辛伟滑子菇液体发酵培养基的优化研究090910培训资料.docx
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辛伟滑子菇液体发酵培养基的优化研究090910培训资料
辛伟-滑子菇液体发酵培养基的优化研究-09.09.10
滑子菇液体菌种的发酵培养基优化
辛伟1洪永聪2
（1青岛农业大学资源与环境学院，山东青岛266109；2青岛农业大学生命科学学院）
摘要：
以滑子菇液体菌种为研究对象，通过单因子、双因子以及正交试验，优化出最佳发酵培养基。
通过单因子和双因子试验，优选出适合滑子菇液体培养的最佳碳源是玉米粉和葡萄糖，最佳配比为3:
2；最佳氮源是麸皮和蛋白胨，最佳配比为2:
1；无机盐最佳添加量为0.05%硫酸镁和0.05%磷酸二氢钾，生长因子最佳添加量为0.005%维生素B。
通过正交试验以及验证，确定滑子菇液体菌种的最佳培养基配方为：
玉米粉3.0%，葡萄糖2.0%，麸皮2.0%，蛋白胨1.0%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.05%，维生素B0.005%，豆油0.03%。
关键词：
滑子菇；液体发酵；培养基；优化
MediumoptimizationofthebatchfermentationofPholiotanamekios
XINWei1HONGYong-cong2*
（1CollegeofResourceandEnvironment,QingdaoAgricultureUniversity,Qingdao,266109China;2CollegeofLifeScience,QingdaoAgricultureUniversity）
Abstract:
Singlefactor,doublefactorsandorthogonaltestingmethodswereemployedforthemediumoptimizationofthebatchfermentationofPholiotanamekio.Theresultsofsinglefactoranddoublefactorsexperimentsshowedthatthebestcarbonsourceshouldbecornflourandglucose,thebestnitrogensourcebewheatbranandpeptone,thebestaddtionofinorganicsaltbe0.05%magnesiumsulfateand0.05%potassiumdihydrogenphosphate.Thebestratioforcornflourandglucosewasprovedtobe3:
2andthebestratioforwheatbranandpeptonebe2:
1.Basedontheorthogonaltestingexperiment,theoptimalmediumformulationshouldbe3.0%cornflour,2.0%glucose,2.0%wheatbran,1.0%peptone,0.05%magnesiumsulfate,0.05%potassiumdihydrogenphosphateand0.03%beanoil.
Keywords:
Pholiotanamekio;batchfermentation;medium;optimization
滑子菇（Pholiotanamekio），又名滑菇、光帽鳞伞，日本叫纳美菇，属于珍稀品种，滑子菇每100g鲜菇含蛋白质1.1g、脂肪0.2g、糖2.2g，并含有钙、磷、铁、钠及维生素B1、B2，子实体的热水提取物——多糖体，可预防葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎杆菌、结核杆菌的感染，是很有发展前途的保健食品和出口创汇产品[1-4]。
培养基是提供食用菌生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物，培养基的恰当与否是食用菌液体培养的关键条件之一[5-8]。
