一级菌种制作技术Microsoft Word 文档.docx

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第二章制种技术

第二节一级菌种制作技术

一、概述

1．概念

一级菌种：

是第一次用孢子分离法、组织分离法或基内菌丝分离法获得的纯菌丝体及其经过转管扩大后的菌丝体。

2．用途及要求

在食用菌生产中，一级菌种主要用于扩大繁殖成二级菌种，再由此扩大繁殖成三级菌种，供栽培用。

因此，一级菌种是菌种生产的基础，一级菌种质量的优劣，直接关系到二级菌种和三级菌种的质量，对食用菌生产产生根本的影响。

因此，要求一级菌种必须纯度高，质量好。

3、制种过程

一级菌种的制作过程，主要包括下列几个程序：

培养基的配制à培养基的灭菌à菌种的分离à纯化（提纯）à转管扩大à培养à一级菌种

二、一级菌种培养基的配制

（一）基本要求

营养成分：

要想培养出优良的一级菌种，必须提供优良的培养条件，首先是营养条件。

一级菌种培养基必须营养全面且易于吸收。

容器：

一级菌种培养基通常用玻璃试管作容器，按不同的配方加上琼脂凝固剂，制成琼脂斜面培养基，又叫斜面培养基，简称斜面。

斜面：

斜面培养基平整光滑，一级菌种在斜面上培养，利于观察菌丝生长情况，又便于检查有无杂菌生长。

用途：

斜面培养基主要用于一级菌种的分离、培养、提纯和保藏菌种等。

此外，也可用培养皿或三角瓶作容器，制成玻璃平板培养基，主要用于菌种的分离、培养和提纯等。

（二）一级菌种培养基常用的材料

在配制一级菌种培养基时，选用的原材料要具备以下二个条件：

一是要能满足食用菌的营养需要；二是所用原材料来源广，成本低。

一级菌种培养基常用的材料有：

马铃薯、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母膏、黄豆饼粉或黄豆粉，KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、VB1等；琼脂（凝固剂）；2%的HCl溶液，2%的NaOH溶液。

