酵母蔗糖酶的提取及性质测定.docx

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酵母蔗糖酶的提取及性质测定

引论及原理

酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。

本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。

本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。

蔗糖酶（invertase）（β—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranosidefructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。

不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。

每水解1mol蔗糖，就生成2mol还原糖。

还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。

在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。

酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。

常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。

酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。

啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。

本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。

一、蔗糖酶的提取与部分纯化

（一）实验目的

学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。

（二）实验原理（略）

（三）实验仪器、材料及试剂

　　仪器

1.高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱

2.电子天平、研钵（＞200ml）、制冰机、50ml烧杯

3.离心管（2ml，10ml，30ml或50ml）、移液器（1000ul）或滴管、量筒

　材料及试剂

1.市售鲜啤酒酵母（低温保存）

2.石英砂（海沙）、甲苯（使用前预冷到0℃以下）

3.95%乙醇（预冷－20℃）、去离子水（使用前冷至4℃左右）

4.Tris-HCl（pH7.3）缓冲液

（四）操作步骤

1.提取

（1）将市售鲜啤酒酵母2000rpm，离心10min，除去大量水分。

（2）将研钵稳妥放入冰浴中。

（3）称取50g鲜啤酒酵母，加30g石英砂放入研钵中，加50ml预冷的甲苯（边研边加）或预冷的去离子水，在研钵内研磨成糊状，然后每次缓慢加入预冷的10ml去离子水，边加边研磨以便将蔗糖酶充分转入水相。

共加75ml去离子水，研磨约40~60分钟，使其成糊状液体。

（注：

研磨时可用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎）。

（4）将混合物转入50ml（或分装入2个30ml）离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机离心，

4℃，15000rpm，15min。

观察结果：

如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。

　（4）用移液器（或滴管）吸出上层有机相（弃掉）。

（5）用移液器小心地取出脂肪层下面的水相液转入量筒，量出体积，并记录。

（6）取出2ml放入2ml离心管中（标记为粗级分I，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。

剩余部分转入清洁的小烧杯中。

2.热处理

（1）将盛有粗级分I的小烧杯迅速地放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃棒温和搅动。

（2）取出小烧杯，迅速用冰浴冷却，转入清洁的离心管中（根据量大小选择离心管），4℃，15000rpm，离心15min。

（3）将上清液转入量筒，量出体积，并记录。

（4）取出2ml放入2ml离心管中（标记为热级分II，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。

