血红蛋白的提取和分离.docx

1、血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离目标导航1.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。2.理解缓冲液的组成和作用机理。3.体验提取生物大分子的基本过程和方法。一、分离蛋白质的基本方法原理1蛋白质的分离方法凝胶色谱法凝胶色谱法也称做_，是根据_的大小分离_的有效方法。相对分子质量直径大小运动方式运动速度运动路程洗脱次序大_凝胶颗粒空隙直径，被排阻在_垂直向下移动_较短先从凝胶柱洗脱出来小_凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部垂直向下移动，无规则扩散进入凝胶颗粒_较长后从凝胶柱洗脱出来2.缓冲液的作用和组成(1)作用在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界_和_对溶液_的影响，维持pH基本不变

2、。纯水的pH因加入少量的强酸或强碱而发生很大变化。然而，1滴浓盐酸加入到1 L CH3COOHCH3COONa混合溶液或NaH2PO4Na2HPO4混合溶液中，H的增加不到百分之一(从1.00107 mol/L增到1.01107 mol/L)，pH没有明显变化。(2)组成缓冲溶液通常由_种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的_就可以制得_的缓冲液，其类型主要有3种：弱酸及其对应盐，如CH3COOHCH3COONa，H2CO3NaHCO3。多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，如NaHCO3Na2CO3，NaH2PO4Na2HPO4。弱碱及其对应盐，如NH3H2ONH4Cl。3电泳(1)概念电泳是

3、指_在_的作用下发生_的过程。许多重要的生物大分子，如_、_等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上_或_。在电场的作用下，这些带电分子会向着_的电极移动。(2)原理在同一电场下，由于各种分子_性质的差异及分子本身_、_的不同，使带电分子产生_，从而实现样品中各种分子的分离。(3)常用方法_电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大小和形状不同而不同，从而得以分离。_电泳加入SDS作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链；与各种蛋白质结合形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白

4、质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。二、粗提取血红蛋白1红细胞的洗涤(1)目的：_，以利于后续步骤的分离纯化。(2)过程：为防止血液凝固，需在采血器中加入抗凝血剂柠檬酸钠 ：500 r/min，离心2 min，这样做的目的是防止红细胞与白细胞一同沉淀，达不到分离效果 ：用胶头吸管吸去上层黄色血浆 ：向盛有暗红色红细胞液体的烧杯中加入五倍体积的生理盐水，缓缓搅拌10 min ：直至上清液中没有黄色，表明红细胞已经洗涤干净，否则需重复洗涤(3)操作提示：洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要，洗涤次数少，无法除去血浆蛋白，离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离效果。2血

5、红蛋白的_(1)方法：将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加_到原血液的体积，再加40%体积的_，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min。(2)目的：使红细胞吸水_，血红蛋白释放出来。(3)原理：渗透作用。3分离血红蛋白溶液(1)方法将搅拌好的混合液转移到_中，以2 000 r/min的速度_10 min。将离心管中的液体部分用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层。将滤液置于分液漏斗中，静止片刻后，分出下层的红色透明液体，即为血红蛋白溶液。(2)目的：使_与大部分杂质分离开，便于后续纯化。(3)离心后试管中的溶液分为4层，最上面的一层是甲苯层，第二层是脂溶性物质沉淀层，第三层是血红蛋白水溶液层，最下层是杂质沉淀层

6、。4粗分离透析(1)原理：_能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。(2)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。(3)目的除去样品中相对分子质量较小的杂质。用于更换样品的缓冲液。三、纯化蛋白质1凝胶色谱柱的制作(1)取长40 cm，内径为1.6 cm的_，两端需用砂纸磨平。(2)柱底部制作：打孔挖出_安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将_上部包好。(3)柱顶部制作：打孔安装玻璃管。(4)将上述三部分按相应位置组装成一个整体。2凝胶色谱柱的装填(1)计算：根据色谱柱的内体

7、积计算所需凝胶量(2)凝胶_：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬液(3)_：将色谱柱垂直固定在支架上(4)_：将凝胶悬液一次性装填入色谱柱内(5)_：用20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密3样品的加入和洗脱(1)调整缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，调整缓冲液与凝胶面_ (2)_透析样品：关闭下端出口，用吸管小心将1 mL样品加到色谱柱顶端 (3)样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 (4)再调整_：关闭出口，小心加入20 mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度 (5)_：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱 (6)收集：待红色的蛋白质接近色