琼脂（又称洋菜）：

是一级菌种培养基常用的凝固剂，是由红藻中的石花菜提取出来的半乳糖、杂多糖的硫酸酯。

琼脂的特点：

①性能稳定，不能被一般微生物分解，仅仅起凝固作用。

②大约96℃熔化为溶胶，40℃以下时又重新凝固成透明的胨胶，而且反复熔化、凝固不会改变其性能。

③一般培养基的琼脂用量为2%。

根据使用的目的和季节变化，用量在1.8%～2.3%之间。

夏季气温高，蒸发量大，琼脂用量可适当多些，冬季可适当减少用量。

（三）一级菌种培养基常用的配方

1．常用配方

PDA培养基PSA培养基

马铃薯（去皮）200g马铃薯（去皮）200g

葡萄糖20g蔗糖20g

琼脂18～23g琼脂18～23g

水1000ml水1000ml

这是食用菌一级菌种最常用的培养基，适用于大部分食用菌菌种的分离、培养与保藏。

它既是一种广泛培养基，又是一种基础培养基（即以PDA或PSA为基础，添加适量的其它物质，便能衍生出一系列的培养基）。

注：

有关一级菌种的培养基配方众多，可参考课本或其它专业书籍。

2．一级菌种培养基配方设计

从上述培养基配方中可看出，组成一级种培养基的材料大致可分为四种：

①天然的有机物：

如马铃薯、黄豆粉、玉米粉、黄豆芽、松针等。

应选择新鲜、无霉味、无虫蛀、无变质的优质材料，经热浸提后取滤液入料，为食用菌生长提供全面的营养。

②可溶性的有机营养制剂：

如麦芽浸膏、酵母浸膏、蛋白胨、蔗糖、葡萄糖等。

主要是为食用菌生长提供优质的碳源和氮源，要求纯度高，保藏良好。

③矿物质：

如KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、CaCO3、CaSO4等。

多在改良培养基或综合培养基中作为食用菌对矿物质需求的补充剂，同时对培养基物理性状的改良起重要作用。

其用量为0.01%～0.5%。

④琼脂：

是固化培养基最常用的凝固剂，一般用量为2%。

实际工作中，常因制种季节不同，分离途径不同，培养对象不同，琼脂的用量也不同（用量在1.8%～2.3%之间变动）。

如：

孢子分离：

需要吸水膨胀，少用琼脂à冷凝水；

组织分离：

多用琼脂à培养基表面宜干à避免污染

（四）一级菌种培养基的配制

一级菌种培养基配方较多，原料较多，但制作方法大致相同，其制作过程如下：

补充内容——平板培养基的制作

平板培养基常用于单孢分离，测定菌丝生长速度，观察菌落的形态，拮抗实验，测定接种空间杂菌数。

制作方法：

①将培养皿洗净、干燥，使各培养皿盖方向一致，用牛皮纸包好，或放入特制铁罐内，注明皿盖的方向。

高压灭菌或干燥灭菌后备用。

②取刚灭菌后尚未凝固的培养基置于无菌箱或超净工作台内，略打开灭菌过的培养皿盖（露一小缝），倒入培养基（厚度为0.5cm），封盖、冷凝，倒置备用。

三、一级菌种培养基的灭菌

（一）消毒与灭菌的概念

灭菌：

是应用物理和化学方法杀灭物品表面和内部所有的微生物，是一种彻底的灭菌方法。

消毒：

是应用物理和化学方法使欲消毒的物品表面和孔隙内绝大部分微生物致死，是一种不彻底的灭菌方法。

（二）消毒与灭菌的方法

1、常用的灭菌方法

2、常用的消毒方法

（三）一级菌种培养基的灭菌

1．灭菌设备：

手提式高压灭菌锅

2．具体灭菌要求：

1.1kg/cm2，121℃，保持20~30min。

3．操作过程

加水à装锅à盖盖à加热à当压力升为0.5kg/cm2时排放冷空气à正式升压à保压（1.1kg/cm2，121℃，保持20~30min）à停止加热à自然降压至零à排放余汽à开盖à取出灭菌物品à趁热摆斜面à检验灭菌效果（32℃空白培养48h）。

