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铜离子测定方法及检测论文

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铜离子测定方法及检测

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xxx

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xxx指导老师：

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目录

论文摘要............................................................3

一、绪论...................................................................4

（一）金属离子的识别意义和方法简介.........................................4

（二）荧光光谱.............................................................4

（三）荧光分析法...........................................................6

（四）荧光分析的优点.......................................................7

（五）荧光定量分析的各种条件...............................................7

（六）分子结构与荧光的关系.................................................8

（七）荧光分子探针..........................................................9

二、铜离子探针对铜离子含量的测定...........................................9

（一）引论.................................................................9

（二）实验部分............................................................10

（三）实验结果与讨论......................................................16

（四）小结................................................................18

三、结束语...............................................................19

参考文献.................................................................20

致谢.....................................................................21

论文摘要

铜离子是化学、生命科学、环境科学和医学等许多科学领域研究的重要对象，对溶液中铜离子的识别和检测是分析化学的主要任务之一。

荧光分子探针检测法不仅简便，而且在高灵敏度、选择性、时间分辨、实时原位检测方面均有突出优点。

因此在传统的受体分子上按照荧光分子传感器设计原理连接荧光团构造的超分子荧光传感器用于识别铜离子的研究受到越来越广泛的关注。

本论文主要工作是对已合成的荧光探针化合物利用紫外可见分光光度计和荧光分光光度计进行检测。

本研究进行了多个不同探针对不同金属离子的检测，其中有一个比较成功，是对铜离子有高选择性的探针A对水中铜离子的检测，在对检测液进行3D扫描后得出探针A的检测波长，即探针A检测铜离子的激发波长EX=550nm，发射波长EM=590nm。

在对不同浓度的铜离子的荧光扫描中得出探针检测铜离子的标准曲线，其线性方程为y=1.761x+12.4。

从标准曲线中得出该探针A的检测限为6.345μM／L。

该探针检测限低，具有良好的选择性，无其他金属干扰。

是一种方便快捷的检测方法。

关键词:

荧光探针Cu2+检测

铜离子测定方法及检测

一、绪论

（一）铜离子识别的意义和方法简介

自然界中广泛存在着铜元素。

它们在不同浓度下往往会显示出差异性的正面作用或负面作用，当铜离子浓度低于1μM时，在许多生命过程（生物催化反应酶的辅酶、生物运输过程、生物合成等）中都是不可或缺的，然而，当在生物体中存在浓度过高时，则会产生对一些必须酶的抑制作用、生物氧化/还原过程异常、神经毒性等有害作用。

目前常用的铜离子分析检测方法主要分为直接法和间接法两大类。

直接法是一类直接利用铜离子自身物理、化学性质对其进行分析检测的方法，包括原子吸收/发射光谱法和离子选择性电极法；间接法是一类利用铜离子和指示剂（也可称为化学分子探针）之间的特异性化学反应或超分子作用产生的信号变化对铜离子进行分析检测的方法，包括传统的铜离子指示剂和近年来研究较热的铜离子荧光分子探针。

（二）荧光光谱

1.荧光的产生

荧光是一种光致发光现象[1]。

室温下，大多数分子处于在基态的最低振动能层。

处于基态的分子吸收能量（电能、热能、化学能或光能等）后被激发，跃迁到激发态，激发态不稳定，分子将很快衰变到基态。

若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象称为“发光”。

2．荧光光谱的基本概念

根据量子理论，微观体系（原子、分子等）的内部运动一般是不连续的，有一系列分立的能级。

体系由一能级向其他能级的过渡称为跃迁[2]。

体系由高向低能级的跃迁伴随着能量的释放;由低能级向高能级跃迁伴随着能量的吸能量的释放和吸收可以以辐射的方式进行（放出或吸收光子），成为辐射跃迁也可以以无辐射的方式进行，如离子相互碰撞而产生的能量就是无辐射跃迁子。

