玉米成熟胚的切胚和消毒方式对愈伤诱导的染菌影响.docx
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玉米成熟胚的切胚和消毒方式对愈伤诱导的染菌影响
玉米成熟胚的切胚和消毒方式对愈伤诱导的染菌影响
1.玉米成熟胚概述
玉米的果皮和种皮紧密地结合在一起，很难分离。
所以，一粒玉米其实是一个果实。
但是人们习惯上将玉米的果实称为种子。
其实，像玉米粒一样属于果实而不是种子的还有小麦、玉米、水稻等禾本科植物的子实，生物学上将它们统称为颖果[1]。
玉米成熟胚在玉米粒中的一侧，被黄色的胚乳包裹。
玉米成熟胚包括两个部分，子叶和胚。
子叶是异型子叶，由来在于胚体的背腹极性。
玉米胚是一个胚轴，其顶部是具胚芽鞘的胚芽，中部是具侧生子叶（盾片）的胚轴，下部是具胚根鞘的胚根。
盾片从背面到腹面包住整个胚轴系统，在胚的腹面上可见从盾片边缘衍生的左、右侧鳞的边缘相迭，只在接缝线的上、下端留下蝌蚪状的小孔，使胚芽鞘和胚根鞘的末端稍露出[2]。
2.浸泡与切胚方式
在进行切胚前，首先要对胚进行消毒和适当的浸泡。
种子的浸泡可以使干燥的种子易于分离出胚和切胚。
季丽丽[3]等的研究认为，浸泡天数对愈伤组织的出愈率基本没有影响，主要影响种子浸泡的软硬程度。
浸泡天数过长会使种子发芽，消耗一部分胚，对成熟胚诱导不利。
经实验表明，种子浸泡3d为最好。
种子的切胚要在无菌环境中进行，可以在超净工作台上，采取合适的切胚方式。
赵锦慧等[4]设计了4种切胚方式：
I是将成熟胚完整的取出，放于诱导培养基上；II是将胚取出后，切去芽鞘和根鞘后放于诱导培养基上；11I是将切去芽鞘和根鞘的胚沿胚轴纵切为两部分；1V是在Ⅲ的基础上将每部分在横切一次，最终分为四部分。
多数实验表明，沿胚轴纵切可以提高诱导率，原因在于植物器官间有相互制约，不易脱分化，但是在切胚后，造成两个半胚有机械损伤，有利愈伤组织形成，同时也抑制胚的直接发生[6]。
，玉米成熟胚中更易处于脱分化状态的部位是胚芽，1974年Green等[5]首次报道了玉米成熟胚（胚芽）可以诱导愈伤组织。
3.灭菌方式
3.1.灭菌
对于培养皿、培养基、操作器材等，都用高压蒸汽灭菌法进行灭菌；植物激素的灭菌方法一般有过滤头灭菌、紫外线灭菌和高温灭菌。
植物激素存在与热不稳定性，但郑艳霞[7]的研究证明，BA、NAA在高温灭菌条件下失效很少，基本不影响其效果发挥。
3.2胚的消毒
较常见的消毒方法有2种。
第1种是一步消毒法，操作过程是取成熟玉米种子在自来水下冲洗干净，然后在超净工作台上用70％酒精表面浸泡1～5min，0．1％升汞灭菌5—15min；灭菌后的种子用无菌水清洗3—6次，然后进行浸泡处理，将浸软的种子置于超净工作台上，分离出成熟胚，接种于诱导培养基上[8～12]。
第二种是采用两步消毒法，即取胚前消毒和取胚后消毒。
操作过程是用75％乙醇和0．1％升汞分别消毒1min、15min，用无菌水冲洗4～5次，浸泡18—24h，剥胚前再用0．1％升汞消毒5～10min，无菌水冲洗4～5次，剥去种皮和胚乳，将成熟胚盾片向上接种在培养基上[13～16]。
常用消毒剂包括酒精、氯化汞和次氯酸钠。
氯化汞作为最为常用的消毒剂，杀菌能力最强，但它对外植体的伤害也最大，且不易去除，一般使用0.01％～1％低浓度。
消毒时间过长会对成熟胚造成污染，消毒时间在5min以上时，胚无污染现象，但8min以上时，胚周围均有发黑现象，消毒时间越长，发黑症状越严重[17]。
因此，综合污染情况以及诱导与继代情况，确定最适合的消毒时间为5—7min[18]。
次氯酸钠也是一种植物组织培养中常用的消毒剂，它可以释放出活性氯离子，从而杀死菌体.其消毒能力很强，而且消毒后氯气很容易挥发而不会因为消毒剂残留而对材料造成伤害，对环境无害。
实验表明，2%次氯酸钠溶液处理玉米种子平玉2B8min以上，处理玉米种子神508min以上，处理玉米种子神5610min以上均达到了较好的消毒效果[19]。
参考文献
[1]王常知.巧妙分离玉米粒的种皮和果皮[J].中学生物学.2013,29
（2）.
