流式检测凋亡的讨论.docx

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流式检测凋亡的讨论

流式检测凋亡的讨论

关于凋亡的流式检测

wanhood

一　PI单染色法

基本原理

　　其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。

这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：

1.  细胞核的改变：

由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。

研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。

许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。

2.  光散射特性：

凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。

在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。

在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。

此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。

细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。

但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。

因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。

根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。

也可用于活细胞的分类。

试剂与仪器

PBS溶液（配制方法见附录）；

PI染液：

将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。

用棕色瓶4℃避光保存。

70%乙醇

400目筛网

流式细胞仪

实验步骤

1.  收集细胞｛数目约（1~5）×106个/mL｝，500~1000r/min离心5min，弃去培养液。

2.  3ml　PBS洗涤1次。

3.  离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。

4.  离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。

5.  400目的筛网过滤1次，500—1000r/min离心5min，弃去PBS。

6.  用1ml　PI染液染色，4℃避光30min。

7.  流式细胞仪检测：

PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。

8.  结果判断：

在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关；在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。

如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准，两者分别为0.35和0.7，可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。

注意事项

　　细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。

在分析结果时应该注意。

二  Heochst33342/PI双染色法

基本原理

　　经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的DNA可染性性下降。

细胞一经固定就不再是活细胞，而且细胞固定过程对细胞膜的通透性也有影响。

因此发展了用“细胞活性”鉴定染料染色的流式细胞仪检测方法。

这些方法细胞不经固定就直接用DNA染料染色，且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多。

流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”，因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。

活细胞染料如Hoechst33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。

Hoechst33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高，Hoechst33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透性发生改变有关，凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变，但细胞膜的通透性已有增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst33342比正常细胞的多。

此外，还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。

既然Hoechst33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染，坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被这些染料染色。

根据这些特性，用Hoechst33342结合PI或EB等染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。

在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：

正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst33342+/PI++）。

试剂与仪器

lHeochst33342染液：

用PBS配成10ug/ml的储存液浓度，4℃避光保存；

PI染液：

用PBS配成5ug/ml浓度，4℃避光保存。

400目的筛网

流式细胞仪

实验步骤

1.  悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst33342，终浓度为1ug/ml；37℃孵育7—10min。

2.  低温500~1000r/min离心5min弃去染液。

3.  加入1.0mlPI染液，4℃避光染色15min。

4.  400目的筛网过滤1次。

5.  流式细胞仪分析：

Heochst33342用氪激光激发的紫外线荧光，激发光波波长为352nm，发射光波波长为400~500nm，产生兰色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光。

分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。

6.  结果判断：

在兰色荧光对红色荧光的散点图上，结果为：

正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。

注意事项

1.  在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。

2.  用Heochst33342染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min之内为宜。

如果太长可引起Heochst33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。

三  AnnexinV/PI双染色法

基本原理

细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。

这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。

PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。

AnnexinV是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，AnnexinV具有易于结合到磷脂类如PS的特性。

对PS有高度的亲和性。

因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。

PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。

两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。

因此，可以建立一种用AnnexinV结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。

试剂与仪器

孵育缓冲液：

10mmol/LHEPES/NaOH，PH7.4，140mmol/LNaCl，5mmol/LCaCl2

标记液：

将FITC-AnnexinV（宝灵曼公司产品）和PI加入到孵育缓冲液中，终浓度均为1ug/ml

流式细胞仪

实验步骤

1.  细胞收集：

悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×106，/mL　500~1000r/min离心5min，弃去培养液。

2.  用孵育缓冲液洗涤1次，500~1000r/min离心5min。

3.  用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。

4.  500~1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。

5.  加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。

6.  流式细胞仪分析：

流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。

7.  结果判断：

凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。

细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。

因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。

正常活细胞与此相似。

在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。

可能存在一下几种原因:

1、首先是细胞方面:

（1）细胞状态不好（衰老）

（2）流式细胞仪前细胞处理时间过长,如消化后细胞放置时间长,固定不好.

（3）离心过度等

2、检测试剂问题:

过期等.试剂染色时间过长等.

3、流式细胞仪:

（1）参数设置不是优化的,可以用正常人血检测机器.

（2）如果是AnnexinV/PI双染色法,存在最后结果划线不准问题.

（3）如果PI单染色法,存在没有找到正确的凋亡峰等.

PI染色后，流式细胞仪检测调亡的原理

hanglh：

PI染色后，用流式细胞仪检测调亡的原理，及该看点哪些参考书籍和文献。

大灵通：

实际上用PI染色根本分不出凋亡还是非凋亡性死亡，只是都按凋亡算了而已，因此用PI染色所得的凋亡率要大于实际凋亡率。

zbbnet：

细胞固定后用PI染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系。

由于凋亡细胞核酸内切酶活化，DNA降解，细胞DNA减少，因而可在G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是凋亡峰。

lard：

除左跑gel之外最平就是他了.（PI一個flowsample才RMB0.6,不計机的錢）。

其實跑gel+PI已夠說明那東西是會引起apoptosis。

用antibody/kit都是另有要求.

shaman3：

其实，PI分不清晚期凋亡和已经死的细胞，在做有关凋亡的流式检测的时候利用的是磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）

　　磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中（图3）。

Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。

将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶（propidineiodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。

因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

lard：

PI是間接了點,但PI+跑gel是沒有方法中的方法。

去ncbi找一找,很多paper也是用PI+跑gel罷了.