全部能级间可能的辐射跃迁对应于一系列辐射频率，成为该物质的光谱。

光光谱包括激发谱和发射谱两种。

激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。

同辐射发射和吸收相关联的除了原和分子外，还有他们的聚集结构—如晶格、半导体中的电子空穴对等等。

3．荧光光谱的主要参量

激发谱和发射谱

荧光光谱包括激发谱和发射谱两种[3]。

激发谱是荧光团在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处（通常是其荧光光谱峰位的波长）的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率。

发射光谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。

荧光发射光谱显示了若干普遍的特性。

荧光寿命

当某种物质被一束激光激发后，该物质的分子吸收能量后从基态跃迁到某一激发态上，再以辐射跃迁的形式发出荧光回到基态.当激发停止后，分子的荧光强度降到激发时最大强度的l/e所需的时间称为荧光寿命[4]，通常用丫表示。

通过测量寿命可以得到有关分子结构和动力学等方面的许多信息。

荧光强度

荧光强度F取决于激发态的初始分布IA与荧光量子产率Φ的乘积[5]。

这里的F指的是向各个方向上发射的荧光强度的总和，实际上，光谱仪收集的只是其中的一小部分，因此仪器测到的荧光强度为F=IAΦFZ，这里Z是仪器因子。

很显然荧光强度与样品在波长λA处的消光系数有关，而消光系数与激发波长是密切相关的，消光系数随波长的变化称为即吸收谱，因此荧光强度也随激发波长的变化而变化。

实际上仪器因子Z与波长是有关的，这就使得激发谱与吸收谱并不完全相似。

（三）荧光分析法

1.荧光分析法定量分析及其原理

荧光分析法的定量测定方法较多，可分为直接测定法和间接测定法两类。

直接测定法:

利用荧光分析法对被分析物质进行浓度测定，最简单的便是直接测定法。

某些物质只要本身能发荧光，只须将含这类物质的样品作适当的前处理或分离除去干扰物质，即可通过测量它的荧光强度来测定其浓度。

具体方法有两种。

直接比较法:

配制标准溶液的荧光强度Fx，己知标准溶液的浓度CS，便可求得样品中待测荧光物质的含量。

如果空白溶液的荧光强度调不到零，则必须从Fs和Fx值中扣除空白溶液的荧光强度FO，然后进行计算。

标准曲线法:

将已知含量的标准品经过和样品同样处理后，配成一系列标准溶液，测定其荧光强度，以荧光强度对荧光物质含量绘制标准曲线。

再测定样品溶液的荧光强度，由标准曲线便可求出样品中待测荧光物质的含量。

间接测定法:

有许多物质，它们本身不能发荧光，或者荧光量子产率很低，仅能显现非常微弱的荧光，无法直接测定，这时可采用间接测定方法。

间接测定方法有以下几种:

化学转化法:

通过化学反应将非荧光物质变为适合于测定的荧光物质。

例如金属与鳌合剂反应生成具有荧光的螯合物。

有机化合物可通过光化学反应、降解、氧化还原、偶联、缩合或酶促反应，使它们转化为荧光物质。

荧光碎灭法:

这种方法是利用本身不发荧光的被分析物质能使某种荧光化合物的荧光碎灭的性质，通过测量荧光化合物荧光强度的下降，间接地测定该物质的浓度。

敏化发光法:

对于很低浓度的分析物质，如果采用一般的荧光测定方法，其荧光信号太弱而无法检测，可使用一种物质（敏化剂）以吸收激发光，然后将激发光能传递给发荧光的分析物质，从而提高被分析物质测定的灵敏度。

在实验室，一般采用工作曲线法进行校正。

既用处理过的已知量的物质，和式样溶液配成标准溶液，测定其荧光强度，再以标准溶液浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制工作曲线。

