基因组改组技术选育嗜果糖耐SO2葡萄酒酵母.docx
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基因组改组技术选育嗜果糖耐SO2葡萄酒酵母
LANZHOUUNIVERSITYOFTECHNOLOGY
毕业设计（论文）
题目基因组改组技术选育嗜果糖、耐SO2葡萄酒酵母
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基因组改组技术选育嗜果糖、耐SO2葡萄酒酵母
摘要
以C-1、C-2、C-3、C-4四株酵母菌作为出发菌株，用紫外线和化学诱试剂进行诱变，分别用含高浓度SO2和果糖的培养基筛选，获得2株SO2耐受性提高的菌株C-2-4和C-4-2和2株果糖利用率提高的菌株C-1-8和C-3-1。
再以这4株菌株作为正突变库，通过两轮的基因组改组，获得5株耐SO2性能和嗜果糖性能都较好的酵母菌株。
其中第一轮改组后的菌株A-2对SO2的耐受性与C-4-2相比提高59.7%，A-7利用果糖特性与C-1-8相比提高了20%。
第二轮改组后的菌株B-1的耐SO2特性与C-4-2相比提高了14%，利用果糖特性与C-1-8相比提高了34%。
关键词：
葡萄酒酵母；基因组改组；耐SO2；嗜果糖；原生质体融合
Abstract
ByUVinducedmutagenesisandchemicalmutagenesismethodsofwineyeaststrainC-1,C-2,C-3andC-4,andscreeningonnutrientmediumcontaininghighconcentrationsofSO2andfructose,weobtained2SO2toleranceimprovedstrainsC-2-4andC-4-2andtwofructoseutilizationincreasingstrainsC-1-8andC-3-1.Wemadeuseofgenomeshuffingtothelibraryof4generateimprovedstrainsinthiswork.Weshuffedtwicetheseimprovedstrainbyprotoplastfusionandfinallyobtained5strainswithhigherSO2toleranceandaddictedtofructose.TheSO2toleranceofthefirstroundofthereconstitutedstrainA-2improved59.7%comparedwiththeC-4-2,A-7featurestheuseoffructoseincreasedby20%comparedwithC-1-8.TheSO2toleranceofthesecondroundofGenomeShufflingstrainB-1hasa14%increasecomparedwiththeC-4-2,andtheuseoffructosecharacteristicsincreasedby34%comparedwithC-1-8.
Keywords:
Wineyeast;GenomeShuffling;ResistancetoSO2;Addictedtofructose;Protoplastfusion
摘要1
Abstract2
一、综述5
（一）葡萄酒酵母5
（二）葡萄酒酵母菌种的选育5
1.自然选育5
2.诱变育种6
3.杂交育种6
4.细胞融合育种7
5.基因工程育种7
（三）基因组改组技术7
1.Genomeshuffling技术的具体方法7
2.GenomeshuffIing的优点8
（四）酵母菌对SO2的耐受性及研究现状8
（五）酵母的嗜果糖特性及研究现状8
（六）本课题的研究目的和研究意义8
二、材料与方法8
（一）材料8
1.菌株8
2.试剂和药品8