滑子菇对碳源的利用相当广泛，既可以利用成分复杂的、缓慢利用的复合碳源，如玉米淀粉、玉米粉等，又可以利用单糖和双糖等小分子快速利用碳源。
滑子菇对氮源的利用也相当广泛，按其化学性质可分为无机氮，主要有铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐等；有机氮，主要包括蛋白质及其不同程度的降解物，如蛋白胨、氨基酸、酵母膏、尿素等；复合氮源，如黄豆粉、麸皮、玉米浆等。
滑子菇所需的营养物质之间应有适当的比例，考虑碳源、氮源时，要注意的是快速利用的碳（氮）源和慢速利用的碳（氮源）的相互配合，发挥各自的优势，避其所短，选用适当的碳氮比[9-19]。
因此，本文以滑子菇为研究对象，通过单因子、双因子以及正交试验，研究液体菌种的最佳发酵培养基配方，为滑子菇的工厂化栽培打下基础，为滑子菇的液体发酵提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试菌种
滑子菇（Pholiotanamekios），由青岛旭松康大食品有限公司提供。
1.1.2种子培养基
母种斜面培养基：
马铃薯20%，葡萄糖2%，麦麸3%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.15%，MgSO40.3%，琼脂2%。
液体种子培养基：
马铃薯20%，麦麸3%，葡萄糖1%，红糖1%，酵母粉0.25%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%，维生素B110mg/L。
1.1.3液体发酵基础培养基
碳源供试基础培养基：
蛋白胨0.6%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，豆油0.05%，维生素B10.01%，再分别加入3%的各种碳源。
氮源供试基础培养基：
葡萄糖2%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，豆油0.05%，维生素B10.01%，再分别加入3%的各种氮源。
碳氮比供试基础培养基：
磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，豆油0.05%，维生素B10.01%，再分别加入不同碳氮比的碳、氮源组合。
硫酸镁供试基础培养基：
葡萄糖2%，玉米粉3%，蛋白胨0.3%，磷酸二氢钾0.1%，维生素B10.01%，豆油0.05%。
磷酸二氢钾供试基础培养基：
葡萄糖2%，玉米粉3%，蛋白胨0.3%，硫酸镁0.05%，维生素B10.01%，豆油0.05%。
维生素B1供试基础培养基：
葡萄糖2%，玉米粉3%，蛋白胨0.3%，硫酸镁0.05%，，磷酸二氢钾0.1%，豆油0.05%。
1.2试验设计
1.2.1碳源对滑子菇液体培养的影响
不同碳源对滑子菇生物量的影响：
在碳源供试基础培养基中添加5%的各种碳源，包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、乙醇、玉米淀粉、麸皮、玉米粉等，每组试验重复3次，通过细胞干重法测定其生物量，通过菌丝球直径来看其形态大小，通过方格计数法测定其菌丝球数量。
1.2.2氮源对滑子菇液体培养的影响
氮源对滑子菇生物量的影响：
在氮源供试基础培养基中添加各种氮源，其中，无机氮（硝酸钾、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵）加0.6%，有机氮中蛋白胨、酵母膏、尿素为0.6%，复合有机氮（黄豆粉、麸皮、玉米浆）添加3%，每组试验重复3次，通过细胞干重法测定其生物量，通过菌丝球直径来看其形态大小，通过方格计数法测定其菌丝球数量。
1.2.3碳氮比对滑子菇液体培养的影响
设计十个不同的处理（表1），从而确定最佳的碳氮比。
测定各个处理的生物量，并测定初始pH及终点pH。
试验重复3次，记录相应数据。
表1滑子菇液体培养的不同碳氮比处理
处理
a
b
c
d
e
f
g
h
i
j
玉米粉
4
4
4
3.5
