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化合物黄酮提取以及检测方法
目录
摘要：
1
关键词：
1
第一章前言2
第二章银杏黄酮3
2.1银杏黄酮的性质3
2.2银杏黄酮的生理功能及应用4
第三章从银杏叶中提取6
3.1有机溶剂提取7
3.2超临界液体萃取法8
3.3树脂法8
第四章回流法提取银杏叶中的黄铜11
4.1回流提取法的原理与工艺流程11
4.2试剂与仪器12
4.3具体步骤12
4.4结果讨论12
第五章 展望14
参考文献15
摘要：
黄酮类化合物广泛存在于植物中，有文献估计约有20％的中草药含有黄酮类化合物，可见其资源之丰富。
黄酮类化合物主要存在于芳香科、唇型科、豆科、伞型科、银杏科与菌科等。
该类化合物不但分布范围广，种类多，而且生物活性广泛，毒性小。
因此，很多制剂可长期使用，如水飞蓟有保肝作用；葛根素有明显的扩冠作用，已用于临床。
该产品是天然特效药物原料，内、外销已多年，供不应求，具有中国特色及国家垄断性。
一些厂家的主要问题是得率低而成本高，质量低而售价高
关键词：
银杏叶，黄酮，浸取，提纯，回流提取
第一章前言
银杏树是我国的特产植物，其拥有量占世界总量的70％以上。
银杏树具有上亿年历史，被称为植物活化石，誉为植物界的“熊猫”。
我国银杏树占世界总量的80％以上，因此本产品具有中国特色。
银杏树的种子、根、叶均可药用。
银杏叶中主要活性成分为黄酮类化合物和内酯。
目前的研究主要集中在银杏叶的开发利用上。
研究表明银杏叶中的黄酮类提取物，具有相当强的抗氧化作用，能清除生物体内过剩的自由基，阻止体内脂质过氧化，提高机体的免疫力，延缓衰老等。
银杏叶中黄酮类化合物可分为黄酮、双黄酮和儿茶素等三类化合物，共有36种，主要以苷的形式存在，是银杏叶的主要药理成分之一，含量较高，在银杏叶中含量变化较大。
黄酮类化合物质研究始于20世纪30年代。
1932年,日本学者古川周二首先从银杏中提取到银杏双黄酮的混合物;1941年Baker等应用逆流分配色谱法从银杏双黄酮混合物中分离出银杏黄素、异银杏黄素和白果黄素之后,松木武等、游松及Hasler[4]等先后进行了银杏叶黄酮的分离及结构鉴定的研究工作。
到目前为止,已从银杏叶中分离出了38种黄酮类化合物,其中单黄酮及苷28种,双黄酮6种,儿茶素4种,主要以苷的形式存在。
从银杏叶中提取黄酮的传统方法有很多,工艺大致可分为两步:
一是用水或有机溶剂萃取银杏叶,制备银杏叶提取物GBE。
然后在前一步的基础上进行精加工,采用树脂法、溶剂法精制GBE,得到较纯品。
第二章银杏黄酮
银杏黄酮又称单黄酮，银杏黄酮的苦元有7种，即栅皮素、山混否黄酮的苛元有7种，即栅皮素、山柰素、异鼠李素、杨梅素、芹菜素、木犀草素、三粒小麦黄酮等，前三种是其主要成分。
其结构式如图1所示。
银杏叶及其提取物（GBE）的质量控制中主要检测这三种黄酮昔元的含量。
银杏黄酮中，懈皮素类的化合物有9个，其糖基主要是葡萄糖和鼠李糖基，有些糖基上还连接有肉桂酰基。
山柰素比栅皮素在3’位少一个酚羟基极性较小，银杏叶中山奈素类化合物有8个。
异鼠李素是懈皮素的3’上经基被甲基化的衍生物，银杏叶中异鼠李素化合物右4个。
