高效液相色谱法测定食醋和酱油中苯甲酸钠和山梨酸钾含量.docx
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高效液相色谱法测定食醋和酱油中苯甲酸钠和山梨酸钾含量
高效液相色谱法测定食醋和酱油中苯甲酸钠和山梨酸钾含量
HPLCinsoysauceandvingarsodiumbenzoatepotassiumsorbercontent
学生姓名：
XXXX学号：
XXXX班级：
XXXX指导老师：
XXXXXX
摘要：
[目的]用高效液相色谱法测定食醋和酱油中苯甲酸钠和山梨酸钾含量。
【方法】采用RP-HPLC法以HypercloneBDSC18柱（150×4.60nm,5um,phenomenex）为色谱柱；流动相：
甲醇：
0.02mol/l乙醇胺（20:
80）；柱温25℃，流速0.8mol/min，检测波长230nm，进样量（标准进样量：
2.5，5，7.5，10，15ul；样品进样量:
5ul）。
【结果】：
酱油中的苯甲酸钠含浓度为0.0794ug/ul；山梨酸钾为0.2798ug/ul；醋中未出现山梨酸钾、苯甲酸钠
Abstract:
[purpose]withhigh-performanceliquidchromatography（HPLC）insoysauceandvinegarandsodiumbenzoatesorbicacidpotassiumcontent.【methods】theRP-HPLCmethodwithHypercloneBDSusingC18column（150x4.60nm,5um,phenomenex）forchromatographiccolumn;Mobilephase:
methanol:
0.02mol/lethanolamine（20:
80）;Thecolumntemperature25℃,velocity0.8mol/min,detectedwavelength230nm,intothesampleweight（standardsamplequantity:
2.5,5,10,15,7.5;thesamplesintothesampleweightul:
5ul）.【results】:
Sodiumbenzoate insoysauce with theconcentrationof0.0794ug/ul was0.2798ug/ul; potassiumsorbate; sorbicacidpotassium, no sodiumbenzoateinvinegar
结论：
高效液相色谱法具有高速、高效、高灵敏度的优点，所以数据准确，用外标法计算结果操作简单，计算方便，得出样品中苯甲酸钠的含量。
Conclusion:
highperformanceliquidchromatographywithspeed,highefficiency,highsensitivityofadvantage,soexactdata,withexternalstandardmethodcalculationresultssimpleoperation,easycalculation,concludedthatthecontentofsodiumbenzoatesamples.
关键词：
高效液相色谱法外标法苯甲酸钠山梨酸钾
Keywords:
highperformanceliquidchromatographyexternalstandardmethodsodiumbenzoatepotassiumsorbet
前言：
苯甲酸钠，化学式：
C6H5O2Na，是苯甲酸的钠盐，苯甲酸钠是很常用的防腐剂，有防止变质，延长保质期的效果。
山梨酸钾别名2,4-己二烯酸钾，是山梨酸的钾盐，也是防腐剂。
本实验采用RP-HPLC法对酱油和醋中的苯甲酸钠和山梨酸钾的含量测定，方法简便快速，实用于苯甲酸钠和山梨酸钾的定量分析。
1实验部分
1.1实验目的：
了解高效液相色谱仪基本结构和使用原理，以及初步掌握其操作技能。
学习高效液相色谱保留值定性方法和外标法的标准曲线测定方法。
学习RP-HPLC法对食品中苯甲酸钠和山梨酸钾的含量的测定方法。
1.2.1实验仪器：
仪器：
高效液相色谱仪【高压输液泵LC-6A，检测器SPD-10A，保温箱CPD-10AS，进样阀7725I】；电子天平【Sartorioucp225D】；纯水仪【MILLI-Q超纯水纯化系统】；超声波清洗机【KH-50B】。