3
3
2.5
2
1.5
1
葡萄糖
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
麸皮
1
1.5
2
2
2
2.5
2
2
3
4
蛋白胨
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1.2.4无机盐对滑子菇液体培养的影响
硫酸镁对滑子菇生物量的影响：
在硫酸镁供试基础培养基中分别添加0.001%、0.003%、0.005%等8种硫酸镁浓度，测定各个处理滑子菇的生物量，重复3次。
磷酸二氢钾对滑子菇生物量的影响：
在磷酸二氢钾供试基础培养基中分别添加0.01%、0.02%、0.03%等11种磷酸二氢钾浓度，测定各个处理滑子菇的生物量，重复3次。
1.2.5维生素B对滑子菇液体培养的影响
在维生素供试基础培养基中分别添加0.001%、0.002%、0.003%等10种维生素B（B1，B2）浓度，测定各个处理滑子菇的生物量，重复3次。
1.2.6正交试验优化滑子菇液体培养的最佳培养基
根据以上确定的碳源、氮源、无机盐及维生素的含量，进行三个水平、四个因子的正交试验（表2），每个试验组重复3次，测定各个处理滑子菇的生物量，取平均值。
根据正交试验确定的最佳培养基结果，进行试验验证，进一步确定最佳培养基的组成，重复3次。
表2滑子菇液体培养基的正交试验因素水平表
因素
水平
玉米粉
（A）
葡萄糖
（B）
麸皮
（C）
蛋白胨
（D）
1
2.5%
1.5%
1.5%
0.5%
2
3.0%
2.0%
2.0%
1.0%
3
3.5%
2.5%
2.5%
1.5%
1.3滑子菇的液体发酵条件
滑子菇的液体培养采用500ml锥形瓶，装400ml培养基，接种量为0.1%，采用通气式培养6d，前3d采用通气量为60L/min的气泵，后三天采用通气量85L/min的气泵，22±1℃下培养。
1.4滑子菇液体发酵生长量的检测方法
1.4.1菌丝球数量的测定
取5ml的发酵液，按比例在量筒中加水稀释，摇匀后取lml在直径1.5cm的培养皿中摊匀，培养皿下垫黑白相间的格纸，用方格计数法计数。
1.4.2菌丝球直径的测定
随机取菌球20个，成直线排列，测其总长度，重复3次，取平均值。
1.4.3生物量的测定——细胞干重法
取5ml的发酵液，40目过筛，菌丝体经蒸馏水充分洗涤，80℃真空干燥至恒重，电子天平准确称重，按下式计算生物量：
生物量（kg/m3）=（DCB/V）*l05，式中DCB为细胞干重（kg），V为取样体积（ml）。
1.4.4发酵液pH的测定
取发酵液5ml，采用便携式pH计直接测量。
1.5数据分析
试验数据采用计算机统计软件MicrosoftExcel与SAS-8进行分析。
各处理平均数间的多重比较采用邓肯氏新复极差测验（Duncan），差异显著性水平定为α=0.05，极差异显著性水平定为α=0.01。
2结果与分析
2.1滑子菇液体发酵培养基的最佳碳源选择
不同碳源对滑子菇生物量影响的测定结果（表3）显示：
在单糖和双糖中，滑子菇对葡萄糖的利用效果最好，菌丝干重达到76.51mg/ml，其次是麦芽糖，而对蔗糖的利用效果最差，这一结果说明醛糖比酮糖更容易被滑子菇菌丝利用。
在多糖中，玉米淀粉是滑子菇最好的碳源，菌丝干重达到61.08mg/m1，其次是麸皮、玉米粉，而对可溶性淀粉的利用效果最差。
此外，滑子菇对醇类的利用效果是所有碳源中最差的，菌丝干重仅为12.45mg/m1。
表3不同碳源对滑子菇生物量的影响
碳源
菌丝干重
（mg/ml）
菌球直径
（mm）
菌球数量
（个/ml）
葡萄糖
76.51a
3.87d
436c
果糖
65.32b
3.53e
401d
蔗糖
40.13d
4.19c
236e
麦芽糖
73.91ab
4.02cd
442c
乳糖
63.99b
4.21c
396d
可溶性淀粉
32.68e
5.01ab
460bc
乙醇
12.45f
2.31f
108f
玉米淀粉
61.08b
5.31a
489ab
麸皮
58.42bc
4.87b
477b
玉米粉
53.23c
5.26a
502a
2.2滑子菇液体发酵培养基的最佳氮源选择