（二）实验方法9
1.出发菌的选择9
2.出发菌株对SO2耐受性实验9
3.果糖耐受性实验9
4.发酵液中果糖的测定（半胱氨酸—咔唑比色法）9
5.紫外线诱变10
（1）诱变剂量的确定10
（2）诱变处理方法10
6.化学诱变10
（1）诱变剂量的确定10
（2）诱变处理方法10
7.嗜果糖诱变株的筛选10
8.耐SO2诱变株的筛选10
9.第一轮融合10
（1）菌体前培养10
（2）原生质体的制备10
（3）原生质体的形成率和再生率计算11
（4）原生质体灭活11
（5）原生质体融合及初筛11
10.第二轮融合11
11.选育所得菌株果糖耐受性试验11
12.选育所得菌株与原始菌株发酵性能比较11
13.基因组改组菌株稳定性试验11
三、结果与分析11
（一）出发菌的选择结果11
（二）出发菌对SO2的耐受性12
（三）出发菌株对果糖的耐受性12
（四）果糖标准曲线的制备12
（五）诱变剂量的确定13
1.紫外致死曲线的绘制13
2.化学诱变致死曲线的绘制14
（六）嗜果糖诱变株的选育14
1.嗜果糖诱变株的初筛14
2.嗜果糖诱变株的复筛14
3.诱变株对果糖的耐受性试验15
（七）耐SO2诱变株的选育15
1.耐SO2诱变株的初筛15
2.耐SO2诱变株的复筛15
3.诱变株与原始菌株比较16
（八）基因组改组选育耐SO2、嗜果糖菌株16
1.原生质体形成率和再生率的计算16
2.第一轮基因组改组结果16
3.第二轮基因组改组17
4.选育所得株果糖耐受性试验17
5.选育所得菌株与原始菌株发酵性能比较18
6.基因组改组菌株的稳定性研究结果19
四、结论19
参考文献20
外文翻译22
致谢35
一、综述
（一）葡萄酒酵母
葡萄酒是一种营养丰富的低酒精度发酵酒类，是采用新鲜葡萄或葡萄汁经完全或部分酒精发酵生产。
酵母菌（yeasts）是葡萄酒生产中的主要微生物有机体，葡萄酒的酿造都是在酵母菌的作用下，采用自然发酵或者纯种发酵，将葡萄原料中的各种潜在质感在酒中充分表现出来。
因此，酵母的品质对葡萄酒的产量和质量影响很大，酵母性状的优良直接影响到所酿酒的口感和风味，决定葡萄酒品质的优劣，因此葡萄酒酵母筛选历来倍受重视。
酵母菌广泛分布于自然界，种类很多，与工业生产关系最密切酵母菌种是Saccharonmyces属内的狭义酿酒酵母组（Saccharomycessensustricto），其中S.cerevisiae是酒精和果汁发酵酿酒的主要菌种[1]。
酵母是葡萄酒酿造的灵魂。
在无氧条件下，由葡萄转化成葡萄酒的过程中，酿酒酵母的作用至关重要。
在自然或自发发酵情况下，微生物的群体生长现象是自发进行的，其必要条件也随时间的变化而改变，包括真菌、酵母、细菌和病毒的相互作用。
微生物群体间的相互作用引发协同效应，促使芳香类化合物的生成，这类化合物不是简单的通过混合各纯培养发酵的成分就能实现的。
这点已由近期的代谢足迹技术，通过单纯培养、混合发酵和将几种酒混杂的方法，利用气相色谱分析发酵产物中挥发性物质的组分，予以证实[2]。
在实际应用中，葡萄酒酵母为葡萄酒品质控制提供了非常有效的手段和保证。
在发酵中，酵母在数量上占有相对优势，能形成同质性及稳定性的群体，使葡萄酒酿造者更易于测试其纯度、活性及酵母菌种特征。
从生物技术角度，酵母的应用对微生物学发酵过程具有深远的影响。
（二）葡萄酒酵母菌种的选育
在葡萄酒生产中，酵母作为主要的发酵微生物不仅对葡萄酒产量、质量和发酵生产管理影响很大，而且对葡萄酒特色和风格的形成也至关重要。
真正优良的葡萄酒酵母，应该具备起酵快，拥有连续发酵能力和可描述性，能耐酒精、高压、高SO2、高温，能产生甘油和糖普酶，但不失香和絮结，并且能使发酵过程进行的完全，残糖少，酒体协调，易于长期储存等优点。
葡萄酒生产商为了使其产品在市场上有竞争力，希望得到发酵性能更优异的葡萄酒酵母菌株。
例如：