DONGHAIJU：

参考军事医学科学出版社出版的细胞凋亡的分子医学，胡野，凌志强，单小云主编

肠组织匀浆流式细胞检测凋亡的方法

coldant:

请问：

肠组织匀浆流式细胞检测凋亡的方法

schoman:

组织检测凋亡还是很难的。

匀浆后大部分细胞容易受破坏，应用于流式检测不合适。

关于AnnexinV-FITC和PI双染流式检测方法

fjmusy:

我要使用AnnexinV-FITC和PI双染的流式检测，需要送到我们医院的流式实验室去由他们做。

可是他们没有做过AnnexinV-FITC的，只做过PI单染的。

1、不知道这样双染和只有PI的有什么差别吗？

2、在送检时对标本的量要求多少？

3、结果如何分析？

是否要做二倍体（这是什么？

说明什么？

）分析？

zhaoqingshan:

以前我做过一些，大致如下：

细胞要活的，不能固定，你可以用宝赛的试剂盒（电话是是82020225，我刚好也打算做了，身边就放了一张名片），里面有详细的说明。

有些记不情了，细胞是消化下来后，直接加上两种荧光染料，孵育，离心洗去多余的染料，然后上机检测，因为是活的细胞，尽量做到随做随测。

结果计算凋亡细胞、死细胞、活细胞的比例或者个数就可以了。

它分为四个象限，每个象限代表的不一样

conanthird:

下面是两种染色的原理：

磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中（图3）。

Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。

将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶（propidineiodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。

因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

方法

1、悬浮细胞的染色：

将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ulBindingBuffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ulBindingBuffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

2、贴壁培养的细胞染色：

先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

3、爬片细胞染色：

同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

注意事项

1、整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。

2、操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。

drake015:

晶美代理benderAnnexinV-FITC试剂盒

目录号：

LHK601-100

储存温度：

2-8℃

规格：

100Tests

有效期：

见外包装盒

试剂盒组份

1、结合缓冲液4x（BindingBuffer4x）：

体积：

20ml（4倍浓缩液）；

稀释后溶液中各组分浓度：

10mMHepes/NaOH,pH7.4,140mMNaCl,2.5mMCaCl2

2、碘化丙锭溶液（PropidiumIodide）体积：

1.0ml；浓度：

20ug/ml

3、重组人AnnexinV/FITC,（rhAnnexinV/FITC）

来源：

大肠杆菌（E.coli）

分子量：

35.8KDa

样品量：

0.5ml，可用于100次实验

保存方法：

于50mMTRIS,100mMNaCl,1%BSA,0.02%NaN3,pH7.4溶液中保存

纯度：

SDS-PAGE及反相HPLC表明纯度大于98%

生物活性：

AnnexinV可结合于磷酯酰丝氨酸并表现出抗磷酯酶活性

应用：

标记的AnnexinV可结合流式细胞仪用于检测细胞外膜上的磷酯酰丝氨酸，操作流程如下：

1、  用去离子水按1:

4稀释结合缓冲液（20ml结合缓冲液+60ml去离子水）；

2、  PBS充分洗细胞，取总数约为5-12.5×104的细胞待测；

3、  用250ul结合缓冲液重新悬浮细胞并使其浓度为2-5×105/ml；

4、  取195ul的细胞悬液加入5ulAnnexinV/FITC;

5、  混匀后于室温避光孵育10分钟；

6、  用190ul的结合缓冲液洗细胞一次；

7、  用190ul的结合缓冲液重新悬浮细胞；

8、  加入10ul20ug/ml的碘化丙锭溶液（终浓度为：

1ug/ml）;

9、  流式细胞仪（FACS）分析.

实际应用时和使用单位的具体用法有关，最好先去和医院fcm操作者联系一下，核实细胞数、加染色剂的时间以及其他特殊要求。

操作者一般都会给出分析结果。

具体也可以和操作者联系，可以详细询问，这里不罗嗦。

我用的就是晶美的产品，就我个人的操作这方面已请教了许多人。

仅看产品说明书上的操作步骤还是不行的，不够细。

比如最基本的是在冰浴中操作就没有提到。

但是现在我的麻烦在于流式细胞仪的操作者不知道双染和PI单染的操作有什么差别，所以不愿意给我作

cyc1sbs5:

单染和双染在使用流式细胞仪时的区别在于双染时需调整两种染料间的补偿,不过着需要一定的经验,你最好还是找有经验的人做吧

dhplc:

thedifferencebetweensinglestaininganddualstaininannexinvanalysisliesontheprecisionoftheresultsyouobtainedand,asmentionedabove,youmustdoacomplexcompensationindualstaining.butanyexperiencedflowcytometrystaffhasnoproblemindoingso.

