慢病毒生产及使用操作手册.docx

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慢病毒生产及使用操作手册

一、实验流程

制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。

二、实验材料

（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株

该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2,pMD2G,pHBLVTM系列质粒。

1、载体信息（见附录）

2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM（含10%FBS）。

贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

三、包装细胞293T细胞的培养

（一）293T细胞的冻存

随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；

2、加入%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。

3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL37℃预热的10％DMEM，用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6～8次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于eppendorf管中，加入450ul10％DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。

计数板上共4大格，每大格16小格。

计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。

4、细胞离心，1000rpm，5min。

去掉上清。

5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）,重悬细胞，密度为3x106个/ml。

6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。

7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。

保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。

（二）293T细胞的传代

当细胞生长到汇合率达到80%～90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

1、消化细胞，方法同细胞冻存。

2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。

3、根据具体情况，将细胞分到10cm培养皿中，每个培养皿补足到10ml培养基。

4、将培养皿平稳放回37℃、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。

（三）293T细胞的复苏

当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。

1、设置温度为37～42℃的水浴。

2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在1～2min内使细胞溶液完全溶解。

3、将细胞溶液转移到15ml离心管中，并在其中加上1ml新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000rpm，5min。

4、去掉上清，加入5ml新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入6cm培养皿。

5、将培养皿平稳放入37℃、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。

6、第二天观察细胞存活率。

给细胞换一下培养基。

以后每天观察细胞生长情况。

四、慢病毒包装和浓缩

（一）质粒扩增

构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于1ug/ul,A260/280在间方可用以包毒。

推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提。

（二）传293T细胞

将培养293T细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL4度冰箱取出的%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37度培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3mL37度水浴中预热的10％DMEM，移液枪用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。

之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于eppendorf管中，加入450ul10％DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。

计数板上共4大格，每大格16小格。

计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。

传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺900-1000万/T75；若第三天转染，铺350-400万/T75。

每瓶T75加10mL10％DMEM培养基。

转染当天观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。

转染前无需换培养基。

（三）做脂转complex

DMEM需在37度水浴中预热，LipoFiterTM转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。

转染每瓶T75的complex成分如下：

pspax

10μg

PMD2G

10μg

pHBLVTM系列载体

10μg

转染后6h换新鲜培液。

注：

LipoFiterTM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipoFiterTM说明书。

（四）病毒收集

转染后48和72h分别两次收集病毒上清（24h收集后置换新鲜培液），收集后以μm滤器过滤,于40mL超速离心管中，4℃，72000g/min离心120分钟；

（五）病毒重悬和保存

500ul新鲜培养液重悬病毒沉淀，置于-80度甚至液氮保存。

五、感染目的细胞

（一）细胞准备

将状态良好的目的细胞接种到24孔板，使细胞浓度为1×105/ml细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%直接。

（二）病毒感染

的选择：

Polybrene:

是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率2～10倍。

Polybrene有一定的细胞毒性，有的细胞对polybrene的毒理反应明显，因此细胞感染时是否适合polybrene需要摸索；不同细胞对polybrene的敏感度不同，可以用1～10μg/ml的范围筛选合适的浓度，以24h内细胞无明显毒性反应为佳，可参考文献并进行预实验摸索，polybrene最常用的工作浓度为6～8μg/ml。

注：

1）汉恒生物的自产的Polybrene产品，用户可用以进行辅助感染。

提供的Polybrene母液保存在-20℃（可保存1年以上），避免反复冻融3次以上，否则活性受影响。

4℃可保存2周。

2）Polybrene预实验请先以对照病毒进行摸索，部分细胞系MOI及Polybrene的使用参见附表2。

2.感染细胞最佳MOI的测定

MOI（MultiplicityofInfection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。