然后由所测得的试样溶液的荧光强度对照工作曲线以求出试样溶液中分析物质的浓度。

（四）荧光分析的优点

荧光分析法凭借其高灵敏度，得以迅速发展。

众所周知在微量物质的各种分析方法中，比色法和分光光度法应用最为广泛。

而荧光分析法的灵敏度一般要比这两种方法高2~3个数量级，它的灵敏度常可达亿分之几。

这是因为在荧光分析中，是由所测得的荧光强度来测定荧光物质的含量，而荧光强度的测量值不仅和被测溶液中荧光物质的本性及其浓度有关，而且与激发光的波长和强度以及荧光分析检测器的灵敏度有关。

因此加大激发光的强度，可以增大荧光强度，从而提高分析的灵敏度。

荧光分析还有一个优点，就是高选择性。

在对金属离子的测定中，荧光分析得到了广泛的应用，主要源于这种分析方法对金属离子有很高的选择性。

与此同时，荧光分析法还具有动态线性范围宽，方法简便，重现性好，取样量少，仪器设备不复杂等优点。

然而，不能对本身不发荧光的物质进行直接检测，这在某种程度上妨碍了荧光分析应用范围的扩展。

因此，还要更深入的研究化合物结构的关系与荧光的产生，才能合成更多的灵敏度高选择性好的新荧光试剂，使荧光分析的能够更好的能到应用。

（五）荧光定量分析的各种条件

在荧光定量分析中，为了确定荧光分析的最佳工作条件，应考察以下的因素的影响及其消除方法同时还必须准确测定待测组分的激发和发射光谱。

荧光物质的荧光光谱和荧光强度在不同的溶剂中会有很大的区别。

这种影响分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。

因此，在实验中，一定要选择合适的溶剂，并且该溶剂要有足够的纯度。

同时还要必须考虑到的是温度的影响。

通常，随着温度的降低，荧光物质溶液的荧光量子产率和荧光强度增大，事实上温度对荧光强度的影响是通过分子的内部能量转化作用。

因此实验中，一般将温度控制在20~25℃范围内。

但反应速度较慢的情况下，可能要加热才能使反应完全。

溶液的pH值改变将对荧光强度产生很大的影响。

大多数含有酸性或碱性基团的芳族化合物的荧光光谱，对于溶剂的pH氢键能力是非常敏感的。

溶液的pH改变将会影响到基态分子或激发态分子的酸碱性质。

对于金属离子与有机试剂形成的荧光络合物，溶液的pH值改变还会影响到络合物组成的改变。

不管哪种改变，最终都会导致到荧光光谱与荧光强度的改变。

（六）分子结构与荧光的关系

1.分子共扼体系大小对荧光的影响

在有机荧光试剂中，有机分子中具有发射荧光的基团称为荧光团[5]。

荧光团必须含有共扼大∏键，当共轭∏键达到一定程度才会发射出荧光，如苯、葱、蔡、菲、对苯二醒等基团。

芳香类碳氢化合物与直链的烯烃化合物相比，激发能向振动能的转换更难，因而荧光强度更大。

而对于具有强荧光的有机化合物和荧光试剂，仅有大的共扼体系还是不够的，分子的共辘体系必须具备共平面性并且还要有一定程度的刚性。

例如蔡和维生素A都有五个共轭∏键，前者为平面结构，后者是非刚性结构，而蔡的荧光强度为维生素A的五倍。

2.取代基对荧光的影响

取代基效应是有机结构理论的重要组成部分，取代基的性质对荧光体的荧光特性和强度均有强烈的影响。

芳烃和杂环化合物的荧光光谱和荧光产率常随取代基而变，取代基对荧光体的荧光强度、激发光谱、发射光谱和荧光效率的影响规律和机理，是人们甚为关注的领域，但到目前为止，我们对激发态分子的性质依旧了解不多，其影响规律大多数是通过实验总结出来的。

（七）荧光分子探针

1.概述

荧光分子探针，是指在一定体系内，当被分析物或被分析体系的物理、化学性质发生变化时，该荧光分子的荧光信号能发生相应改变，从而通过荧光信号反映出被分析物或被分析体系的浓度、性质等信息[6]。