剩余部分转入清洁的小烧杯中。

3.乙醇沉淀

（1）将盛有热处理后的上清液放入小烧杯，在冰浴下逐滴加入预冷的等体积（逐滴加入）95%乙醇，温和搅拌、放置，需1小时。

（2）转入清洁的离心管中，用4℃，15000rpm，离心15min，倾去上清，并滴干。

（3）离心管中沉淀用5~8mlTris-HCl（pH7.3）缓冲液充分溶解（若溶液混浊，则用离心管，4000rpm离心除去不溶物），转入量筒，量出体积，并记录。

（4）取出2ml放入2ml离心管中（标记为醇级分Ⅲ，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。

剩余部分转入清洁的小烧杯中，用于下一步实验。

（注：

离心管中沉淀也可盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存，用时再处理）

（五）实验结果与分析

记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现，可进行分析讨论。

（六）注意事项

二、DEAE-纤维素层析纯化蔗糖酶

（一）实验目的

学会离子交换柱层析法纯化蛋白的方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。

（二）实验原理（略）

（三）实验仪器、材料及试剂

　仪器

1.核酸蛋白检测仪、自动部分收集器、蠕动泵、层析柱、梯度混合器

2.滴管、真空泵或抽滤瓶、烧杯等。

材料及试剂

1.0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.3）

2.0.5mol/LNaOH

3.0.5mol/LHCl

4.含100mmol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl（pH7.3）液

5.DEAE-纤维素

6.2%蔗糖溶液

7．Benedict试剂：

称取柠檬酸钠173g及碳酸钠（Na2CO3•H20）100g加入600mL蒸馏水中，加热使其溶解，冷却，稀释850mL。

另称取17.3g硫酸铜溶解于100mL热蒸馏水中，冷却，稀释至150mL。

最后，将硫酸铜溶液徐徐地加入柠檬酸－碳酸钠溶液中，边加边搅拌，混匀，如有沉淀，过滤后贮于试剂瓶中可长期使用。

（四）操作步骤

1.离子交换剂的处理

（1）称取6克DEAE纤维素（DE-23）干粉，加水浸24小时抽干（真空泵或抽滤瓶）后放入小烧杯中；

（2）加入0.5mol/LNaOH溶液（约50ml），轻轻搅拌，浸泡0.5小时后抽干，用去离子水洗至近中性，抽干后放入小烧杯中；

（3）加50ml0.5mol/LHCl,搅匀，浸泡0.5小时后抽干，用去离子水洗至近中性，放入小烧杯中；

（4）用0.5mol/LNaOH重复处理一次，用去离子水洗至近中性后，抽干备用。

本实验可直接用0.5mol/LNaOH浸泡1小时，抽干水洗至中性。

因DEAE纤维素昂贵，用后务必回收。

按“碱→酸”的顺序洗即可，因为酸洗后较容易用水洗至中性。

碱洗时因过滤困难，可以先浮选除去细颗粒，抽干后用0.5mol/LNaOH溶液处理，然后水洗至中性备用。

2．装柱与平衡

（1）先将层析柱垂直装好，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱（装量为柱长2/3或离柱顶端3~4cm，柱内纤维素要均匀，不要出气泡）；

（2）用0.05mol/LpH7.3Tris-HCl起始缓冲液平衡（约100ml流出液即可），以流出液pH与缓冲液一致为准。

3.　上样与洗脱

（1）将剩余小烧杯中的醇级分Ⅲ用滴管取1.5ml小心地沿柱壁加到层析柱中，不要扰动柱床。

（注意上样量：

分析用量一般为床体积的1%~2%，制备用量一般为床体积的20%~30%）

（2）用滴管小心地沿柱壁加入起始缓冲液约5ml；

（3）用0.05mol/LTris-HCl，pH7.3的缓冲液进行NaCl（0~100mmol/L）线性梯度洗脱。

层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为50ml0.05ml/LTris-HCl，pH7.3的缓冲液和50ml0.05mol/LTris-HCl，pH7.3的缓冲液，其中含100mmol/LNaCl。

　洗脱流速为0.5ml/分~1ml/分，使用部分收集器连续收集洗脱液，每管接收4ml。

记录每管A280。

至混合器中液体流完为止。

　（4）每隔4管（或取A280值高的几个峰值）做酶活力的定性测定，确定活性最高的几管合并（约20ml即可），转入量，量出体积，并记录。

（5）取出2ml放入2ml离心管中（标记为柱级分IV，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。

剩余部分用于下一步实验。

（标记为柱级分IV）。

蔗糖酶活力的定性测定方法：

取1干净试管加入2%蔗糖溶液1.5ml，蔗糖酶溶液0.5ml,37℃恒温水浴保温15分钟后，加入Benedict试剂1ml，沸水浴2~3分钟。

观察桔红色沉淀多少。

（五）实验结果与分析

记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现，可进行分析讨论。

（六）注意事项

三、蔗糖酶活性及蛋白质浓度的测定

（一）实验目的

学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，用Nelson方法测定酶活力。

掌握各步骤的实验原理和方法。

（二）实验原理

本实验以Nelson方法测定酶活力，其原理是还原糖含有的自由醛基或酮基，在碱性溶液中将Cu2+还原成氧化亚铜，糖本身被氧化成羟酸，砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色溶液，在510nm下有正比于还原糖的吸收，从而可确定酶的活力，测定范围：

25~200µg。

本实验用考马斯亮蓝结合法测定蛋白浓度，考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。

考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。

当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250－蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。