对于分裂活跃的细胞，比如Hela、293细胞，MOI=1～3时，80%以上的细胞均表达目的基因。

而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。

需要进行MOI梯度摸索实验，选择适合的MOI进行实验。

3.感染步骤

按实验需要将细胞铺板（比如12孔板）。

细胞数以第2天密度约50%为宜。

37℃培养过夜。

对于Polybrene可施加的细胞：

准备完全培养基和Polybrene混合物，Polybrene终浓度为摸索得到的最适终浓度。

移去培养基并添加mlPolybrene/培养基混合物于每孔中（适用于24孔板，其他孔板请相应调整体积。

）

对于不适用Polybrene的细胞，以上步骤省略，直接进入下面步骤。

感染前，从冰箱取出并在37℃水浴中快速融化病毒，吸去细胞原有培养基，加入1/2体积新鲜培养基，再将病毒原液加入细胞中，轻轻8字混匀。

（具体加入的病毒数可参考附表1）37℃小体积感染4小时，4小时后补齐培养基至正常体积。

（感染时培养基体积表格如下）

病毒小培养体积感染表

培养皿类型

表面积/cm2

对应细胞培养液体积

病毒感染对应细胞培养液体积

96-well

100ul

50ul

24-well

2cm2

500ul

250ul

12-well

4cm2

1ml

500ul

6-well

10cm2

2ml

1ml

60mm

20cm2

4ml

2ml

100mm

60cm2

10ml

5ml

慢病毒感染4小时后补足至培养体积，感染24小时后换液，腺病毒感染2小时后直接换液

感染后第二天（约24小时），吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37℃培养。

感染后48小时，对于带GFP报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测GFP表达效率，对于携带Puromycin抗性基因的病毒，换上含适当浓度的Puromycin的新鲜完全培养液，筛选稳定转导的细胞株（详见下方）。

注意：

溶化的shRNA慢病毒颗粒置于冰上。

反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。

抗性筛选：

Puromycin标准的施加终浓度范围为1～10μg/ml，不同细胞puromycin的工作浓度不同，请查找相关文献（部分细胞参考用量见下图），另外请设不感染筛选对照（未经过病毒感染的野生型细胞），加入等量等浓度的puromycin。

部分细胞puromycin参考值

Cellline

Species

Puromycin（µg/ml）

293

Human

HeLa

Human

B16

Mouse

1-3

Hamster

MC3T3-E1

Mouse

H9C2

Rat

MCF-7

Human

1-3

MDA-MB-×××

Human

1-3

HepG2

Human

HT1080

Human

A549

Human

H1299

Human

Humanembroyonicstemcells（HumanESCs）

Human

更多Puromycin使用浓度更新中，详情请参考公司网站……

每2-3天换含puromycin的完全培养液一次，至不感染筛选对照组细胞被puromycin杀光，可进行以下两步操作（依照具体实验需要选择）。

不挑取单克隆：

将感染并筛选后的细胞进行传代，并继续施加puromycin进行维持性筛选培养。

连续筛选并传3代后，冻存保重稳定细胞株。

挑取单克隆：

将感染并筛选后的细胞挑选至少5个克隆进行细胞扩增，，并继续施加puromycin进行维持性筛选培养。

扩增完毕后westernblot或者QPCR检测目的蛋白的表达。

挑取表达适中的稳定细胞株，连续筛选并传3代后，冻存保重稳定细胞株。

5.感染悬浮细胞

上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法，若是悬浮或半悬浮细胞，则需要通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养皿后，封好口，放入平角离心机后，低速（500g-1000g/min）离心1h，然后放入培养箱中正常培养即可。

若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，室温放置15min（不能超过半小时），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染过夜后换液即可。

6.对于极难感染的细胞

对于极难感染的细胞，如DC（树突状细胞）等，可采用多次感染的方法，即感染24小时后，更换新鲜病毒进行二次感染，可显著提升感染效率。

附1：

汉恒生物慢病毒质粒图谱

过表达

1.单标记

2.双标记

IRES载体

慢病毒过表达载体，ZSGreen/puro标记

T2A系列载体：

ZsGreen-T2A-PuroRFP-T2A-Puro

Luc-T2A-PuroZsGreen-T2A-Luc

RFP-T2A-luc

干扰

1.单标记

2.双标记

IRES系列载体

慢病毒shRNA干扰载体，ZSGreen/puro标记

T2A系列载体：

ZsGreen-T2A-PuroRFP-T2A-Puro

Luc-T2A-PuroZsGreen-T2A-Luc

RFP-T2A-luc

特殊用途

用于融合蛋白构建慢病毒载体启动子替换

Tet-onsystem慢病毒载体：

单病毒系统，无须另外表达rtTA，出毒率低，只做建系用，无法提供病毒

Tet-on过表达系统，目的基因插入MCS区，只在DOX存在下才表达，puro可持续表达，用于筛选

Tet-on干扰系统，应用mir30的sh-mir结构，与tuboRFP融合表达，加DOX时RFP和sh-mir结构启动表达，因此会看到加Dox后24小时有荧光出现；puro为持续表达，用于筛选