四、菌种分离

（一）菌种分离的概念

在自然界中各种微生物无处不在，无孔不入，即使是生长正常的食用菌子实体表面也带有大量的微生物。

为了获得高纯度的食用菌菌种，必须排除杂菌的污染，把食用菌从微生物环境中分离出来。

这个过程就是菌种分离。

菌种分离：

就是用无菌操作的方法将所需要的食用菌从混杂的微生物群体中单独分离出来的过程。

通过菌种分离得到的纯菌丝体即为一级菌种。

（二）菌种分离的关键

菌种分离是一项重要而又细致的工作，每一个环节都必须严格按无菌操作规程进行。

无菌操作（概念）：

任何一个操作过程都要注意避免把其它任何无关的菌体带入到培养基中。

要做到无菌操作，必须注意二点：

1．严格树立无菌观念；2．严格遵循无菌操作规程。

无菌操作规程主要有以下四点：

①任何操作必须在无菌条件下进行。

②任何操作器具都必须经过消毒处理。

③任何一种培养基开口时，都必须倾斜向下，并用火焰封口。

棉塞也应适当燎烤后再塞回试管。

④任何操作必须做到快、准、稳。

（三）菌种分离的设备

1．接种箱：

操作规程

2．净化工作台：

操作规程

3．接种室：

操作规程

（四）菌种分离的方法

食用菌的分离方法很多，常用的有组织分离法、孢子分离法和基内菌丝分离法三种。

1．组织分离法

（1）概念

组织分离法：

将食用菌的部分组织移接到斜面培养基上获得纯培养的方法。

（2）特点：

①属于无性繁殖，能保持原有菌株的优良种性，是获得纯菌种的常用方法，且简单易行。

②适用于大型肉质子实体，适用于孢子不易萌发的菌类。

③若种菇感染病毒，不易脱毒。

（3）操作过程（以伞菌类为例）

种菇选择（优良品种；色、形正常，生长健壮，无病虫害；含水量少）

↓

种菇消毒（用75%酒精棉球擦拭子实体或用0.1%升汞溶液浸泡1～2min，再用无菌水冲洗）

↓

切取组织块（无菌操作）

↓

移接组织块至斜面中央（无菌操作）

↓

培养（25℃左右）

2．孢子分离法

（1）概念

孢子分离法：

利用子实体产生的成熟有性孢子分离培养获得纯菌种的方法。

（2）特点

①属于有性繁殖，后代易发生变异，可用此法培育新品种。

②分离过程较复杂，适用于胶质菌类和小型伞菌。

（3）操作过程：

指导看书

孢子的采集（孢子弹射法、菌褶涂抹孢子法、孢子印采集法、空气孢子捕捉法）

↓

孢子的分离（多孢分离法—用于异宗结合的菌类；单孢分离法—用于同宗结合的菌类。

）

↓

孢子的萌发（20～30℃，孢子萌发受多种因素影响）

3．基内菌丝分离法（基质分离法）

概念：

从生长子实体的培养基中分离菌丝获得纯培养的方法。

特点：

易感染杂菌。

基内菌丝分离法一般只在下列情况下采用：

①子实体已腐烂，但又必须保留该种菌种。

②有些子实体小而薄，用组织分离法和孢子分离法较困难。

③还有一些菌类如银耳菌丝，只有与香灰菌丝生长在一起才能产生子实体，如果要同时得到这两种菌丝的混合种，也只能采用基内菌丝分离法进行分离。

五、菌种的纯化

一级菌种的纯化：

是指对分离获得的菌种进行再提纯，成为生产所需要的菌种的方法。

在实践中，无论采用哪种分离方法，都不排除杂菌污染的可能性，如果巳确定被污染可以采取以下措施纯化。

1．菌丝的再提纯

正常的菌种在固体培养基上，菌丝逐渐向四周呈辐射状生长，边缘整齐一致，菌丝浓密健壮。

如果被杂菌污染，则菌丝生长不一，菌落边缘参差不齐，培养基内会产生各种色素，并发出臭味。

如果有必要采用这种菌种，就必须进行再提纯。

再提纯时，可选用菌落生长速度较为一致的菌丝体作为再提纯对象，用消毒的接种铲切取菌丝的前端部分（连同培养基一起），转移到新的培养基上培养。

如果菌丝生长稀疏，如草菇，也可采用单根菌丝分离法，即在低倍镜下选择单根菌丝，用锋利的接种针，极仔细地将贴在固体培养基上的单条菌丝带小量培养基切下，移到新的培养基中培养。

经过几次的切割移植，逐渐挑选生长良好的无杂菌菌株，从而获得纯菌种。

2．污染物的排除

在菌种分离后，细菌、霉菌的污染时有发生，必须加以排除。

一般来讲，被杂菌污染的菌株不再使用。

但有时由于菌种紧缺，并且污染物不多，也可用灭菌滤纸浸在1％的多菌灵溶液中，然后取出覆盖于霉菌的生长点上，以防止分生孢子的扩散，然后用接种铲切取一小块远离杂菌的健壮菌丝移至新的斜面培养基上培养。

如果是细菌污染，细菌的菌落比较局限，并不会出现细胞飞扬现象，因此，可以先用接种铲将细菌菌落连同培养基一起取出来，再从无菌部位取菌丝块转管一次，同样可以获得纯菌种。