在一定范围内，考马斯亮蓝G250－蛋白复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。

（三）实验仪器、材料及试剂

仪器

　1.722型（或7220型）分光光度计、电子分析天平、恒温水浴箱

　2.量筒、容量瓶、移液器、试管。

材料及试剂

1.考马斯亮蓝（G250）染液（0.01%）：

称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml浓磷酸（市售质量百分渡为85%），然后加蒸馏水定容至1000ml。

2.0.9%NaCl溶液

3.牛血清标准蛋白液（0.1mg/ml）：

准确称取牛血清蛋白0.1g，用0.9%NaCl溶液溶解并稀释至1000ml。

4.4mmol/L葡萄糖、4mmol/L蔗糖、0.5mmol/L蔗糖。

5.0.2mol/L乙酸缓冲溶液（pH4.5）：

（1）0.2mol/LNaAC：

称取27.616gNaAC溶解并定容至1000ml。

（2）0.2mol/LHAC：

100ml乙酸（分析纯）定容至500ml。

（3）将两者分别取315ml、185ml混合，用强碱调pH到4.5。

6.Nelson试剂：

A试剂：

100ml溶剂中含Na2CO32.5g，NaHCO32.0g，酒石酸钾钠（酒石酸钠）2.5g，Na2SO420g。

B试剂：

100ml溶剂中含CuSO4•5H2O15g，浓H2SO42滴。

以A：

B=50：

2比例混合即可使用，使用前需在37℃以上溶解，防止溶质析出。

7.砷钼酸试剂：

100ml中含钼酸铵5g，浓H2SO44.2ml，砷酸钠0.6g。

（砷酸钠有毒，实验中注意）

（四）操作步骤

1．各级分蛋白质浓度测定

（1）蛋白质浓度测定――标准曲线的制备

取7支干净试管，按表1编号并加入试剂混匀。

以吸光度平均值为纵坐标，各管蛋白含量作为横坐标作图得标准曲线。

（或将数据代入线性回归方程，求出Y？

和r？

）

表1　考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度――标准曲线的绘制

编　号

标准蛋白液/ml

—

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.9%NaCl/ml

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

考马斯亮蓝/ml

蛋白含量/μg

室温静置5min

A595nm　

（2）各级分蛋白浓度的测定

取9支干净试管，每级分做两管，按表2编号并加入试剂混匀。

读取吸光度值。

以各级分的吸光度的平均值查标准曲线即可求出蛋白质含量。

各级分应进行一定倍数的稀释，先试做，选其吸光度值在标准曲线内，即蛋白含量应在10~80μg的稀释度为宜。

表2各级分蛋白浓度的测定

编　号

粗级分I/ml

热级分II/ml

醇级分III/ml

柱级分IV/ml

0.9%NaCl/ml

考马斯亮蓝/ml

蛋白含量/μg

各级分应进行一定倍数的稀释，先试做，选其吸光度值在标准曲线内，即蛋白含量应在10~80μg的稀释度为宜

室温静置5min

　A595nm　

A595nm平均值

各级分蛋白浓度mg/ml

2．各级分蔗糖酶活性的测定

（1）蔗糖酶活性的测定――标准曲线的制作

　　取9支试管，按表3加样。

以吸光度值（O.D）为纵坐标，以还原糖（葡萄糖含量，μmol）作为横坐标作图得标准曲线。

（或将数据代入线性回归方程，求出Y？

和r？

）

（2）各级分蔗糖酶活性测定

取9支干净试管，分两组，按表4编号并加入试剂混匀。

各级分酶液应进行一定倍数的稀释，先试做，选其吸光度值在标准曲线内，即还原糖含量应在0.08~1.2μmol的稀释度为宜。

读取吸光度值。

以各级分的吸光度的平均值查标准曲线即可求出蛋白质含量。

编号

4mmol/L葡萄糖/ml

－

0.02

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