注意：

sh-mir合成非常贵

附2：

慢病毒滴度测定方法简介:

1、细胞准备

将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1x105/ml,加入96孔板，100ul/孔，为每个病毒准备6个孔。

放入37℃，5%CO2培养箱中培养。

2、加病毒

第二天，在EP管中做3倍梯度稀释，连续6个稀释度。

稀释方法如下：

每种病毒准备6个管，每管加入90ul培养液，往第一个管中加入10ul病毒原液，混匀后，吸取10ul加入第二个管混匀。

以此类推，做十个稀释度（10～3*10-3）。

3、追加培养液

第三天，吸去带有病毒的培养液，在每个孔中再加入100ul完全培养液，以利于细胞的生长。

4、观察结果并计算滴度

第五天，在荧光显微镜下观察结果。

滴度（PFU/ml）=细胞数*荧光百分比*MOI*病毒稀释倍数*103

附3：

汉恒生物目的细胞慢病毒感染复数（MOI）与体积对应表

规格

大约数目

MOI值

加入病毒数量

慢病毒

MOI摸索时加入的体积梯度/ul

96well

2-5×104

20-50

；12；20

48well

1-2×105

20-50

×107

20-100ul

20；60；100

24well

2-3×105

20-50

；120；200

12well

5×105

20-50

×107

100-250ul

100；300；500

6well

1-2×106

20-50

×108

200；600；1000

35mmdish

1-2×106

20-50

×108

200；600；1000

60mmdish

2-4×106

20-50

×108

400；1200；2000

100mmdish

6-10×106

20-50

×108

1200；3600；6000

150mmdish

1-2×107

20-50

×109

2-10ml

2000；6000；10000

慢病毒滴度以108/ml为准，其他滴度需相应换算;

大约细胞数目是根据80%～100%细胞密度估算而出，具体细胞数请种细胞时进行细胞计数。

注：

1）24板长满了细胞大约有3×105个细胞。

如果一天后要长到70％（×105），建议－×105个细胞。

因为细胞刚放进去的前几个小时需要粘在生长表面及适应新的生长条件，不会达到24小时翻一倍的速度。

其他规格培养可参照此确定相应culture细胞量。

2）MOI值:

MOI是multiplicityofinfection的缩写，中文译为感染复数,实际的含义即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染。