图1银杏叶中3中主要单糖黄酮类的结构
2.1银杏黄酮的性质
银杏黄酮类化合物为酚性成分，属多环多元酚类，由于含有苯并γ-吡酮而形成β-烯醇酮结构，这种烯醇酮结构所表现的特性是黄酮分子中的酚羟基的弱酸性与铁盐的显色反应。
还能与铝形成配合物，使光吸收长移，显较深的颜色，可用于鉴定黄酮类化合物（即铝盐比色法）；同时酚羟基具有还原性，表现在提取加工过程中的氧化变色，在提取分离时可加入还原剂进行保护。
银杏黄酮类的化合物的苷元多为结晶体，苷多为无定形粉末。
黄酮苷类由于在结构中引入糖基，故均有旋光性，且多为左旋。
银杏黄酮、黄酮醇及其昔类分子含有7，4’-位助色团，颜色为深黄色；在紫外光下产生荧光，可用于银杏黄酮类化合物的定性检验。
银杏黄酮类化合物的苷元一般难溶于或不溶于水，可按于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、乙醚等有机溶剂及稀碱溶液中。
银杏黄酮苷元与糖结合成苷后，水溶性相应增大，一般可溶于热水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙能中，难溶于乙醚、石油醚、苯、氯仿等有机溶剂。
银杏黄酮类化合物因分子中具有酚羟基而显弱酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺等。
2.2银杏黄酮的生理功能及应用
1、银杏叶黄酮类化合物能扩张血管，增加外周血液循环的血流速度，降低血胆固醇，改善胆固醇和磷脂比例，抑制血栓的形成。
从银杏叶中提出的黄酮类化合物用于豚鼠离体心脏灌流，会引起冠状血管扩张，并对大鼠后肢血管有扩张作用。
银杏叶中含有20余种黄酮类化合物，包括黄酮、异黄酮、双黄酮等，以口服液、糖衣片的形式出现，用做降压、降血脂的辅助治疗药物。
我国20世纪70年代初研制的舒血宁，实验证明对抗盐酸肾上腺素所致的离体免耳血管收缩，并呈现血管扩张，血流量显著增加。
2、能促进大脑循环代谢，改善记忆功能，增加脑缺血时脑组织ATP和磷酸肌酸的含量，降低乳酸含量，对脑缺血具有明显保护作用。
3、松弛支气管的作用。
早期的临床研究证明，银杏叶中的黄酮类物质有抗组胺和乙酰胆碱所致的脉鼠支气管收缩及由于组胺所致脉鼠哮喘都有止喘效果。
4、具有抗菌消炎、抑制致癌启动因子（TPA）及治疗过敏症和老年痴呆病等作用。
银杏叶中的提取物可用于烧伤、烫伤、放射病、脓毒病、胰腺炎等急救，银杏叶黄酮（FG）可阻止因苯巴比妥引起的肝微粒体adriamycyl自由基的形成，从而达到保护肝的作用。
5、银杏叶黄酮类化合物还能促进毛发生长，减少脱发，因此可应用到护发剂中。
通过促进体表毛细血管的血液循环，可以清除皮肤表面的过氧化物和自由基，所以把银杏叶黄酮类提取物添加到护肤化妆品中能滋润皮肤，减少黑色素的形成，延缓皮肤的衰老过程。
6、杨胜远和陈桂光等研制的银杏叶黄酮芒果汁保健饮料是将银杏叶中提取的黄酮物质添加到芒果澄清汁中配制成的保健饮料。
郑秀莲等提取出银杏中的黄酮类化合物，以灵芝为主料，配以银杏黄酮、白糖、柠檬酸等配制成灵芝杏叶保健饮料。
潜学基等则先采用“沸水—热醇”两步法分离提取银杏叶，得到银杏叶提取物，将其浓缩到黄酮类化合物总含量为0.1％一0.15％，再将其加工成银杏叶功能性保健软糖。