1.2.2实验试剂：
1）色谱甲醇经滤膜0.45um过滤；
2）（1+1）氨水：
氨水与水等体积混合；
3）乙酸铵溶液0.02mol/L：
称取1.54g乙酸铵，加水溶解并定容至1000ml,经滤膜0.45um过滤；
4）碳酸氢钠溶液20g/L:
称取2g碳酸氢钠，加水至100ml，振荡溶解；
5）苯甲酸钠标准储备液1mg/ml：
准确称取0.10000g苯甲酸钠，加20g/L的碳酸氢钠5ml，加热溶解，移入100ml容量瓶中，加水定容之刻度线，作为储备液；
6）山梨酸钾标准储备液1mg/ml：
准确称取0.10000g山梨酸钾，加20g/L的碳酸氢钠5ml，加热溶解，移入100ml容量瓶中，加水定容之刻度线，作为储备液；
7）苯甲酸钠、山梨酸钾标准混合使用液：
取苯甲酸钠、山梨酸钾标准储备液各1.0ml，移入100ml容量瓶，加水定容之刻度线。
此溶液中含苯甲酸钠、山梨酸钾各0.01mg/ml。
经滤膜0.45um过滤。
1.3高效液相色谱条件
1）色谱柱：
C-18
2）不锈钢柱 150mm；
3）流动相：
甲醇：
乙酸铵溶液（0.02mol/L）=5:
95；
4）流速：
1.0ml/min；
5）柱温：
30℃；
6）波长：
230nm;
7）进样量：
2.5-5.0ul
1.4样品预处理：
量取10ml的待测样品，放入小烧杯中，温热，搅拌去除二氧化碳。
加（1+1）的氨水调价PH值约为7,加水定容至50ml。
使用前取1-2ml于小离心管中12000rpm离心，上清液经滤膜（0.45）过滤后进样，准备上机分析。
1.5实验过程及操作：
开泵20分钟，开检测器，进样分析（进样顺序：
先洗针，用有机水洗6次以上，再用水洗6次以上，吸样时针内不可有气泡，Load位置注入，Inject进样，保持针不动一分钟），取标准样量分别为：
2.5,5,7.5,10,15ul，酱油、醋各5ul，一次加入高效液相色谱仪，记录色谱图，分析实验数据。
操作过后关检测器，冲洗仪器，关输液泵。
2结果与讨论
2.1实验数据及处理：
2.1.1实验数据
表一 混标2.5ul中苯甲酸钠和山梨酸钾的数据
名称
峰号
保留时间
峰面积
苯甲酸钠
1
5.048
64942.6
山梨酸钾
2
6.982
105669.2
图一混标2.5ul中苯甲酸钠和山梨酸钾的色谱图
表二混标5.0ul中苯甲酸钠和山梨酸钾的数据
名称
峰号
保留时间
峰面积
苯甲酸钠
1
5.048
125686.3
山梨酸钾
2
6.998
204252.2
图二混标5.0ul中苯甲酸钠和山梨酸钾的色谱图
表三混标7.5ul中苯甲酸钠和山梨酸钾的数据
名称
峰号
保留时间
峰面积
苯甲酸钠
1
5.048
182998.3
山梨酸钾
2
6.982
297282.2
图三混标7.5ul中苯甲酸钠和山梨酸钾的色谱图
表四混标10.0ul中苯甲酸钠和山梨酸钾的数据
名称
峰号
保留时间
峰面积
苯甲酸钠
1
5.032
256916.1
山梨酸钾
2
6.965
417186.7
图四混标10.0ul中苯甲酸钠和山梨酸钾的色谱图
表五混标15ul中苯甲酸钠和山梨酸钾的数据
名称
峰号
保留时间
峰面积
苯甲酸钠
1
5.032
380525.5
山梨酸钾
2
6.948
618036.6
图五混标15ul中苯甲酸钠和山梨酸钾的色谱图
表六酱油中的苯甲酸钠和山梨酸钾数据
名称
峰号
保留时间
峰面积
苯甲酸钠
13
4.982
236892.7
山梨酸钾
17
6.873
1101346
图六酱油的色谱图
表七醋中的苯甲酸钠和山梨酸钾数据
名称
峰号
保留时间
峰面积
苯甲酸钠
山梨酸钾
图七醋的色谱图
2.1.2数据处理
表八混合样品中苯甲酸钠
进样体积
保留时间
峰面积
2.5
5.048
64942.6
5
5.048
125686.3
7.5
5.048
182998.3
10
5.032
256916.1
15
5.032
380525.5
图八混合样品中苯甲酸钠中的标准曲线
由图可知，标准品中苯甲酸钠的线性回归方程为y=3E+06x–1182.4，R2=0.9989
表九混合样品中山梨酸钾
进样体积
保留时间
峰面积
2.5
6.982
105669.2
5
6.998
204252.2
7.5
6.982
297282.2
10
6.965
417186.7
15
6.948
618036.6
图九混合样品中山梨酸钾的标准曲线