六、出菇鉴定（试验）

出菇试验的概念：

是菌种投入生产前必须做的结实性鉴定试验。

出菇试验的目的：

进一步确定菌种，以避免菌种选育不当而造成不可估量的损失。

出菇鉴定的内容：

包括生产性状、商品性状、遗传性状三个方面。

七、一级菌种的扩大培养（转管）

一级菌种的扩大培养是在试管间进行的，因此又叫转管。

转管原因：

从外地购进或分离获得的母种数量有限，不能满足生产的需要时，要对初次获得的母种进行扩大繁殖，以增加母种数量。

转管数量：

一支母种可接15～20支试管斜面，扩大的数量根据实际情况而定。

注意事项：

母种的扩大繁殖不可无限制地移代，移代过多菌种生活力减弱，从而影响大面积栽培的生产效益。

操作过程：

（1）左手拿两支试管，一支为经灭菌的斜面，另一支为已长好的菌种。

右手拿接种钩（已在火焰上灼烧灭菌又冷却），并同时用右手轻轻拔下两支试管的棉塞或试管帽。

（2）将试管口通过火焰数次，并稍转动，以防环境中的微生物落入。

（3）首先将接种钩伸入有菌试管，连同培养基钩取直径为3～5mm的菌丝块，取出接种钩，迅速伸入另一灭菌斜面上并将菌丝块放在斜面的中央。

（4）烧试管口，塞好棉塞或盖好试管帽，如用胶塞，则不要烧试管口。

将接种钩烧一下，插到酒精瓶中。

注意：

如果是采用紫外线消毒法，原始母种要用报纸包扎好再进行消毒，以防辐射变异。

八、一级菌种的培养

培养条件：

25℃左右、干净、干燥、黑暗、通风

培养设备：

电热恒温培养箱

九、一级菌种的保藏

1．菌种保藏的目的：

菌种是重要的生物资源，是以微生物为对象的研究工作和生产必不可少的材料。

培育出—个优良的菌株很不容易，在长期的栽培和保存过程中，由于传代次数过多，培养时间过长，或因不利的外界环境条件的影响，常常会导致菌种衰退，丧失其优良性状。

因此，在一定的时间范围内要使菌种的生活力、纯度和优良性状稳定地保存下来，就必须采用相应的措施，做好菌种保藏工作。

2．菌种保藏（概念）：

是创造一个特定环境条件，降低菌种的代谢活动，使其处于休眠状态，在一定的保藏时间内保持原有的优良性状，防止菌种退化，降低菌种的衰亡速度，防止杂菌污染，而当使用时，提供合适的条件，能重新恢复正常生长繁殖。

3．菌种保藏的原理：

是采用干燥、低温、冷冻或减少氧气供给等方法，降低菌种的代谢强度，终止其繁殖，并保证原来菌种的纯度。

4．传统的保藏方法：

有继代培养低温保藏法，矿油保藏法，冷冻干燥保藏法，液态氨超低温保藏法等。

随着食用菌栽培的普及推广，近年来又出现了许多技术要求低，投资少、简便易行的保藏技术，如无菌水保藏法，谷物、木屑或木块保藏法，实用价值更大，适于推广。

继代低温保藏法

食用菌在适宜的温度范围内，温度越高菌丝的代谢能力越强，菌种越容易衰老。

低温保藏就是将培养好的菌株放在冰箱中低温保藏，降低其代谢强度，延长菌种的生活力。

同时也防止空气中的杂菌污染。

继代低温保藏的方法：

将要保藏的菌种接种于适当的斜面培养基上培养，待菌丝长满斜面后，选择无污染，菌丝健壮浓密的菌株，放在冰箱中低温保藏（一般要求温度在4～6℃）。

为了防止培养基的水分蒸发和杂菌的污染，应将若干支菌株用塑料纸包扎在一起再放入冰箱中。

以后每2～3个月转管一次。

菌种不能转代过多，转代过多会影响其生命力。

为了保证保藏的菌种不衰退，一般选用营养丰富的培养基如马铃薯琼脂培养基和麦芽汁培养基培养，最好在培养基中加入0.2％的磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或碳酸钙作为缓冲剂，以中和菌种在保藏过程中产生的有机酸。

继代低温保藏注意事项:

①定期检查。

如果发现保藏的菌种被污染应立即重新分离纯化。

②制种或转管时要贴好标签，以防搞乱。

③对不耐低温的菌种，如草菇在5℃时菌丝会死亡，应置于10～15℃下保藏。

继代低温保藏的缺点:

保藏时间较短，经常转管会造成误差和污染，遗传性状也容易在每次转管的过程中发生变异。

注：

其它的菌种保藏方法（自学、指导）

十、复习思考题

1．什么是一级菌种？

简述一级菌种制作的工艺流程。

2．一级菌种培养基常用的配方是什么？

简述其制作过程

3．名词解释：

消毒、灭菌、提纯。

4．如何对一级菌种培养基进行灭菌？

如何检验其灭菌效果？

5．什么是菌种分离？

菌种分离有哪几种方法？

6．简述组织分离法的操作过程。

7．为什么要进行出菇试验？

8．什么叫转管？

为什么要转管？

9．什么是无菌操作？

怎样才能做到无菌操作？