由于以银杏叶为原料提取银杏黄酮制成的药物，用于对心血管、脑血管、动脉硬化、高血压等疾病的治疗，有其他药物不能达到的特殊疗效。
而且，银杏叶制剂长期服用几乎没有毒副作用。
银杏叶制品还可用于生物农药、保健食品等方面。
由于我国盛产银杏，资源丰富，因此进一步开发利用银杏叶具有非常重要意义。
第三章从银杏叶中提取
银杏叶黄酮类化合物有特殊的药效，以银杏叶提取物——黄酮类化合物制成生物医药的研究已成为当前生物制药的研究热点。
银杏叶黄酮化合物的提取包括银杏叶黄酮化合物的浸取和浸出液的宫集分离两大部分。
浸取是银杏叶黄酮化合物提取的第一步，浸取效率的高低，对产品收率起决定作用。
从银杏叶中浸取黄酮类化合物的方法，目前主要有以下几种：
①水浸取法；②水蒸气蒸馏法；③有机溶剂浸取法。
有机溶剂浸取法所采取的溶剂有甲醇、乙醇、丙酮等，由于有机溶剂的蒸气压高，易燃易爆，而且生产成本高，因此使有机溶剂的使用受到了限制。
根据黄酮类化合物的性质，黄酮类化合物在水中具有一定的溶解度，因此采用水浸取可分离银杏叶有效成分，且水浸成本低，产品安全，无环境污染。
研究结果表明，一般的以水作为浸取剂时的最佳工艺条件为：
银杏叶与水固液质量比为1：
40，浸取温度为90℃，浸取液pH值为8．O时，浸取4次，每次3h，浸出率可高达98．5％左右。
以乙醇作为浸取剂时的最佳浸取条件为：
银杏叶与乙醇的因液比为1：
（5—7），乙醇的浓度为70％，浸取温度为70一80℃，浸取4次，每次lh，浸出率可达95.6%左右。
由于银杏黄酮苦等有效成分的分子中含有碳基、酚性羟基，具有一定的极性，在水中有一定的溶解度。
富集分离这些有效成分应该选用与其结构和极性相近的低分子酮类、酯类和卤代烃等。
张春秀等报道以乙基丁基酮溶剂为萃取剂，从银杏黄酮浸出液中富集分离黄酮类化合物时，发现该方法具有选择性高、分离效果好、生产能力大、可快速连续操作、溶剂损耗少等优点，且产品含量高，是目前银杏黄酮类化合物提取分离的有效方法。
当以乙基丁基酮为萃取剂时，此时提取银杏黄酮类化合物的最佳浸取条件为：
溶液pH＝3—4、萃取温度为60℃左右、萃取时间为30min、萃取两次、萃取率达92％。
银杏叶的粉碎程度也影响浸出率的高低，显然减小颗粒粒度对提高反应是有利的，然而并不是颗粒越细越好。
如果颗粒过细，会增加液体的教度，对固液分离（过滤）以及将进行的富集过程带来分相的困难。
此外，从经济的角度看，过分磨细显然将增加生产成本。
一般以50一70目银杏叶末浸提效果为最好。
目前国内外对银杏叶有效成分的提取精制研究工作都十分重视，国际上掀起了研究开发银杏叶热。
关于从银杏叶中提取黄酮类化合物的生产工艺主要有溶剂提取法、超临界萃取法和树脂吸附法。
3.1有机溶剂提取
有机溶剂提取法就是用有机溶剂进行回流提取，得到粗提液。
有机溶剂提取的优点在于总黄酮的得率较高，提取过程中蛋白质等较少混入，因而不易霉变，且后续的过滤、浓缩、干燥等操作也较简单。
此法的关键问题是，在提取过程中要回收有机溶剂、减少污染，降低生产成本，此法在生产实践中得到广泛的应用。