增加活性干酵母的抗胁迫能力和恢复能力，改善酵母对葡萄汁中糖分和氮素的吸收与同化，提高酵母对乙醇、其它微生物的代谢产物及毒素的耐受力，提高它们对亚硫酸盐、重金属和农业化学残留物的耐受力，减少发酵过程中泡沫的形成，借助抗菌酶和多肽的表达或二氧化硫的代谢生产以实现对有害微生物的控制等。
消费者对葡萄酒品质要求也在不断提高，口味日趋多样化，倾向于新型、健康的葡萄酒。
例如：
要求增加葡萄酒中有益于健康的物质如白藜芦醇和水杨酸等，以及涉及葡萄酒风味的物质如酯类和醇类等的含量；减少葡萄酒中的酒精含量以及可能存在的微量有害物质如被怀疑有致癌可能的氨基甲酸乙酯和神经毒素生物胺等。
葡萄酒厂和消费者的这些需求直接推动了葡萄酒酵母的筛选和改良。
在葡萄酒用酵母菌的选育中，有两类因素影响着研究的方向和出发点。
一类是较复杂的影响葡萄酒质量的因素，包括一类，二类香气物质和其他感官特性的因素，另一类是出于工艺考虑：
如耐受性（例如糖，SO2，酒精含量、抗真菌素，低温和高温等）、嗜杀型、化学稳定性、生长模式等工艺因素[3]。
传统的自然筛选、采用理化因素的诱变等经典的育种手段是目前最实用的常规技术，随着现代科技的发展，出现了很多选育酵母的新技术如基因组改组、基因工程育种等手段。
1.自然选育
自然选育即不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。
自然突变被认为是由多因素低剂量的诱变效应引起的，这样的突变可使野生的酵母菌天然具有某种较突出的特性。
众所周知，老世界葡萄酒产国通过野生酵母自然发酵的葡萄酒无论在复杂感、结构、香气、地域特色方面都是其他地区无法比拟的。
经研究发现在它们的葡萄园中筛出的假丝酵母（Candida）、克勒克酵母（Kloeckera）、有孢汉逊酵母（HnsiasDoracan）可通过代谢和自溶提高葡萄酒的香气，参与复杂薪鲜的风味物质的形成。
现在，许多国外的酵母生产厂家利用自然选育的方法生产纯种的酿酒酵母产品，这类商用葡萄酒酵母已在许多新世界葡萄酒生产国（澳大利亚，美国，南非，中国等）的大规模工业化生产中被广泛应用。
使用这类商用酵母优点是易于管理，保障了发酵的顺利进行；缺点是使新世界的葡萄酒酒体较单调、缺乏个性和特点，相同或相近产区的葡萄酒风味趋于同质化。
因此国外的科研人员近年来逐步开展了自然选育具有特殊功能酵母菌的研究，希望通过这类酵母菌的使用，弥补葡萄原料品质的不足，或满足特殊生产工艺的要求。
例如有人从Parmesan干酪乳清中筛出的酿酒酵母具有降低葡萄酒中苹果酸的作用，最高降幅可达50％，这类酵母适用于冷凉产区酸度较高的葡萄原料的发酵，有利于降低葡萄酒过强的酸感。
还有人从葡萄酒生产中筛出的酵母菌（Saccharomycesuvarum）在低温下（6℃～10℃）具有较强的发酵力，可用来发酵冷藏的葡萄汁，其最主要的特点是能够合成苹果酸，可以改善炎热产区葡萄原料酸度不够的问题；同时它能产少量的醋酸和大量的甘油和琥珀酸，对于改善葡萄酒的香气也有重要的影响。
有科学家已筛选出在发酵过程中不积累尿素的酵母，对降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量具有积极的意义。
2009年在新西兰KumeuRiver葡萄酒厂发现了近100种独特的酵母菌株，包含6种不同形态，之间并未杂交繁殖，且与商用菌株毫无关联，这些酵母或许会成为揭示新西兰葡萄酒风味特性的有效工具[3]。
由于酵母菌株自发突变几率很低，只靠从群体中筛选出个别有价值的优良突变体的机会相对较少，因此从自然界直接筛选的野生酵母，较难具有葡萄酒所要求的复杂的理想特性，有时需进一步的人工干预，才能达到目的。
然而，近年来为了获得安全的、具有地域风格的菌株，很多的葡萄酒国家重新开始重视自然选育。
2.诱变育种
诱变育种即利用物理或化学的方法处理均匀分散的微生物群体，使其基因突变频率大幅度提高，从中挑选少数符合目的的突变菌株以供使用的育种方法。