各种细胞的最适MOI值有差别，请客户正式实验前先进行预实验摸索最适MOI。

附4：

慢病毒MOI感染参数

注：

不同实验室由于细胞的来源、代数和细胞状态等因素的影响，MOI值也略有差异，以下数据是在细胞感染效率在85-100%细胞状态良好的情况下获得的，仅供参考。

细胞系名称

细胞描述

MOI值范围

能否添加polybrene

K562

人白血病细胞

20～40

可

Jurkat

人白血病细胞株

50～80

不可

kasumi

人白血病细胞株

10～30

不可

NB4

人白血病细胞株

50～80

不可

U937

人单核细胞

20～40

可

THP-1

人单核细胞株

50～80

可

GBC-SD

人胆囊癌细胞株

30～50

不可

H929

人多发性骨髓瘤症细胞系

100～150

不可

H1299

人非小细胞性肺癌细胞

1～3

可

95D

人肺巨细胞癌

2～4

可

A549

人肺腺癌

20～40

可

SPC-A-1

人肺腺癌细胞

100～150

可

7402

人肝癌细胞

10～15

可

Hep3B

人肝癌细胞

10～30

可

HepG2

人肝癌细胞

10～30

可

SMMC-7721

人肝癌细胞

10～30

可

Huh-7

人肝癌细胞系

10～30

可

Hela

人宫颈癌细胞株

10～30

可

HOS

人骨肉瘤细胞系

20～40

可

Hep-2

人喉癌细胞株

10～30

可

HL-60

人急性髓系白血病细胞株

>100

可

HT-29

人结肠癌细胞

10～30

可

PKO

人结肠癌细胞

2～4

可

SW480

人结肠癌细胞株

10～30

可

DLD-1

人结直肠肿瘤细胞株

10～30

可

SK-OV-3

人卵巢癌细胞株

2～4

可

SHG-44

人脑胶质瘤细胞

10～30

可

U251

人脑胶质母细胞瘤

1～3

可

U87

人脑星型胶质母细胞瘤

1～3

可

293T

人胚肾上皮细胞

1～3

可

HUVEC-2C

人脐静脉血管内皮细胞

10～30

可

PC-3

人前列腺癌细胞

20～40

可

MDA-MB-231

人乳腺癌细胞

10～30

可

MCF-7

人乳腺癌细胞株

20～40

不可

Tca8113

人舌鳞状细胞癌

10～30

可

RPE

人视网膜色素上皮细胞

10～30

可

AGS

人胃癌细胞

100～150

可

BGC-823

人胃癌细胞

100～150

可

SGC-7901

人胃癌细胞

10～30

可

MKN-28

人胃癌细胞株

20～40

可

MKN-45

人胃低分化腺癌细胞株

20～40

可

BxPc-3

人胰腺癌细胞

20～40

可

CFPAC-1

人胰腺癌细胞

50～80

可

Panc-1

人胰腺癌细胞

2～4

可

HEC-1-B

人子宫内膜癌细胞株

2～4

可

NIH-3T3

小鼠成纤维细胞系

20～40

可

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞

10～30（感染后分化）

不可

CHO

中国仓鼠卵巢细胞

20～40

可

HSC-T6

大鼠肝星型细胞

10～30

不可

大鼠脑胶质瘤细胞

>100

可

NRK

大鼠肾细胞

10～30

可

附5：

汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较

腺病毒

慢病毒

逆转录病毒

感染方式

直接加入

换液时间

感染后2h

感染后24h

是否需要筛选

不需要，腺病毒感染能力很强

需要筛选获得稳定感染株，慢病毒的感染能力不强

需要筛选获得稳定感染株，逆转录病毒的感染能力不强

观察时间

如带有GFP等荧光标签，24h后可观察到荧光，36h可达到表达高峰，若不带有荧光标签，则需要鉴定

带有GFP等荧光标签，24h后可以观察到表达，36h达到高峰，若不带有荧光标签，则不可直接观察到，需要鉴定

是否需要助转剂

不需要

有时需要，但是根据具体情况操作，因为助转剂，如polybrene，对细胞的伤害比较大，有的细胞可能承受不了

附6：

汉恒生物病毒包装周期表

腺病毒

慢病毒

过表达

干扰

过表达

感染

目的序列获得

3～5天

2～4天

目的序列获得

3～5天

2～4天

穿梭质粒构建

3～12天

重组表达质粒构建

8～12天

质粒重组

5～10天

慢病毒包装

5～10天

腺病毒包装

12～15天

病毒浓缩（可选）

1～2天

大量扩增

12～15天

滴度测定

3～5天

纯化（可选）

14～21天

目的细胞感染，筛选

14天

滴度测定

3～5天

过表达/干扰效率验证

3天

时间总计

52～83天

51～82天

时间总计

37～49天

36～48天

附7：

动物实验对腺病毒和慢病毒的要求及实现方式

腺病毒

慢病毒

是否需要纯化及方法

需要纯化，纯化方法：

CsCl梯度离心

不需要纯化

是否需要浓缩及浓缩方法

纯化之前需要浓缩，PEG8000沉降法

需要浓缩，浓缩方法：

超速离心法或PEG8000沉淀法。

实现方式

注射

附8：

病毒的保存条件与运输条件

腺病毒

慢病毒

保存条件

分装于-80度长久保存；一周内使用可保存于4度。

忌反复冻融。

六个月后再次使用，需要重新测定病毒滴度。

分装于-80度长久保存；一周内使用可保存于4度。

勿反复冻融。

六个月后再次使用，需要重新测定病毒滴度。

0运输条件

用普通的冰袋，不可以用干冰运输，因为干冰所造成的CO2气体环境会大大降低缓冲液的pH值，从而极大影响腺病毒在缓冲液中的稳定性。

但如果使用封口严密的西林瓶或安培瓶包装腺病毒，则可以用干冰运输。

先将病毒保存于-80度，然后全程干冰运输

附9：

慢病毒收到后的注意事项

1、慢病毒的储存

用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请放置于-80℃。

注：

a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（100ul/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。

b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议使用前重新测定病毒滴度。

2、慢病毒的稀释

用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基（含血清或含双抗不影响病毒感染）混匀分装后置于4℃保存（请尽量一周内用完）。

以上内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结，公司专注于为广大科研工作者提供腺病毒、慢病毒、逆转

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