[2]冯九焕，徐雪宾，刘向东，章崇玲，梁秀兰，吴万春.ACTABOTANICASINICA[J].2003,45（6）.
[3]季丽丽，关淑艳，张君，等。
成熟胚愈伤诱导及再生条件优化[J].玉米科学,2011,19（5）.
[4]曹银萍，陈颖，荆海燕.玉米成熟胚培养研究进展[J].安徽农业科学，2010，38（27）：
14858—14859.
[5]GreenCE，PhillipsRL，KlceseRA．Tissuecultureofmaize（ZeamaysL.）：
initiation．mainu：
nance．andorganicgrowthfactors．CropSci，1974，14：
54—58.
[6]贾秀苹.玉米成熟胚愈伤组织诱导及再生体系建立[D].甘肃：
甘肃农业大学，2008:
06-01.
[7]郑艳霞.不同灭菌条件下植物激素对植物组培快繁的影响[J].山东林业科技,2011,41（6）.
[8]HuangxQ，WeiZM．High-frequencyplantregenerationthroughcallusinitiationfrommatureembryosofmaize（ZeamaysL．）[J]．HamCellRep，2004，22：
793—800．
[9]项艳，吴大强，江海洋，等。
玉米优良自交系成熟胚再生体系的建立[J]．激光生物学报，2007，16（5）：
649—654．
[10]王延鹏．玉米成熟胚愈伤组织的诱导[OL]．中国科技论文在线，http：
／／www．paper．edu．en／releasepaper／content／2007:
1l—118．
[11]王世玉，郑用琏，刘亚，等．玉米成熟胚胚性愈伤组织的诱导、高频再生及转化的研究[J]作物学报，2008，34（3）：
423—428．
[12]贾秀萍，王汉宁，张金文，等．2，4．D和NAA对成熟玉米种子不同外植体胚性愈伤组织诱导效果的影响[J]．甘肃农业大学学报，2008（6）：
48—51．
[13]曹俊梅，窦秉德，李生强，等．基因型及生长调节物质对玉米
成熟胚培养的影响[J]．淮阴师范学院学报：
自然科学版，2005，4
（2）：
154—158．
[14]曹俊梅，窦秉德，李生强，等．玉米幼胚和成熟胚愈伤组织分化反应性[J]．新疆农业大学学报，2005，28
（2）：
10—13．
[15]张立军，赵成吴，葛超．玉米再生体系建立及其影响因素的研究[J]．玉米科学，2008，16
（2）：
77—79，87．
[16]陈勋基，危晓薇，李建平，等．玉米自交系成熟胚愈伤组织诱导和再生体系研究[J]．新疆农业科学，2011，48
（1）：
30—34．
[17]赵锦慧.玉米成熟胚愈伤组织诱导与继代培养的影响因素研究[J].河南农业科学,2009（7）.
[18]王洪振，陈徐，黄二冲，程军，周晓馥，刘春明，金太成.玉米种子消毒条件的优化及成熟胚愈伤组织诱导的研究[N].2014-11.（4）.
[19]郭丽红,陈善娜,龚明,刘家忠,司伟,鲁春华.玉米根尖和成熟胚的愈伤组织培养及悬浮系的建立[N].1999,21
（2）.