国外科研人员对二次发酵香槟酒的酿酒酵母进行诱变，通过改善其自溶特性缩短酵母多糖和甘露糖蟹白等物质的溶出时间，可使瓶内二次发酵香槟酒的瓶储期缩短3～6个月，达到缩短陈酿期的目的。
还有人通过该法改善了酿酒酵母对氮源的利用方式，解除了氨基酸利用途径的阻遏作用，同时提高了发酵速率，缩短了发酵时间。
我国的科研人员发现红CO2激光辐照诱变可使菌株产乙醇能力有较大的变化，甲磺酸乙酯（EMS）诱变可筛出低产H2S和高产谷胱甘肽（GSH）的突变株[4]。
尽管诱变育种简单易行，但研究发现酵母菌的基因结构使得这种育种方法应用起来有局限性，因为大部分的酵母基因都有2个以上的拷贝，因此选择隐性突变是很困难的，而且长期使用诱变剂会导致菌种疲劳，遗传很不稳定。
3.杂交育种
杂交育种是利用酵母在营养缺乏时的有性繁殖、不同遗传特性和相反交配型的细胞产生双倍体等特点进行育种的方法。
杂交育种的目的一般是为了使菌种性状满足酿造工艺的特殊要求。
比较典型的例子是国外运用这种技术成功地将一个嗜杀酵母的单倍体和一个耐SO2的单倍体进行杂交，所获得的新酵母菌增强了耐SO2能力，提高了抵御杂菌污染的能力和发酵效率。
由于我国葡萄产区大多在采收季节前后降雨量较多，较高的环境湿度使葡萄易被有害微生物侵染，具有嗜杀特性和耐SO2能力的酵母对于葡萄质量不佳的产区具有较好的发酵效果。
国外在葡萄酒酵母杂交育种方面已做了许多科学研究，有人将筛自乳清的酿酒酵母与葡萄汁酵母杂交，其杂合子具有更强的降解苹果酸能力和较低的产乙酸能力，这项研究对选育红葡萄酒酵母具有指导作用。
有人将一种絮凝的酵母菌和一种不产H2S的酵母菌进行了杂交用于起泡葡萄酒的发酵，新菌种有利于发酵后排除酒泥、提高酒体澄清度，并能改善酒体香气和口感。
还有人成功地将耐寒的葡萄汁酵母菌和不耐寒的酿酒酵母进行了杂交，选育出的酵母菌可在5℃～10℃条件下具有较好的发酵能力，有利于果香型葡萄酒的酿造。
我国在葡萄酒酵母杂交育种方面的研究还较少。
酵母菌杂交育种也存在一定局限性，主要是由于酵母菌的多倍体基因排列，使得自然界中能形成孢子的菌株出现几率很小，还有一些特殊的酵母菌属间杂交不会将结合子的理想特性传递给子代，另外，能够被交换或传递到子代、结合子上的理想性状特点也是有限的。
4.细胞融合育种
细胞融合育种是将两种不同的菌株经酶法去壁后，得到的原生质体，置于高渗溶液中，在融合剂的作用下产生细胞之问的融合，进而导致基因再组，获得融合亲本优良性能的新菌株的育种方法。
陈海昌等用呻酒酵母和糖化酵母进行原生质体融合，筛选融株，既有较高的发酵度和絮凝性，又能水解淀粉和糊精，适宜生产低糖啤酒。
微生物细胞融合技术是通过改变微生物细胞的遗传性进行育种。
高年发等采用赖氨酸缺陷型酿酒酵母原生质与肌醇缺陷型粟洒裂殖酵母原生质体融合选育了葡萄酒发酵性能良好且具有降解苹果酸能力的酵母菌株。
它不受亲缘关系影响，可克服细胞壁的天然屏障，遗传信息传递量大，不需了解双亲详细的遗传背景，便于操作，而且原生质体的再生过程本身也可以认为是筛选的过程。
所以可以在种内、属内、属间甚至跨界进行，并且在各个领域中都取得了一定的效果[4]。
值得一提的是跨界融合技术，其作为细胞融合技术的一个扩展领域，具有很大的前景和挑战性。
然而由于跨界融合的亲缘关系甚远，融合难度大，筛选困难，且融合后代遗传稳定性差等原凶，凶此跨界融合成功的事例并不多见。
期待将来利用酵母的天然优良品质，打破种属间界线，应用跨界融合技术，为葡萄酒酿造研发出更件的酵母菌株。
5.基因工程育种
上述的酵母改良技术都是随机地改变菌种特性，缺乏特异性和准确性。
基因工程育种克服了这一缺点，把理想的外源DNA片段克隆或插入到葡萄酒酿酒酵母菌基因的特定位置中，实现DNA重组，使其得到表达，并稳定遗传而不改变受体原有特性。
在研究中发现，当一个或者几个已知基因编码优良特征时，基因工程菌的构建是容易且可行的。
有人构建了具有果胶降解、葡聚糖降解和木聚糖降解能力的酿酒酵母，使葡萄酒澄清变得容易。