8、谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集四、实验操作提示1红细胞的洗涤：_。2凝胶的预处理：_。3色谱柱的装填：_。4色谱柱成功的标志：_。五、蛋白质纯度鉴定及实验结果分析与评价1纯度鉴定_判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。2结果分析与评价项目分析血液样品的处理分层_样品处理完成凝胶色谱柱的装填放一个与凝胶柱垂直的日光灯直接检查；加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整装填成功血红蛋白的分离血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出分离成功知识点一分离蛋白质的基本方法

9、原理1利用凝胶色谱法分离蛋白质时，蛋白质洗脱出来的顺序是()相对分子质量最大的相对分子质量最小的相对分子质量适中的A B C D2凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法，但并非所有的蛋白质都可以用此方法进行分离，能分离的蛋白质分子之间必须()A具有相同的相对分子质量B相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子C相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子D具有不同的相对分子质量知识点二分离蛋白质的实验操作3对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作，不正确的是()A加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐B让吸管管口沿管壁环绕移动，贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面C打开下端出口，待样

10、品完全进入凝胶层后，直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱D待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，每5 mL收集一管，连续收集流出液4在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程的分析无误的是()A洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐B洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果C洗涤过程选用0.1%的生理盐水D透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质答案一、1.分配色谱法相对分子质量蛋白质大于外面较快小于较慢2(1)酸碱pH(2)12使用比例在不同pH范围内使用3(1)带电粒子电场迁移多肽核酸正电负电与其所带电荷相反(2)带电大小形状不同的迁移速度(3)琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶二

11、、1.(1)去除杂蛋白(2)离心血浆洗涤2释放(1)蒸馏水甲苯(2)涨破3(1)离心管离心(2)血红蛋白4(1)透析袋三、1.(1)玻璃管(2)凹穴橡皮塞2(2)溶胀(3)固定(4)装填(5)洗涤平衡3(1)平齐(2)滴加(4)缓冲液面(5)洗脱四、1.洗涤次数不能过少；低速、短时离心2沸水浴法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物和气泡3装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流4红色区带均匀一致地移动五、1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳2.明显对点训练1C分子很大，完全不能进入凝胶内的任何孔隙的蛋白质洗脱出来的时间最短；分子大小适中，能进入凝胶内孔隙中孔径大小相应部分的蛋白质

12、，洗脱出来的时间次之；分子很小，能进入分子筛全部孔隙内的蛋白质，洗脱出来的时间最长。联想凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，相对分子质量很小，能进入分子筛的全部孔隙，运动速度最慢，路程最长；相对分子质量较大的，不能进入凝胶颗粒内，运动速度最快，路程最短。所以，蛋白质可以按不同顺序洗脱出来。规律链接凝胶色谱中分子彼此间较易分开的原因在凝胶色谱中会有三种情况：一是分子很小，能进入分子筛的全部内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。三类分子彼此间较易分开。2C若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情

13、况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的，分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶。3C打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，在用同样的方法小心加入适量的20 mmol/L的磷酸缓冲液，然后连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱。规律链接血红蛋白提取与分离过程中的注意事项1红细胞的洗涤(1)离心速度与离心时间十分重要，离心转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离的效果。(2)重复洗涤三次，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法清除血浆蛋白。2血红蛋白的释放(1)蒸馏水的作用：使红细胞的细胞膜和核膜破裂。(2)甲苯的作用

14、：溶解细胞膜。3色谱柱填料的处理为了加速干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，通常只需12 h。这种方法不仅节约时间，还可除去凝胶中可能带有的微生物，排出胶粒内的空气。4凝胶色谱柱的装填在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。(1)在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。(2)在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。5蛋白质的分离滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。根据红色区带的移动状况判断收集流出液的时间。4D洗涤红细胞的目的是去除血浆中除血红蛋白以外的杂蛋白；洗涤时离心速度过大，时间过长，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果；洗涤过程选用0.9%的生理盐水。