摘要：
华玉9号玉米粒是干燥、有种衣的农用种子，经过浸泡的预实验说明，此种子的浸泡时间不宜超过3d，否则溶解的种衣随水侵入种子内部，染红胚，造成细菌繁殖，胚腐烂坏死。
玉米胚具背腹极性，胚轴有侧生子叶，仅仅取胚后消毒时，相比较一般的取胚前消毒和两步消毒法，消毒效果不好，易染菌；但是2％次氯酸钠消毒8min的效果比75％酒精消毒3-4min的好。
同样在取胚后消毒，0.1％升汞消毒5min，清洗4-5次，再用75％酒精消毒3min的效果比2％次氯酸钠消毒8min、75％酒精消毒3-4min更加好；但是切胚时存在子叶，会增大染菌几率。
关键词：
玉米成熟胚切胚灭菌胚消毒
目录
玉米成熟胚的切胚和消毒方式对愈伤诱导的染菌影响1
1.前言1
2.材料与方法1
2.1材料1
2.1.1原料1
华玉9号玉米粒（带种衣）1
2.1.2试剂1
2.1.3仪器与器材1
2.2实验过程1
2.2.1培养基母液配制1
2.2.2玉米成熟胚的预处理3
2.2.3培养基制作及灭菌3
2.2.4培养皿及器材的灭菌4
2.2.5配制激素溶液及灭菌4
2.2.6玉米成熟胚的消毒及切胚4
2.2.7接种、培养5
3.染菌情况5
4.结果分析7
4.1取胚时刻与消毒7
4.2切胚方式与消毒9
5.培养基未凝固分析10
参考文献10
1.前言
在玉米成熟胚的愈伤诱导培养过程中存在污染，会造成培养的幼苗生长缓慢甚至培育失败。
除去操作环境、培养基、培养皿等的灭菌形成的无菌环境，胚的消毒是关键。
不仅要最大限度的对胚进行消毒，还要控制消毒的时间和强度，以免损伤胚，伤害外植体，所以，要选择适合的消毒剂和消毒时间。
切胚方式影响玉米成熟胚的愈伤诱导率，而切胚方式与染菌影响关系不明。
为研究切胚方式及胚的消毒方式对愈伤诱导的染菌影响，与一般实验消毒成熟胚的时刻不同，采取取胚后消毒的方式，再进行切胚，通过观察染菌的胚数，研究切胚方式与消毒方法对愈伤诱导的染菌影响。
2.材料与方法
2.1材料
2.1.1原料
华玉9号玉米粒（带种衣）
2.1.2试剂
硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、碘化钾、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素VB1、盐酸吡哆醇VB6、烟酸VB5或VPP、蔗糖、琼脂、95％酒精、75％酒精、碳酸氢钠、无菌水、升汞溶液、IAA、NAA、6-BA、0.1mol/LNaOH溶液。
2.1.3仪器与器材
高压蒸汽灭菌锅、光照培养箱、超净工作台、万用电炉、250ml锥形瓶×6、1000ml锥形瓶×2、500ml锥形瓶×2、500ml棕色广口瓶×4、1L容量瓶×4、90mm直径培养皿×200、量筒、移液枪、枪头、玻璃棒、烧杯、刀片、滤纸、镊子、胶头滴管、酒精灯、火柴、封口膜、记号笔。
2.2实验过程
2.2.1培养基母液配制
表1：
MS培养基配方
成分
分子量
使用浓度（mg/L）
大量元素（母液Ⅰ）
硝酸钾
101.11
1900
硝酸铵
80.04
1650
磷酸二氢钾
136.09
170
硫酸镁
246.47
370
氯化钙
147.02
440
微量元素（母液Ⅱ）
碘化钾
166.01
0.83
硼酸
61.83
6.2
硫酸锰
223.01
22.3
硫酸锌
287.54
8.6
钼酸钠
241.95
0.25
硫酸铜
249.68
0.025
氯化钴
237.93
0.025
铁盐（母液Ⅲ）
乙二胺四乙酸二钠
372.25
37.3
硫酸亚铁
278.03
27.8
有机成分（母液ⅣA）
肌醇
100
甘氨酸
2
盐酸硫胺素 VB1
0.1
盐酸吡哆醇 VB6
0.5
烟酸VB5或VPP
0.5
有机成分（母液ⅣB）
蔗糖
342.31
30g/L
琼脂
7g/L
1、配制大量元素（母液Ⅰ），微量元素（母液Ⅱ），有机成分（母液Ⅳ）。
母液Ⅰ为10倍浓缩液，母液Ⅱ，母液Ⅳ为100倍浓缩液，每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L。
2、配制铁盐（母液Ⅲ）。
母液Ⅲ同为为100倍浓缩液，将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1L，保存在棕色玻璃瓶中。
2.2.2玉米成熟胚的预处理
买回来的华玉9号玉米粒是干燥、有种衣的农用种子。
种衣是红色薄膜状物体，紧贴玉米粒，作用是在种植后可以融化分解防虫害。
所以，种子浸入清水后，易将清水染红，需要多次清洗直至清水不再变红，然后加入清水浸泡12～24h。