有人通过构建能充分表达甘油磷酸脱氢酶基因的高产甘油酵母菌，酿造出了低醇兼有圆润酒体香的葡萄酒。
由于酿酒酵母中没有苹果酸乳酸途径，又缺乏苹果酸运输系统，因此有人将乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）中的苹乳酶基因和粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomvcespombe）中的苹果酸透性酶基因转入酿酒酵母而成功降酸，解决了冷凉产区葡萄酒生物降酸的难题。
有人发现在单倍体和二倍体阶段进行基因处理，可在自溶程度、酒精耐受性和工艺可行性方面明显提高起泡葡萄酒的质量。
有人利用氮代谢的调节机制，构建了促进尿素酰氨分解酶表达的基因工程菌，有效降低了酒中尿素的含量，从而大幅降低了葡萄酒中氨基甲酸乙酯的浓度。
还有人描述了通过构建KNR4基因敲除酵母菌，细胞壁的结构和成分得以改变，增加了葡萄酒中甘露糖蛋白的表达，还有效防止了葡萄酒蛋白质浑浊。
然而例如发酵力，产酒精能力，耐受性和培养温度等工艺特征因素并不是由单一的或少数几个基因控制的，决定这些特性的基因往往广泛分布于整个酵母菌基因组中，有科学家已推测出决定酒精耐受性的基因多于250个，而这些位点通常是我们了解很少又分布很广的。
尽管近几年微卫星和单核苷酸多态性方法成功地用于绘制基因谱图，但是像这样特征复杂的基因识别仍然是当前遗传学的一个挑战。
因此仅利用基因工程菌的构建仍然不能解决这些因素带来的问题。
（三）基因组改组技术
基因组改组技术（Genomeshuffling）是选择一个原始亲株，通过经典的诱变育种方法获得多个表型得到提高的菌株，构建突变候选株文库，以这些表型提高的菌株作为首轮多亲本融合的直接亲株，然后进行多亲株融合，使其全基因组进行随机重组，获得第一代融合株；再从中选择表型获得进一步提高的菌株作为下一轮融合的直接亲本，依此类推进行多轮的多亲株融合，最终从获得的突变体库中筛选出性状被提升的目的菌株[5]。
1.Genomeshuffling技术的具体方法
从基因组改组技术的原理来看,进行基因组改组,首先要运用诱变育种的方法，以获得目的性状得到改进的正向突变菌株的基因组库，并作为首轮多亲株融合的直接亲株。
诱变育种的具体操作要根据不同菌种的特性而异。
然后进行多亲株的递推式融合。
递推式融合的操作方法与原生质体融合技术基本相同，首先要进行原生质体制备，随后是原生质体融合、再生、鉴定和挑选等。
2.GenomeshuffIing的优点
Genomeshuffling只需在进行首轮shuffling之前，通过诱变获得初始突变体库，然后将包含若干正性突变株的突变体库作为第一轮原生质体融合的出发菌株，此后经过递推式的多轮融合，最终使引起正性突变的不同基因重组到同一个细胞株中。
同经典的诱变方法相比，通过基因组改组技术可以更为快速和高效地筛选出优良菌株，而且这些菌株往往剔除了负突变而集多种正突变于一体，因此在很大程度上弥补了经典诱变方法的缺陷。
理论上而言，基因组改组技术是整个基因组的循环重组，可以同时在整个基因组的不同位点重组，将亲株的多个优良表型通过多轮的随机重组集中于同一株菌株，与代谢控制育种相比，其突出优点是不必了解整个基因组的序列数据和代谢网的信息[6]。
（四）酵母菌对SO2的耐受性及研究现状
酵母对SO2的耐受性决定葡萄酒的质量。
SO2不仅是一种防腐剂，还有抗氧化作用，能预防葡萄酒部分成分的氧化，特别是它能抑制葡萄酒中多种氧化酶的作用，这对防止白葡萄酒的褐变有着极其重要的意义。
SO2的澄清作用也被广泛应用于葡萄酒的酿造之中（因在发酵初期、短期内抑制酵母菌的活动，使葡萄汁能保持一定时间的静止状态，则其中的杂质、胶体物质和极易导致葡萄酒形成酒石的已被分解的酒石酸很快沉淀下来）。
SO2还可降低葡萄酒的氧化还原电位。
对葡萄酒的滋味具有改良作用。
