烟草组培苗实验步骤.docx

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烟草组培苗实验步骤

烟草组培苗实验步骤

烟草叶片的组织培养

一、实验原理与实验步骤

在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。

从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：

起动期、分裂期和形成期。

植物材料：

烟草植株

药品：

（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1mol/LNaOH、1mol/LHCL蒸馏水、70%酒精0.01%升汞

仪器：

玻璃杯 、玻璃棒、pH试纸（5.5-9.0）  、1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、  1个无菌白瓷板 、 培养瓶若干    移液器、  微波炉、  灭菌器、  超净工作台、   酒精灯、  解剖刀、  镊子

二、实验方法与步骤

1、MS培养基母液的配制

母液

成分

规定量（mg/L）

浓缩倍数

称取量

（mg）

母液定溶体积（ml）

配1LMS培养基吸取量（ml）

编

号

种

类

倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。

2、微量元素母液的配制

按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签

3、铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。

4、有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。

5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。

（1） 制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。

（2） 称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。

生长调节剂母液配制：

   为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。

   不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。

激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。

称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。

三、培养基配制和灭菌

本次实验使用 

（1）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:

MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L； 

（2）幼芽增殖培养基：

MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L； 

（3）生根培养基：

MS+NAA 0.2 mg/L。

注意事项：

上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后，加入相应激素所得， MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述 

上述培养基均附加3%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8，培养温度25±2℃，光照强2000lx。

母液吸取量的计算                                      

 配制培养基的升数 

公式1：

母液吸取量= 母液体积（CC）×（配制培养基的升数/母液浓缩倍数）

公式2：

母液吸取量= （培养基要求的含量/母液每CC的含量）（各种生长调节剂） 

 各种母液按顺序编号排列 

A. 大量元素；B.CaCl2.2H2O； C.微量元素 ；D.铁盐；  E.有机物；                  

F．生长素萘乙酸（NAA）：

配制0.5mg/ml的NAA称取50mg ， NAA用少量95% 酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml；G..细胞分裂素、激动素（KT）配制0.5mg/ml的KT  称50mgKT用少量1N HCL溶解后,加蒸馏水定容至100ml。

  配制培养基（1000ml） 

1. 琼脂:

 称取5~7g琼脂，加入300ml蒸馏水，加热溶解直至完全溶解为止. 

2. 蔗糖3%用质量较好的白糖代替，称取30g白糖，溶于溶有琼脂的300ml蒸馏水

中。

3、各种母液的吸取（培养基1L） 

（1） 用50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCl2·2H2O母液（B）各100ml 

（2） 分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素（C），铁盐（D）母液各10ml 

（3） 用10ml移液管或吸管吸取有机物（H）10ml 

（4） 移取激素 

   将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至80℃左右，用酸度计或精密PH试纸测定培养基的PH一般要求5.8~6.0，过酸过碱则用1N NaoH和1N HCL调整。

分装：

用一个接有胶管的分装器趁热装培养基，1000ml培养基分装到25-30个三角瓶中，每个三角瓶约30ml左右（一般占试管、三角瓶容量1/4~1/3左右）注：

培养基勿碰瓶壁。

包装：

分装好的三角瓶用封口膜包扎好，标明培养基代号即可进行灭菌。

   用具清理和洗涤：

各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。

四、培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（高压蒸汽灭菌锅的使用方法）

具体操作步骤：

1.  高压锅放水至平把架； 2.  把包扎好的培养基装入高压锅; 

3.  盖上热压锅盖,上紧螺帽（注意对角拧紧螺帽）关上气阀和安全阀. 

4.  然后接通电源. 