金属离子荧光分子探针，则是指能和体系中存在的某种特定金属离子发生作用，并且通过荧光信号的变化反应出该种金属离子的浓度信息的荧光分子探针[7]。

按照金属离子荧光分子探针和相应金属离子之间发生的相互作用，可将其分为

（1）金属离子诱导反应和

（2）金属离子与探针分子发生络合等超分子作用两大类。

而后者又可以根据金属离子与探针分子作用前后荧光信号发生变化的机制不同，分为荧光团的

（1）光致电子转移，

（2）光致电荷转移，（3）荧光共振能量转移和（4）激基聚合物四类。

各种荧光分子探针自身的结构和组成也有不同，据此大致可分为

（1）有机小分子探针，

（2）生物大分子探针和（3）纳米材料探针三类。

二、铜离子探针对铜离子含量的测定

（一）引论

铜离子（Cu2+）在浓度较高时，是一种有害的环境污染物，会对动植物造成毒害，当人体摄入大量的铜离子之后，极易对身体内的脏器造成负担，特别是肝和胆，当这两种器官出现问题后，维持人体内的新陈代谢就会出现紊乱，导致肝硬化、肝腹水甚至更为严重。

相反，铜离子在浓度适宜时，则是维持生命体正常生理功能的必须元素之一，如铜离子对人体大脑、心脏、造血、抵御癌症、抗衰老等方面都具有重要的作用。

缺乏铜离子将会导致脑细胞中的色素氧化酶减少、活力下降，从而使记忆衰退、思维紊乱；铜离子参与形成的氧化酶也是构成心脏血管的基质胶原和弹性蛋白形成过程中必不可少的物质；人体造血也离不开需要铜离子合成的血浆铜蓝蛋白；另外，铜离子对癌细胞也有一定的抑制作用，一些含铜的金属硫蛋白、超氧化物歧化酶等具有较强的清扫此种代谢废物的功能，能够延缓衰老。

因此，准确分析测定样品中铜离子的含量对于监控环境质量、居民饮用水及食品安全、营养健康状态等非常重要。

我国的饮用水安全标准要求饮用水中铜离子的含量必须不高于1ppm。

目前常见的用于铜离子分析检测的仪器和方法主要包括离子色谱法、分光光度法、荧光光谱法和原子吸收/发射光谱法、电化学方法等。

其中分子光谱法（分光光度法、荧光光谱法）由于其所需仪器设备简单、分析迅速、产生的荧光信号用肉眼观测可非常方便实现半定量分析等特点，近年来越来越受到科学家们的广泛关注。

尽管目前有不少用于铜离子分析检测的荧光分子探针已见报道，但是由于铜离子的顺磁性，这些荧光分子探针大多是对铜离子产生荧光淬灭的响应。

考虑到灵敏度的因素，对铜离子产生荧光增强或变色响应的荧光分子探针的灵敏度更高，设计合成这一类的荧光分子探针将是更加具有应用前景和挑战性的工作。

另外，部分已见报道的荧光分子探针对铜离子的选择性不足，会受到铁、汞、钴、镍等离子的干扰，仍有待通过探针分子的设计提高铜离子选择性。

（二）实验部分

1.试剂去离子水经过二次蒸馏后使用，已合成好的铜离子探针、乙腈、硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、硝酸镁、氯化锰、硝酸铁、氯化亚铁、硝酸钴、硝酸镍、硝酸铅、硝酸镉、硝酸银、硝酸铜、硝酸锌、高氯酸汞、氢氧化钠、碳酸氢钠、醋酸钠、盐酸、醋酸均购自北京化学试剂公司，为分析纯。