由图可知，标准品中山梨酸钾的线性回归方程为y=4E+06x–1724.5，R2=0.9989
由上述标准曲线可知酱油中的苯甲酸钠含浓度为0.0794ug/ul；山梨酸钾为0.2798ug/ul；醋中的山梨酸钾为0ug/ul苯甲酸钠为0ug/ul
名称
苯甲酸钠
山梨酸钾
酱油
0.0794ug/ul
0.2798ug/ul
食醋
无
无
3结果与分析
3.1通过测单标判断先出峰
实验取山梨酸钾标准液5ul进行进样，目的是由山梨酸钾的保留时间判断山梨酸钾、苯甲酸钠哪个先出峰以区分混合样以及样品中的山梨酸钾、苯甲酸钠。
通过山梨酸钾标准溶液的流出曲线峰图知山梨酸钾的保留时间在6.5-7min之间，由此可以定性分析先出峰是山梨酸钾还是苯甲酸钠。
3.2判断混标中山梨酸钾与苯甲酸钠的峰
以5ul混合样所得的标准溶液所得的标准曲线和流出曲线为例，进行分析：
由图2可知在测定10ul混合样标准溶液曲线时出现了2个峰，已知山梨酸钾标准溶液保留时间大概为6.5-7min之间，对应表2知第2个峰为苯甲酸钠，保留时间为6.998min，第1个峰为苯甲酸钠，保留时间为5.048min，山梨酸钾、苯甲酸钠的色谱峰型好，已完全分离。
3.3判断醋、酱油样品中是否含苯甲酸钠和山梨酸钾及计算其所含的量
由混标中苯甲酸钠峰的保留时间,对应酱油中的峰的保留时间，可推得13号峰为苯甲酸钠峰，峰面积为236892.7，然后将峰面积带入线性方程y=3E+06x–1182.4,得酱油实际含苯甲酸钠的浓度为0.06693ug/ul。
同样可知第17号峰为酱油中的山梨酸钾，峰面积1101346，然后将峰面积的数值带入线性方程y=4E+06x–1724.5,得酱油中山梨酸钾的实际含量为0.2798ug/ul。
同理可算得醋中不含山梨酸钾和苯甲酸钠。
3.4苯甲酸钠和山梨酸钾各自的理论塔板数选择因子以及它们的分离度
理论塔板计算公式：
n=16（tR/Y）2,其中tR是保留时间，Y为峰底宽度；选择因子计算公式：
a=tR’/t0,其中tR1’为相对保留时间，t0为死时间；分离度计算公式：
R=2（tR2-tR1）/（Y1+Y2）。
代入数据可求出苯甲酸钠和山梨酸钾各自的理论塔板数、选择因子以及它们的分离度。
数据统计如下表：
分析物
峰宽（min）
理论塔板数
选择因子
分离度
苯甲酸钠
0.35
3155.23
0.705
3.45
山梨酸钾
0.75
761.55
1.365
4.结论
根据色谱图可以看到有些峰有轻微的拖尾现象。
可能由于系统内的死体积大，样品在色谱柱上有吸附。
针对这一现象，我们可以尽量减少流动柱管线的死体积，使用洗脱更强的流动相。
保留时间呈逐渐减小的趋势，可能是由于色谱柱老化、流动相或色谱柱被污染造成保留时间漂移现象。
可以从标准曲线看出，样品进样量和峰面积呈线性关系，即呈正比。
从实验中发现，醋中几乎不含苯甲酸钠和山梨酸钾。
苯甲酸钠和山梨酸钾分离度为3.45，分离程度比较理想，从而说明选择性和柱效都比较好。
从计算结果看，测量时样品的理论踏板普遍偏小，说明柱效不好。
可通过降低移动相的流速，减少固定相的量，减小固定相的颗粒度，选用低粘度的移动相，适当提高柱温,尽量减小停滞移动相的体积等来提高，同时注意检查流动相是否被污染，其也可导致柱效不好。
选择因子很小，说明柱的选择性不好，分离度不好。
同理，可以通过改变固定相和流动相的性质和组成，降低柱温，改用四元高压梯度洗脱等方法进行增大选择性和分离度。
平行测定的数据存在误差，主要原因是误差的主要来源：
人员误差；操作误差；仪器误差。
参考文献：
【1】王新运，万新军，程乐华，吴凤义.高效液相色谱法同时测定酱油中的苯甲酸和山梨酸[J].《应用化工》.2012，39（9）
【2】张卫佳，蒋其斌，夏天兰.高效液相色谱法测定食醋中的苯甲酸和山梨酸[J].《食品工程》.2007，（4）
【3】林玲，杨春亮，黎珍莲，査玉兵，程盛华.高效液相色谱法测定牛奶中的苯甲酸、山梨酸和糖精钠[J].《广东农业科学》.2008,（12）
【4】霍艳敏，王骏，张卉，祝建华，刘艳明，王艳丽，宿淑芳.高效液相色谱法同时测定冰淇淋中的10种合成色素[J].《分析测试学报》.2011，
【5】刘渭萍，李明，孙蕊.高效液相色谱法快速测定酱油、醋中的苯甲酸钠和山梨酸钾.辽宁化工，2004,33（7）:
422
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