经过浸泡的预实验说明，此种子的浸泡时间不宜超过3d，否则溶解的种衣随水侵入种子内部，染红胚，造成细菌繁殖，胚腐烂坏死。
在在胚消毒之前，先取胚。
胚的体积占整粒玉米的30％左右，重量占整粒玉米的10％～12％[1]，玉米的果皮和种皮紧密地结合在一起,成熟胚在玉米粒中的一侧，被黄色的胚乳包裹。
取胚时，用镊子剥开玉米表皮，分离白色的胚和黄色、乳黄色的胚乳。
由于经过浸泡12h，胚乳易与玉米成熟胚分离。
分离出的胚置于干净的平板上，待用。
2.2.3培养基制作及灭菌
（1）配制培养液用量筒从各种母液中分别取出所需的用量：
母液Ⅰ为100ml，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA各10ml。
各种母液一起放入烧杯中。
（2）称取7g琼脂；30g蔗糖；
（3）在1L大烧杯中加入称取好的琼脂和蔗糖。
（4）加水定容至1升，在万用电炉上边加热边搅拌至琼脂全部溶解，溶液透亮。
（6）调pH用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸（5.4～7.0）测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止（培养基的pH必须严格控制在5.8）。
（7）将培养基分装到200ml锥形瓶中，每瓶约150ml培养基。
（8）瓶口密封。
（9）灭菌。
用高压蒸汽灭菌法。
待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。
在98kPa、115.0℃下，灭菌25min。
在多次制作培养基过程中，某次培养基在高压蒸汽灭菌后倒平板，培养基未凝固。
2.2.4培养皿及器材的灭菌
与培养基灭菌不同的是，培养皿及镊子、刀片、滤纸等器材的灭菌温度是125.0℃，时间15min。
2.2.5配制激素溶液及灭菌
IAA及NAA溶液的配制方法相似，都是用75％乙醇助溶，再加少量的碳酸钠防止晶体析出，最后制成2g/L的植物激素溶液，而6-BA的溶解度小，制成0.1g/L的6-BA溶液。
因为植物激素存在与热不稳定性，为防止植物激素失效，选择超滤头过滤对激素进行灭菌，超滤头在使用前要在高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，最后灭菌的植物激素分别存放在灭菌后的50ml离心管内，待用[2]。
2.2.6玉米成熟胚的消毒及切胚
在超净工作台上，将已分离的玉米成熟胚消毒，然后进行切胚，方式如下，每组接种胚数为300个。
表2：
消毒方式及切胚方式
组数
消毒
切胚
未染菌率
1
2％次氯酸钠消毒8min,无菌水清洗4-5次。
去除芽鞘、胚芽，留侧生子叶及胚轴、胚根。
沿胚轴纵切，两个半胚切面朝下，放置在培养基上。
0％（24h后）
2
75％酒精消毒3-4min，无菌水清洗3-4次。
去除芽鞘、胚芽，留侧生子叶及胚轴、胚根。
沿胚轴纵切，两个半胚切面朝下，放置在培养基上。
0％（24h后）
3
0.1％升汞消毒5min，清洗4-5次，再用75％酒精消毒3min，无菌水清洗4-5分钟。
去除子叶，从胚芽、胚轴处横切，只留下胚芽，切面朝下，放置在培养基上。
9.67％（1星期后）
4
0.1％升汞消毒5min，清洗4-5次，再用75％酒精消毒3min，无菌水清洗4-5分钟。
去除子叶、胚轴、胚根，沿胚芽纵切，两个半胚芽，切面朝下，放置在培养基上。
19.67％（1星期后）
2.2.7倒平板、接种、培养
设计激素浓度梯度为1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L和不加激素；选择两种激素IAA和6-BA。
用移液枪吸取对应含量的激素加入未凝固的培养基中，倒平板。
边切胚边接种。
用灭菌后的镊子将切好的胚转移到培养基上，注意在培养皿打开皿口时要从酒精灯火焰通过，接种完毕关闭皿口也要通过酒精灯火焰。
在接种过程中，随时用75％酒精对手进行消毒，操作时使用的镊子、刀片在每处理3-5个胚，要用火焰灼烧，酒精擦拭冷却后再使用。
接种过程要保证无菌环境，防止外界污染。
接种完毕后，用封口膜将培养皿封口，放入光照培养箱，在黑暗条件下，25℃培养。
3.染菌情况
组1、组2在培养一天后，基本每个胚周围都用一圈淡白色透明物，随培养天数增加，淡白色透明物的范围扩大，呈片状。
相较于组1，组2的染菌情况更加严重，如图。
培养结果：
组1和组2的胚都染菌了，未染菌率为0％.