不同氮源对滑子菇生物量影响的测定结果（表4）显示：
滑子菇对大多数有机氮的利用效果较好，可以说，麸皮、玉米浆、黄豆粉、蛋白胨都是不错的氮源，生物量都较高，但滑子菇对尿素的利用效果最差，菌丝干重仅为22.3mg/m1。
表4不同氮源对滑子菇生物量的影响
碳源
菌丝干重
（mg/ml）
菌球直径
（mm）
菌球数量
（个/ml）
硝酸钾
39.1d
3.31d
376bc
硝酸铵
54.9b
3.87c
388b
氯化铵
43.1c
3.34d
333c
硫酸铵
42.0c
3.21d
321c
蛋白胨
63.3ab
4.55b
405ab
酵母膏
52.1b
2.99e
297d
尿素
22.3e
1.11f
109e
黄豆粉
65.2ab
4.87ab
433a
麸皮
70.10a
5.22a
401ab
玉米浆
68.9a
4.50b
422a
2.3滑子菇液体发酵培养基的最佳碳氮比选择
不同碳氮比对滑子菇生物量和pH影响的测定结果（图1）显示：
不同的碳氮比对滑子菇的生物量有很大影响，在碳源在一定的范围内，随着氮源的增加，生物量也随着逐渐增加，当碳氮比组合为e时（玉米粉：
葡萄糖：
麸皮：
蛋白胨为3:
2:
2:
1），生物量达到最大值。
而当氮源一定时，生物量会随着碳源的减少而减少。
但从图不难看出，碳源、氮源并非是越多越好，其必须有一恰当的配比才能达到最好的效果。
碳氮比不仅对生物量有影响，其对培养基的pH也有一定的影响。
测定培养基灭菌后的pH值，发现，氮源过多是，HP值会偏高；而碳源过多时，会出现HP值会偏低。
不同的起始pH值导致了培养终点的不同的pH值。
可以看出，两条曲线基本是平行的，说明在培养的过程中，pH值的变化基本是相同的。
但是，由于过高或过低的pH值都不利于菌丝的生长。
图1不同碳氮比对滑子菇生物量、初始pH和终点pH的影响
综上所述，可以得出：
氮源过多，则菌体繁殖旺盛，pH值偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则菌体衰老和自溶。
另外，碳氮比不当还会影响菌体按比例吸收营养物质，直接影响菌体生长和产物的形成。
从中可以看出，滑子菇对碳的需求要比氮的量多，这是由于碳既做碳架又做能源，所以用量要比氮多。
2.4滑子菇液体发酵培养基的无机盐添加量确定
硫酸镁添加量对滑子菇生物量影响的测定结果（图2）表明：
与对照相比，添加不同量的硫酸镁会对菌丝生长有一定的促进作用。
当添加量小于0.05%时，随着其含量的增加，滑子菇生物量也成正比例增加，当含量为0.05%时，达到最大值；然后，生物量随着硫酸镁含量的增加成下降趋势。
这说明，低浓度的硫酸镁对菌丝生长有促进作用，高浓度反而不利于其生长。
所以，在滑子菇液体培养基中应添加硫酸镁的量为0.05%。
图2硫酸镁添加量对滑子菇生物量的影响
磷酸二氢钾添加量对滑子菇生物量影响的测定结果（图3）表明：
磷酸二氢钾的添加会对菌体生长有重要影响，浓度低于0.05%时，菌体生长会与其成正比例的增加，浓度大于0.05%后，促进效果会逐渐减差，这说明磷酸二氢钾的促进浓度最佳为0.05%。
另外，其也是缓冲液，有助于培养基维持菌丝所适的酸碱度，有利于菌丝的生长。
图3磷酸二氢钾添加量对滑子菇生物量的影响
2.5滑子菇液体发酵培养基的维生素添加量确定
维生素B添加量对滑子菇生物量影响的测定结果（图4）表明：
添加维生素B对菌体的生长有明显的促进作用，生物量有了显著提高。
按本试验的培养基，当维生素B的含量为0.005%时，促进效果最好。
图4维生素B添加量对滑子菇生物量的影响
2.6滑子菇液体发酵培养基的优化
根据以上的单因子试验中的结果，选择出了最适碳源、氮源、无机盐的含量以及合适的维生素的含量，进行三个水平四个因子的正交试验，各处理调pH值为6.5，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.05%，维生素B0.005%，豆油0.03%。
每个试验组重复三次，取平均值，根据正交试验的结果，确定最佳培养基的组成。
滑子菇液体发酵培养基正交试验的统计分析结果（表5）表明：
