红蛋白以外的杂蛋白；洗涤时离心速度过大，时间过长，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果；洗涤过程选用0.9%的生理盐水。

]