HEPES缓冲溶液（20mM）的配制：

在500mL烧杯中加入2.383Hepes和200mL去离子水，搅拌溶解后，在pH计监控下，缓慢加入300mL乙腈。

2.仪器紫外-可见吸收光谱测定：

紫外-可见吸收光谱使用UV-2800H型分光光度仪测定，样品置于1cm光程的石英比色皿中。

荧光光谱测定：

荧光激发、发射光谱均使用FP-7000荧光光谱仪测定，样品置于1cm光程的石英比色皿中。

pH值测定：

溶液pH值的测定使用ModelpHS-3CpH计测定。

3.溶液的配制准确称量探针A到25ml容量瓶中，加入乙腈至刻度，配成25ml，1mm／L探针标液。

4.测定铜离子含量的操作方法

4.1确定测试波长

a.紫外可见测试，进行光谱扫描，找出最大吸收波长，固定波长进行后续测定。

从图2.1可以看出探针在紫外灯下响应较低，所以不采用紫外进行检测。

图2.1铜离子探针A紫外可见光光谱扫描

b.荧光测试，扫描激发波普和发射光谱，确定激发波长和发射波长。

图2.2为探针A的荧光3D扫描，从图看出没有荧光。

图2.3为浓度为100×10-6M／L的探针A与100×10-6M／L的铜离子溶液的荧光3D扫描谱图，从图中明显看出有峰出现，即产生荧光。

且从图中看出荧光的激发波长EX为550nm左右，发射波长EM为590nm左右。

又分别做了图2.3和图2.4。

图2.3设定激发波长EX为550nm进行荧光扫描，波峰出现在发射波长EM为590nm处。

图2.4设定发射波长EM为590nm进行荧光扫描，波峰出现在了激发波长EX为550nm处。

由此确定探针A的激发和发射波长为激发EX=550nm，发射EM=590nm。

图2.2铜离子探针A荧光3d扫描谱图

图2.3设定激发波长EX为550nm扫描发射波长从500nm到700nm的荧光强度

图2.4设定发射波长EM为590nm扫描激发波长从450nm到700nm的荧光强度

4.2显色剂用量

固定待测离子浓度，逐渐增加显色剂浓度，做出剂量-响应谱图，找出最佳显色剂使用剂量。

图2.5为固定铜离子浓度为20μM／L,探针A的浓度为2μM／L,5μM／L,8μM／L,10μM／L,15μM／L,20μM／L,30μM／L,40μM／L,50μM／L,60μM／L,70μM／L,80μM／L,90μM／L,100μM／L扫描荧光得出的散点图。

由图看出当探针显色剂的浓度到40μM／L后，荧光强度不再随着显色剂量的增加而增加，因此可以得出显色剂与金属铜离子的配比为2:

1左右，最佳显色剂用量为40μM／L。

图2.5固定铜离子浓度变探针A的浓度荧光扫描散点图

4.3测试介质

根据显色剂的溶解特性，以及将来测试水样的目标，选择尽量易得、水溶、低毒性的有机溶剂，如甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水等，最好是水，或者水合溶剂，扫描不同介质中的谱图。

此实验主要用乙腈作为有机溶剂，为了尽量少用有机溶剂，本实验选择配一定比例的乙腈比水的溶剂。

4.4反应时间

图2.6是测试当显色剂与铜离子浓度比为100μM／L：

100μM／L时随着反应时间的增加，荧光强度的变化情况。

由图看出显色剂与铜刚开始是瞬间反应的，因为当时间为0时荧光强度已经达到60。

此处的时间0有一定误差，滴加探针后把比色皿放入荧光机也有一定时间。

从0秒到100秒之间响应值快速增加，到了100秒后响应值趋于稳定，到200秒又开始缓慢增加，到了600秒时达到稳定，响应值不再增加，即10分钟后反应完全并打扫稳定，可以后续测定。

图2.6加入铜离子后随着时间的的增加荧光强度的变化曲线

4.5准确测试的线性范围

配置不同浓度的待测离子溶液，加入一定量的显色剂，做剂量-响应图，确定准确测试的线性范围，得到线性方程。

如图2.7所示，此图是以显色剂的浓度为100μM／L，铜离子浓度为0μM／L,10μM／L，20μM／L,30μM／L,70μM／L,90μM／L,100μM／L,作待测液来测量标准曲线。

得出线性方程为y=1.761x+12.4,R2=0.993，呈现较好的线性。

图2.7探针A的标准曲线

4.6检测限

根据标准曲线，求出检测限和定量检测限。

探针A检测限是不加铜离子的荧光强度即空白溶液的荧光强度的3倍即为探针A的检测限。

因此探针A的检测限为7.858×3=23.574.