组1
组2
组3、组4培养1星期后，未染菌率分别为9.67％、19.67％，染菌数量明显比组1、组2少，除个别的胚周围染菌严重，染菌的胚中大部分只有胚周围一小圈染菌。
组别
IAA浓度mg/L
1
2
3
4
5
0
A1
7
6
5
A2
5
7
4.结果分析
4.1取胚时刻与消毒
与常规玉米成熟胚消毒方法不同，本实验是在取胚后消毒，取胚时，所处的环境并不是无菌环境，而是将胚裸露普通实验室的操作台上，用干净的平板盛装。
因此，玉米成熟胚在消毒前是有菌的。
首先是对胚进行消毒，然后切胚，猜测当胚上的菌消毒不彻底时，切胚方式会影响染菌情况。
由组1、组2进行对比，切胚方式相同：
去除芽鞘、胚芽，留侧生子叶及胚轴、胚根。
沿胚轴纵切，两个半胚切面朝下，放置在培养基上。
但是两者的消毒方法不一样，而用75％酒精消毒3-4min，其染菌情况明显比2％次氯酸钠消毒8min严重，说明，2％次氯酸钠消毒8min比75％酒精消毒3-4min的消毒能力强。
但是王振洪等[3]实验优化了以次氯酸钠为消毒剂的玉米种消毒条件优化研究.结果表明，使用2％次氯酸钠溶液处理玉米种子10min以上达到很好的消毒效果。
三种不同品种的玉米胚在经过2％次氯酸钠溶液消毒8min后，在48h内没有染菌。
王振洪的实验方法是挑选大小均匀饱满的成熟玉米种子，用清水冲洗后用75％乙醇消毒1min，2％次氯酸钠溶液分别消毒4min、6min、8min、10min、12min.然后放入无菌50ml三角瓶中，每瓶10粒种子，加入无菌水，以刚能浸没为准。
玉米种子污染观察将消毒后的种子放入培养箱中进行暗培养，温度设为26℃.每天观察种子生长情况，以种子长菌和无菌水变浑浊为污染标准，并分别于24h、48h、72h和96h进行观察。
相矛盾的是，本实验中玉米胚2％次氯酸钠溶液8min，24h后，胚都染菌。
实验结果两者相差极大。
根据操作过程，区别在于王振洪的实验没有取胚，直接洗净种子后消毒、浸泡，密封培养观察染菌现象；而本实验只在取胚后消毒，消毒前，玉米胚已染菌，并且，相同的消毒方式，取胚后消毒的效果远远不如取胚前消毒。
原因在于，玉米的果皮及种皮能保护种子不受外界机械损伤和防止病虫害入侵，种皮的存在减少胚被污染的几率，起一定的隔离作用；仅仅在取胚后消毒，由于取胚前胚直接裸露在有菌的环境中，胚已被污染，此时2％次氯酸钠溶液消毒8min不能彻底消毒。
而75％酒精消毒3-4min同样消毒不彻底。
4.2切胚方式与消毒
组3与组4的消毒方法相同，在取胚后0.1％升汞消毒5min，清洗4-5次，再用75％酒精消毒3min，无菌水清洗4-5分钟。
组3与组4的切胚方式不同，组3去除子叶，从胚芽、胚轴处横切，只留下胚芽，切面朝下，放置在培养基上；组4去除子叶、胚轴、胚根，沿胚芽纵切，两个半胚芽，切面朝下，放置在培养基上。
两者都是只留胚芽，但组4对胚芽纵切。
实际操作时，组3由于操作不当，切胚时沿胚芽与胚轴下切，带少部分胚轴，因为玉米胚的结构，胚轴具侧生子叶并且胚轴与子叶不能完全分离。
所以，组3切胚时带有少部分的胚轴及子叶。
组4切胚时不带子叶及胚轴。
当组3培养24h后，观察到带有少部分胚轴及子叶的胚芽染菌，没有带少部分胚轴及子叶的胚芽没有染菌。
结果组4的未染菌率高于组3。
预测实验结果应该组3的未染菌率高于组4，因为对胚纵切会使胚芽切口扩大，胚芽上的菌进入胚芽内部，加快染菌速度。
实际结果与预测相反，由于切胚的方式不同，同时组3没有完全去除胚轴及子叶，实验没有控制变量，无法准确对比，但可以通过对组3胚芽培养的观察推测是胚轴及子叶的存在造成高染菌率。