—

4mmol/L蔗糖/ml

－

0.2

蒸馏水/ml

0.98

0.95

0.90

0.85

0.80

0.75

0.70

0.80

葡萄糖量/μmol

0.08

0.2

0.4

0.6

0.8

1.2

Nelson试剂

向每管中加入1mlNelson试剂，盖上塞子，置于沸水浴中20分钟，再冷至室温

（在碱性条件下糖被氧化，将Cu2+还原成氧化亚铜（Cu20）

砷钼酸试剂

向每个管中加入1ml砷钼酸试剂，5分钟　

（砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色溶液）

蒸馏水/ml

向每个管中加入7ml蒸馏水，充分混匀

A510nm

表3　Nelson法测定蔗糖酶活性――标准曲线的绘制

表4各级分蔗糖酶活性测定

样品

空白

粗级分I

热级分II

醇级分III

柱级分IV

编号

乙酸缓冲液/ml

0.2

蒸馏水/ml

0.6

0.5mol/L蔗糖/ml

0.2

各级分酶液/ml

—

？

室温时间/min

10分钟

Nelson试剂

向每管中加入1mlNelson试剂，盖上塞子，置于沸水浴中20分钟后冷至室温

砷钼酸试剂

向每个管中加入1ml砷钼酸试剂，5分钟

蒸馏水/ml

向每个管中加入7ml蒸馏水，充分混匀

1　A510nm

2　A510n

A510nm平均值

（3）活力和比活力的计算

活力单位（U）：

酶在室温，pH=4.5条件下，每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需酶量。

根据测得结果，计算出各步数据填入下表

各级分样液

体积/ml

蛋白mg/ml

总蛋白mg

活力U

总活力U

比活力U/mg

提纯倍数

回收率

粗级分I

热级分II

醇级分III

柱级分IV

（五）实验结果与分析

记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现，可进行分析讨论。

（六）注意事项

四、蔗糖酶纯度测定

（一）实验目的

学会操作步骤，掌握实验原理，能够分析实验结果。

（二）实验原理

（三）实验仪器、材料及试剂

仪器

1．电泳仪、电泳槽

2．微量取样器、染脱色装置

材料及试剂

1．凝胶贮备液：

丙烯酰胺（Acr）29.2g亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g　加蒸馏水至100ml，外包锡纸，4℃冰箱保存30天内使用

2.凝胶缓冲液（1.5mol/LTris-HCl，pH8.8）：

18.15gTris（三羟甲基氨基甲烷），加约80ml蒸馏水，用1mol/LHCl调pH到8.8，用蒸馏水稀释至最终体积为100ml，4℃冰箱保存．

3．电极缓冲液（5*TBE）：

使用1*TBE。

4．质量浓度为10％过硫酸铵：

此溶液需临用前配制

5．溴酚蓝溶液：

5ml50%甘油+5ml电极液+数滴溴酚蓝

6．染色液：

0.25g考马斯亮蓝R250，加入91ml50％加甲醇，9ml冰醋酸。

7．脱色液：

50ml甲醇，75ml冰醋酸与875ml蒸馏水混合。

（四）操作步骤

1．8%凝胶的配制、灌胶、上样

（1）8%PAGE凝胶

溶液成分

总体积10ml

蒸馏水/ml

30%丙烯酰胺/ml

凝胶缓冲液/ml

TEMED/ul

10%Ap/ul

4.8

2.66

2.5

（2）用滴管吸取凝胶，在电泳槽的两玻璃板之间灌注后插入梳子，待凝胶聚合后，将梳子取出。

（3）将各步留液（I、II、III、IV）稀释成1~2mg/ml蛋白，上样量20μl（蛋白稀释液与溴酚蓝溶液1：

1混合上样）。

每级分酶液样占一个泳道。

（注：

若酶液蛋白浓度低，可增加上样量）

3．电泳

接上电泳仪，上样端接电源的负极，打开电泳仪电源开关，调电压80V，30分钟后加大到120V，待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1cm时，停止电泳。