astoyourissue,ithinkit'snotyoubuttheflowcytomertystafftothinkofthistenichologicalstuff.ifhehavenotsuchknow-howofsettingflowcytometer'scompensationandstillhaveinterestsi'dliketogivesomestartinformations.

fjmusy:

我请教了精美的技术人员,确实就如cyc1sbs5说的那样,需要调补偿,也就是图象所在象限的调节吧.

killwhale：

我准备将载体转染到细胞后检测细胞的凋亡情况，看了坛子里的介绍，方法有很多，我想用流式双染和DNAladder两种方法来测。

但是流式检测的细胞数较高，一般细胞转染用x10的4次方的细胞就够了，但流式检测需要的细胞量远大于10的4次方。

请问：

1、  流式检测（AnnexinV和PI双染）需要的细胞数最低多少？

2、  载体转染后，应该多久测细胞的凋亡比较好？

iceblue909:

流式检测（AnnexinV和PI双染）需要的细胞数最低大概要1×105，最好1×106，一个六孔板差不多就够了。

长江:

流式检测（AnnexinV和PI双染）的方法：

1.收集细胞，至少要1.0×105，PBS或Bindingbuffer洗涤。

2.用Bindingbuffer重新悬浮细胞，需要的量为1.0×105/100ul。

3.加AnnexinV和PI，室温避光孵育15分钟，并摇动。

4.一小时内检测。

至于载体转染后，应该多久测细胞的凋亡，应根据你实验所采用的诱导细胞凋亡的试剂或药物而定。

wkai:

请问采用AnnexinV与PI双染色（流式细胞仪）检测凋亡，操作是否困难？

标本若是组织，如何处理？

有特殊要求吗？

另外，AnnexinV与PI是否需分开购买？

有相关试剂盒吗？

经费需要多少？

biowind:

流式细胞仪能测组织吗？

思考中........

gogowl：

不困难，有试剂盒卖。

成套试剂盒20次的大概1400元左右，单独买很难搞到AnnexinVbidingbuffer。

midas:

组织进行流式细胞好像没有听说过，但是体内组织进行凋亡检测地方法也很多：

如tunnel法，DNAladder，caspase活性检测等等。

wkai:

我在文献上看到有研究将组织分离为细胞进行流式细胞仪检测，只是没有具体方法，不知是否好做。

fjmusy:

我要用流式检测贴壁的甲状腺细胞凋亡情况，使用光镜，和PI、AnnexinV双染色流式细胞仪检测。

灵敏度？

可信度？

价格？

操作烦琐吗？

总之，对硕士研究生来说，这种方法好吗？

还是有更好的方法？

qingshi:

AnnexinV最可行,应用AnnexinV-FITC/PI双染色法是目前检测凋亡的最敏感的方法之一，能检测出早期凋亡细胞，并区分出坏死细胞.

美国著名生物试剂公司CLONTECH和INTERGEN公司分别开发了多种标记的AnnexinV产品，简便快速，10分钟就可完成检测。

其中带荧光标记的AnnexinV-EGFP（EnhancedGreenFluorescentProtein）及AnnexinV-FITC，灵敏度高，可作为FACS（流式细胞分选）方法筛选凋亡细胞的基础。

由于融合蛋白AnnexinV-EGFP，EGFP与PS的结合比例为1：

1，还可进行定量检测。

除此之外，还提供生物素偶联的AnnexinV，可通过常用的酶联显色反应来检测。

另外，MACS公司将磁珠包被AnnexinV，可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。

因为PI法适用于死细胞（固定细胞）的细胞周期检测较好,对于凋亡,只能看出后凋亡,前凋亡无法看出.而AnnexinV是直接对活细胞检测,前后凋亡都可检出.

handshealing:

其实我觉得用PI单染就可以了，老外作流式也是用PI单染的，操作也挺方便的！

如果经费有限不妨考虑！

ANNEXINFITC:

不是说AnnexinV-FITC是检测凋亡的金标准吗？

我干了一年多了还是零。

有哪位做过流式AnnexinV-FITC检测凋亡的高手能给指点一下迷津？

我原本是要做去甲肾上腺素诱导凋亡的，用AnnexinV-FITC来检测，可是不论用到多大量的去甲，心肌细胞看起来仍是活蹦乱跳的，AnnexinV-FITC也做不出结果。

这是国外文献有做不少的，然而我做不出来。

我是这么做的：

原代培养的心肌细胞（约500000个细胞/孔，12孔板）状态良好后低血清（1％FBS）培养24h,加入去甲肾上腺素，再培养24h，然后按说明书操作在流式细胞仪检测细胞凋亡率。

看人家写的很简单，可是把去甲的浓度都加多100倍了，也得不到阳性结果！

我不知道到底哪里错了，是最后AnnexinV-FITC的操作有错？

还是去甲用的不对？

还是加的方法不对？

总不会是它本来就没这作用，人家老外都撒谎吧！

？

hdhdhd0000:

我没做过，但，问：

1、老外是不是用的心肌细胞？

2、去甲是否失效？

3