由极差结果可知，玉米粉（A）含量对菌丝干重的影响最大，因此，在培养基中要控制好其含量；对蛋白胨（D）和麸皮（C）的含量也要控制；而对葡萄糖（B）的用量要求就不是很严格了。
从极差分析结果来看，使生物量最大的因子水平组合应是A2B2C2D2。
表5滑子菇液体发酵培养基正交试验的统计分析结果
因素
处理
玉米粉
（A）
葡萄糖
（B）
麸皮
（C）
蛋白胨
（D）
菌丝干重
（mg/ml）
1
2.5%
1.5%
1.5%
0.5%
73.28
2
2.5%
2.0%
2.0%
1.0%
83.56
3
2.5%
2.5%
2.5%
1.5%
70.64
4
3.0%
1.5%
2.0%
1.5%
78.21
5
3.0%
2.0%
2.5%
0.5%
85.64
6
3.0%
2.5%
1.5%
1.0%
82.41
7
3.5%
1.5%
2.5%
1.0%
76.14
8
3.5%
2.0%
1.5%
1.5%
75.33
9
3.5%
2.5%
2.0%
0.5%
80.31
K1
227.5
227.6
231.0
239.2
K2
246.3
244.5
242.1
242.1
K3
231.8
233.4
232.4
224.2
R
18.8
16.9
11.1
17.9
3结论
因此，很容易发现，在复合碳源中，玉米淀粉和玉米粉在生物量、菌球直径以及菌球数方面都是最佳的碳源，而小分子则以葡萄糖、果糖最佳。
考虑到生产中的成本，确定以玉米粉为复合碳源，小分子以葡萄糖为碳源。
由于复合碳源是缓慢利用的营养物质，而小分子碳源有快速被菌体吸收的特点，为了相互弥补不足，通过在复合碳源中添加小分子碳源来达到最佳碳源的效果。
其原因是，小分子碳源葡萄糖在前期提供碳源，使滑子菇在短期内大量生长缩短了停滞期，快速进入生长期；而复合碳源玉米粉在后期及时的补充了营养，满足了菌丝体的营养需求，使其在对数生长期、稳定期均有较好的营养条件。
从而，两者的最佳配比可以相互补充，使滑子菇的菌丝干重达到最多。
另外，通过以上分析不难发现，两者的最佳配比还可以缩短发酵周期，主要是小分子葡萄糖缩短了停滞期，从而使整个培养过程缩短8小时左右。
由以上分析得知，最佳的碳源即为3%玉米粉和2%葡萄糖，能够达到最多的生物量，花费最短的培养时间，从经济效益出发，是最符合实际生产的碳源组合。
就无机氮而言，虽然滑子菇可以利用，但其效果不是很好。
因为使用无机氮源时，菌丝必须利用无机氮合成其需要的各种氨基酸，而某些氨基酸几乎或者完全不能生物合成，另一方面可能的原因是，由于NH4+的利用会使培养基酸化，而NO3-则更易使培养基pH升高，从而导致不恰当的pH值，影响了菌丝的生长。
因此，滑子菇虽然能利用无机氮，但生长缓慢，生物量较低。
有机氮效果好的原因可能是，有机氮源中含有丰富的蛋白质、多肽、脂肪酸、维生素、游离氨基酸且氨基酸的种类较齐全，滑子菇能直接利用氨基酸和其他有机含氮化合物中的各种不同结构的骨架来合成菌体生长所需要的蛋白质和其他细胞物质，而无需从糖代谢的分解产物中来合成各种所需的物质。
另一方面，滑子菇在分泌淀粉酶后才能利用培养基中的缓慢利用碳源物质，在此之前，无机氮源和蛋白胨等快速利用氮源在碳源缺乏的条件下，有可能部分充当了提供能源的角色，因此影响了最终菌体生长阶段对氮源总量的需求。
另外，在选择氮源时，还要考虑培养基产生泡沫的情况，在以上的氮源中，玉米浆、黄豆粉与其它氮源相比，产生的泡沫最多，泡沫的增多，会使氧传递系数减少，严重时造成大量逃逸，发酵液从排气管路或轴封逃出而增加染菌机会，所以，最佳的氮源是麸皮、蛋白胨。
而麸皮是迟效氮源，蛋白胨是速效氮源，两者的合理配比将会达到最佳的效果。
通过验证试验，按A2B2C2D2的配方进行三次试验，结果是菌丝干重达到88mg/m1，这说明了滑子菇液体发酵的最佳培养的配方应是：
玉米粉3.0%，葡萄糖2.0%，麸皮2.0%，蛋白胨1.0%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.05%，维生素B0.005%，豆油0.03%。
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