4.7干扰试验

选择干扰阳离子：

Cu2+、Hg2+、Zn2+、Mg2+、Pb2+、Ca2+、Cd2+、Ag2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Mn2+作干扰曲线。

从图2.8中看出，在波长为600nm处除了铁和铜，响应值都低于20，对探针A的铜离子检测影响很小，可以忽略。

铁离子的波峰不在600nm处，此波峰属于铁对荧光的一种散射现象，并且在600nm处的响应值仅为50左右，也可以忽略。

因此在600nm处没有干扰。

图2.8探针A检测干扰曲线

（三）实验结果与讨论

探针与铜离子反应时间对检测的影响

由2.6可以看出此探针与铜离子反应速度非常快，滴加探针与汞瞬间反应，到100s后趋于稳定，随后又缓慢增加，等到了600s即10分钟荧光强度不再变化。

因此在实际运用中要注意把握好时间，滴加探针10分钟后再进行荧光扫描会得到比较准确的数据，否则会增加误差。

1.干扰离子对铜离子分析检测的影响

从图2.8中看出，在波长为600nm处除了铁和铜，响应值都低于20，对探针A的铜离子检测影响很小，可以忽略。

铁离子的波峰不在600nm处，此波峰属于铁对荧光的一种散射现象，并且在600nm处的响应值仅为50左右，也可以忽略。

因此在600nm处没有干扰。

2.测量范围及极线性分析

由图2.7可得出探针A检测铜离子的标准曲线和线性方程即y=1.761x+12.4,由此方程得R2=0.993，因此线性很好。

并由此方程可得测量范围，即把y=23.574代入方程可得x=6.345，所以测量范围为从离子浓度大于等于6.345×10-6M／L。

3.不同溶剂对荧光光谱的影响

PH的影响

配置不同PH值的缓冲溶液，探讨不同PH对显色反应的影响，确定检测的最佳PH值。

由于荧光探针在进行检测时很容易被中水的某种物质影响，因此其对pH的低敏感度显得很重要。

实验研究了荧光探针B在不同pH条件下的荧光强度。

不同pH的溶液用缓冲液的配制。

在激发波长为570nm，发射波长为594nm处记录稳定的荧光强度。

由扫描纪录的数据看出该探针受pH影响。

在pH为6—8的范围内，荧光强度的变化不超过0.54%，因此该探针适于在中性环境中检测。

4.干扰离子对铜离子分析检测的影响

选择干扰阳离子：

Cu2+、Hg2+、Zn2+、Mg2+、Pb2+、Ca2+、Cd2+、Ag2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Mn2+进行干扰测试。

如图所示在波长为600nm处没加铜离子的荧光响应值均低于300，而加了铜离子的响应值达到了2000，因此干扰很小可以忽略。

（四）小结

本章主要对荧光探针A对铜离子的检测进行了研究，得出此探针具有对铜离子的高选择性，低检测限，其优点是缓冲介质是常见而且容易得到的水，使检测更加方便。

可以运用到实际检测中。

结束语

人们为了认识、评价、改造和控制环境，必须了解引起环境质量变化的原因，这就要对环境（包括原生环境和次生环境）的各组成部分，特别是对某些危害大的污染物的性质、来源、含量及其分布状态，进行细致的监测和分析。

环境分析化学就是研究环境中污染物的种类、成分以及如何对环境中化学污染物进行定性分析和定量分析的一个学科。

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