5.  压力计升至0.05MPa时，打开放气阀,排除冷空气（此步很重要）。

6.  排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到0.11MPa位置时，开始计算灭菌时间，具体方法：

当压力锅指针升至0.12MPa时，关闭电源，待指针下降至0.11MPa时接通电源，不断重复此操作过程，维持20分钟。

7.  灭菌时间达到20分钟后，除去电源，打开放气阀（注意要逐渐放气）待高压锅内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖（注意对角扭松螺帽）稍待冷后再把培养基取出。

8. 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25℃下保存4天，如果培养基需要贮存较长时间，可在4℃低温下保存。

 灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格，无论哪种型号，操作的步骤都很相近。

   进水→放进培养基→盖紧锅盖→关上放汽阀→检查安全阀→接上加热源→待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气，关上放气阀→0.11MPa（121℃）下灭菌20~25分钟，保持稳定压力→除热源→逐渐打开放气阀→锅内空气排除完后→开放锅盖→稍冷后取出培养基。

五、植物材料表面灭菌——消毒剂灭菌

外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。

这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。

因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。

 1、接种步骤：

第一步：

清理材料→→流水冲洗→→加入吐温（或洗衣粉）清洗 →→自来水冲洗 第二步：

对材料的表面浸润灭菌 ：

 70%酒精浸10-30秒→→无菌水 第三步：

灭菌剂处理→→ 0.1-1%升汞5-8 min（或其他灭菌剂）   第四步：

无菌水进行冲洗 

注意事项：

1.灭菌剂一般要临时配制，现配现用．升汞可以短期储存。

2.对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗3-4次，升汞一般5-8次，每次不少于3min 。

3.灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底。

4.灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。

5.灭菌液要充分浸没材料。

2、无菌操作可按以下步骤进行：

（1）在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌； 

（2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯； （3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等； （4）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。

然后搽拭工作台面； 

（5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干； 

（6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等； 

材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。

（如叶片切成0.5cm2的小块；茎切成含有一个节的小段。

微茎尖要剥成只含1-2片叶原基）在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。

（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。

六、烟草叶片愈伤组织的诱导和不定芽的分化

（1）于超净台中彻底冲洗外植体；70%酒精消毒3min；无菌水冲洗3遍，每遍3min；将烟草叶片残留的水分用灭过菌的滤纸吸干；白瓷板上用消毒的解剖刀分割为1-1.5cm2的小块； 接入相应的MS培养基上，每瓶接种4-5块。

接入

（1）中培养。

（2）约2～3d后，叶片外植体卷曲、增厚、膨胀；

（3）15d后外植体脱分化形成疏松絮状浅黄绿色的愈伤组织，愈伤组织诱导率为100%

（4）30d后，从叶片外植体产生的疏松愈伤组织上分化出许多浅黄绿色芽点

（5）60d后，不仅从愈伤组织上分化出越来越多幼芽，芽诱导频率（芽数/块愈伤组织）为25～35，而且还可观察到，该愈伤组织较早分化产生的幼芽叶片呈现不同程度白化（或缺绿）。

但此时若将此缺绿幼芽切下，转接至不加2,4-D的幼芽增殖培养基

（2）上。

（6）3～5d后即可恢复正常，缺绿症状消失，并可不断增殖，发育成绿色健壮

的小苗。

七、诱导生根及移栽与数据记录

取约3～4cm长的无根小苗接种于生根培养基（3）中，约7～8d后，几乎所有外植体均从其基部产生白色幼根，根诱导频率为3～5，部分在培养基表面的根具大量白色根毛。

当试管苗长至5～6cm高时，打开瓶口，在散射光下放置2d后取出，洗去根部残留培养基，种植于经过消毒的珍珠岩、泥炭土和菜园土等量混合的基质中，成活率可达95%以上。

烟草叶片愈伤组织诱导情况

编号

每瓶接种数

愈伤组织诱导率

愈伤组织状态

染菌率

烟草叶片愈伤组织再生植株情况

编号

分化率

每个愈伤组织分化芽数

分化情况

染菌率

烟草叶片诱导生根情况

编号

生根率

生根情况

再生植株分化根数

染菌率