此外，SO2在某种程度上，也有助于葡萄酒香气的形成[7]。
当葡萄汁中SO2含量太高时会影响葡萄酒酵母的正常代谢，因此，选育出耐亚硫酸的优良葡萄酒酿酒酵母菌对葡萄酒生产意义重大。
针对选育耐高SO2的葡萄酒酵母已有不少研究，如国外用杂交技术将一个嗜杀酵母的单倍体和一个耐SO2的单倍体进行杂交，所获得的新酵母增强了耐SO2能力，提高了抵御杂菌污染的能力和发酵效率；我国应用原生质体融合和紫外线诱变技术进行葡萄酒酵母的选育，得到耐高温、耐SO2、高产脂的酵母菌种，取得了良好效果。
（五）酵母的嗜果糖特性及研究现状
葡萄浆汁中葡萄糖和果糖含量基本相等，但在酒精发酵过程中，酿酒酵母通常利用葡萄糖的能力比利用果糖的能力强。
其结果是果糖与葡萄糖比例随着发酵的进行不断升高，以致在发酵后期果糖成了主导糖[9]。
有研究表明,酿酒酵母的低果糖利用能力与发酵停止、发酵后期发酵速率低和发酵不彻底密切相关。
另外，由于果糖不能被有效利用而残留在葡萄酒中，一方面果糖甜度高，会造成葡萄酒口感失衡；另一方面，酒中残糖的存在具有引发微生物污染的危险。
因此酿酒酵母的嗜果糖性是葡萄酒酵母选育工作的一项重要内容。
（六）本课题的研究目的和研究意义
在葡萄酒酿造过程中，为了保持原果汁风味，通常不进行杀菌，只通过向果汁中添加质量分数为（50~100）×10-6的二氧化硫来抑制野生酵母及有害微生物的生长繁殖，以保证发酵作用的正常进行。
因此，选育出耐亚硫酸的优良葡萄酒酿酒酵母菌对葡萄酒生产意义重大。
葡萄中葡萄糖和果糖含量基本相等，但在酒精发酵过程中，酵母先利用葡萄糖。
其结果是果糖与葡萄糖比例随着发酵的进行不断升高，以致在发酵后期果糖成了主导糖。
有研究表明，葡萄酒中的低葡萄糖-果糖比（GlucoseFructoseRatio，GFR）是导致缓慢或停滞发酵的另一个重要因素。
另外，由于果糖不能被有效利用而残留在葡萄酒中，会造成葡萄酒口感失衡；酒中残糖的存在具有引发微生物污染的危险。
因此酵母对果糖的利用率是葡萄酒酵母选育工作的一项重要内容。
二、材料与方法
（一）材料
1.菌株
酵母菌株（采自宁夏御马葡萄酒有限公司葡萄种植园，经分离纯化得到的6株野生酵母菌株）
2.试剂和药品
（1）主要药品
葡萄糖、D-果糖、蔗糖、酵母粉、蛋白胨、琼脂、TTC、硫酸二乙酯（DES）、硫代硫酸钠、β-巯基乙醇、乙二胺四乙酸（EDTA）、聚乙二醇（PEG-4000）、95%乙醇、H2SO3、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、NaCl、CaCl2、蜗牛酶、纤维素酶、半胱氨酸盐酸盐、浓硫酸、咔唑
（2）主要试剂配方
5%半胱氨酸盐酸盐溶液：
称取生化试剂纯半胱氨酸盐酸盐0.375g，用蒸馏水溶解,并稀释定容至25mL。
0.12%咔唑酒精溶液:
称取咔唑30.0mg，用无水酒精溶解并定容至25mL，放置在棕色瓶中，24h后使用。
硫酸溶液:
量取分析纯浓硫酸450mL，在不断搅拌下徐徐倒入190mL蒸馏水中。
标准果糖溶液:
称取干燥的分析纯果糖125.0mg，用蒸馏水定容至25mL（5mg/mL），备用。
使用时稀释100倍（50µg/mL）。
0.2mol/LKH2PO4溶液：
精确称取2.72gKH2PO4加热溶于蒸馏水中，定容到100mL。
0.2mol/LK2HPO4·3H2O溶液：
精确称取4.56gK2HPO4·3H2O加热溶解于蒸馏水中，定容到100mL。
0.2mol/L磷酸缓冲液（PB）：
量取12.3mLK2HPO4·3H2O溶液和87.7mLKH2PO4溶液混合即得PH6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液。
高渗缓冲液：
用0.2mol/L磷酸缓冲液配制的4.0%N
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