4．剥胶、染色与脱色：

小心将胶取出，置于染脱色装置中，染色30min，脱色30min后更换一次脱色液，直至背景清晰。

（五）实验结果与分析

绘出凝胶电泳图谱，分析各步纯化后酶的纯度情况。

（六）注意事项

五、蔗糖酶Km值测定及脲素的抑制作用

（一）实验目的

　　了解米氏常数的意义，学会测定蔗糖酶米氏常数的方法；了解底物浓度和抑制剂对反应速度的影响，掌握确定抑制类型的方法。

（二）实验原理

酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数Km值等于酶促反应速度为最大速度的一半时所对应的底物浓度，其数值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特性常数。

不同酶的Km值不同，同一种酶在与不同的底物反应时，其Km值也不同。

Km反映了酶和底物亲和能力的强弱程度。

大多数纯酶的Km值0.01~100mmol/L之间。

酶的活力可以被某些物质激活或抑制，凡能降低酶的活性甚至使酶失活的物质，称为酶的抑制剂，酶的活力抑制有可逆抑制和不可逆抑制两种。

而可逆的抑制又包括有竞争性抑制，非竞争性抑制等类型，在有抑制剂存在条件下，酶的一些动力学性质发生改变，如Km，纵轴交点为1/Vmax，横轴交点为-1/Km。

本实验以米氏公式

利用双倒数法作图，（1/V对1/[S]）,实验推导得出Km，并推导出抑制类型，Vmax等，通过实验的方法，可以确定出抑制类型。

（三）实验仪器、材料及试剂

仪器

　1.722型（或7220型）分光光度计、电子分析天平、恒温水浴箱

　2.量筒、容量瓶、移液器、试管。

材料及试剂

　1．0.2mol/L乙酸缓冲液

2．0.5mol/L蔗糖溶液

　3．8mol/L脲

4．Nelson试剂：

（每组30ml）

5．砷钼酸试剂：

（每组30ml）

（四）操作步骤

1.Km值的测定

（1）时间作用曲线

取11支试管，按表5加样操作。

以时间为横坐标，以产物量为纵坐标，制作时间作用曲线。

酶液的稀释倍数以测定酶活力时得出的稀释倍数为准。

表5时间作用曲线的制做

编号

0.2mol/L乙酸缓冲液

向各管中加0.2ml

0.5mol/L蔗糖/ml

向各管中加0.1ml

蒸馏水/ml

向各管中加0.6ml

酶液（稀释的IV）

0管不加作空白，其余各管中加0.1ml

保温时间（分钟）

Nelsol试剂

向各管加入Nelsol试剂1ml，置沸水浴中20分钟，再冷至室温

砷钼酸试剂

向各管中加1ml砷钼酸试剂，5分钟

蒸馏水

向各管中加7ml水，充分混匀

A510nm

（2）底物浓度的影响

　取9支试管编号，按表6加样操作。

以1/[s]对1/v作图，求Km值。

表6　酵母蔗糖酶Km值的测定

编号

0.2mol/L乙酸缓冲液

向各管中加0.2ml

0．5mol/L蔗糖/ml

0.2

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.2

0.4

蒸馏水/ml

0.4

0.6

0.58

0.56

0.54

0.52

0.5

0.4

0.2

酶液（稀释的IV）

0管不加作空白，其余各管中加0.2ml

保温时间（分钟）

室温放置10分钟

Nelsol试剂

向各管加入Nelsol试剂1ml，置沸水浴中20分钟，再冷至室温

砷钼酸试剂

向各管中加1ml砷钼酸试剂，5分钟

蒸馏水

向各管中加7ml水，充分混匀

A510nm

2．脲的抑制

取9支试管，按表7加样操作（做两组，求平均）。

以1/[s]对1/v作图，与底物影响之双倒数图对照比较，推出抑制类型。

表7　脲对蔗糖酶的抑制类型测定

编号

0.2mol/L乙酸缓冲液

向各管中加0.2ml

0．5mol/L蔗糖/ml

0.2

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.2

0.4

8mol/L脲/

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