猜测是由于玉米子叶可以储存营养物质，菌体在上面繁殖快，造成带有少部分胚轴及子叶的胚芽易染菌、染菌快。
5.培养基未凝固分析
郑文静等[4]总结了培养基不能凝固的原因。
当培养基灭菌前凝固，灭菌后不凝固的情况时，原因是蔗糖和有些激素如吲哚乙酸在高温灭菌时容易酸化，致使培养基的pH值在灭菌后下降，而琼脂在酸性环境下不易凝固。
灭菌前应该调pH值到5.8。
但实际上配制培养基时，确实将pH值调至5.8，由于没有确认培养基是否在灭菌前能凝固，只能猜测灭菌前pH值没有调至5.8，或者琼脂在培养基中分布不均，导致培养基不能凝固。
解决办法，配制培养基时在各种母液、蔗糖加入大烧杯后，定容至1L，调pH值至5.8，分装到200ml锥形瓶中，再分别向200ml锥形瓶中添加相应质量的琼脂，密封，放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌。
参考文献
[1]庞晓霞，阮竞兰.国内外玉米脱胚机发展现状[J].包装与食品机械，2014
（1）.
[2]郑艳霞.不同灭菌条件下植物激素对植物组培快繁的影响[J].山东林业科技,2011,41（6）.
[3]王洪振，陈徐，黄二冲等.玉米种子消毒条件的优化及成熟胚愈伤组织诱导的研究[J].吉林师范大学学报（自然科学版）,2014（4）.
[4]郑文静等.植物组织培养操作过程中的常见问题及其解决办法[J].辽宁农业科学,2001
（2）.
[5]裴冬丽，李成伟，韩秀英，吴建宇.玉米成熟胚离体培养体系的建立[J].玉米科学，2011，19
（2）：
77～79，83.
[6]曹银萍，陈颖，荆海燕.玉米成熟胚培养研究进展[J].安徽农业科学，2010，38（27）：
14858—14859.
[7]贾秀萍，王汉宁，张金文，等．2，4-D和NAA对成熟玉米种子不同外植体胚性愈伤组织诱导效果的影响[J]．甘肃农业大学学报，2008（6）：
48—51．
[8]郭丽红,陈善娜,龚明,刘家忠,司伟,鲁春华.玉米根尖和成熟胚的愈伤组织培养及悬浮系的建立[N].1999,21
（2）.
[9]祁婧．玉米成熟胚的组织培养试验.[J].现代农村科技．2014（18）．
[10]陈莉，窦秉德，阮元元，沈芳，张永霞，李亚林，曾俊梅.甜玉米成熟胚的组织培养及其植株再生研究[J].江苏农业科学.2006（6）.
[11]刘萍.玉米成熟胚愈伤组织诱导体系的建立[D].武汉：
华中农业大学植物科学技术学院，2014：
6-6.
[12]朱永平，和凤美，周苏文，赵磊峰.糯玉米优质高产栽培技术及发展前景[J].玉米科学,2002,10
（2）.
[13]彭泽斌，田志国.我国糯玉米产业现状与发展战略[J].玉米科学,2004,12（3）.
[14]刘晓涛.甜玉米的营养价值及其加工现状的研究[].农业工程技术·农产品加工,2009（3）.
[15]赵锦慧.玉米成熟胚愈伤组织诱导与继代培养的影响因素研究[J].河南农业科学,2009（7）.
[16]王世玉，郑用琏，刘亚，等．玉米成熟胚胚性愈伤组织的诱导、高频再生及转化的研究[J]作物学报，2008，34（3）：
423—428．
[17]王常知.巧妙分离玉米粒的种皮和果皮[J].中学生物学.2013,29
（2）.
[18]冯九焕，徐雪宾，刘向东，章崇玲，梁秀兰，吴万春.ACTABOTANICASINICA[J].2003,45（6）.
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