通过有机溶剂（乙醇、丙酮、甲醇等）浸泡叶子，浓缩水析，离心过滤，得到银杏浸膏，产率为12％一15％，黄酮含量20％一50％，再用液—液萃取，得率约0.7％一10％，黄酮含量15％一18％。
欧美国家采用的生产工艺主要有：
①醇（酮）浸提一卤代烃萃取一酮／铵盐萃取法；②酮提取一氨水沉淀一混合酮萃取法；③酮浸提一卤代烃萃取一铅化物沉淀法；④醇（酮）浸提一甲苯／丁醇萃取一树脂法。
以上方法得到的总黄酮含量较高，但是，由于生产过程中使用了卤代烃、甲苯、丁困和铅化物等有毒物质，极易在产品中残留，影响产品的质量，第1、2、4种方法使用了混合溶剂或互溶的溶剂，溶剂的回收再处理困难，费用高。
国内也有学者研究发现新的生产工艺提取银杏叶黄酮类化合物，醇浸提一硅藻土吸附一树脂法。
以丙酮提取为例，从银杏叶中提取黄酮的工艺流程如图2所示。
图2
该工艺采用中等温度50一60℃，40％一60％丙酮浸泡，杂质少；经浓缩、水析过程中加入1—3倍的水，经过水折可去除烷基酚等脂溶性物质；用CCL4等非极性溶剂萃取3次可除去蜡质、叶绿素等脂溶性杂质；沉降中调节pH值8—9或Pb（OH）2沉降，可除去原花青素、蛋白质、高分子单宁等杂质；加入（NH4）2SO4等盐，增加密度，有利于用C4—C9酮
3.2超临界液体萃取法
超临界液体萃取是利用临界或超临界状态的液体及被萃取的物质在不同的蒸气压力下所具有的不同化学亲和力和溶解能力进行分离纯化的操作，超临界萃取和传统的溶剂萃取相比，具有溶质、溶剂易于分离，萃取速度快等优点，所以特别适合于提取或精制热敏性和易氧化的物质，由于所用的萃取剂是气体，容易除去，所得到的萃取产品无残留毒性，所以这种分离方法特别适用于医药和食品工业。
据有关资料，超临界萃取的银杏黄酮、内酯产品，价格约在4000元/kg左右，此价格是化学浸提黄酮、内酪粗提品的2倍。
但是，超临界萃取存在着设备较大、操作困难等问题，难以用于较大规模的生产，所以目前尚未工业化大规模生产。
国内有科学院生态环境研究中心与有关单位合作，进行过小试的超临界CO2提取银杏叶中黄酮类化合物，其工艺流程如图3所示。
图3超临界CO2提取银杏叶中黄酮类化合物工艺流程
3.3树脂法
目前国内GBE加工厂多达近200家，基本上采用树脂法，主要采用溶剂提取一吸附树脂吸附一解吸制备。
树脂法采用各类吸附树脂对黄酮进行吸附和解吸，产品得率为1.0％一3.0％，黄酮含量10％一28％。
大多数厂家采用的ADS系列树脂进行提取的工艺如图4所示。
图4打孔树脂吸附法提取银杏叶黄酮工艺流程
其中粉碎要适度，过粗不利于黄酮的提取，过细不利于过滤；石油醚回流浸提，用量为叶重的6—8倍，常温下回流浸提1h，主要是去除银杏叶表面的蜡质，有利于黄酮的提取；水浸泡，10倍叶重的水在室温下浸泡12h，主要是去除水溶性杂质；乙醇提取，用70％或95％的乙醇，加热至60℃进行回流浸提，浸提3次，每次lh，即得粗提液。
醇提法总黄酮的得率较高，提取过程中蛋白质等较少混入，因而不易霉变；减压浓缩，回收酒精，温度不宜超过60℃；上柱分离纯化，可采用HZ—84l型大孔树脂、DM—130型大孔树脂、AB—8型大孔树脂，上柱，先用去离子水洗至流出液接近无色，再用70％乙醇洗脱，分段收集洗脱液，要注意控制上柱量和流速；干燥，要采用喷雾干燥。
刘成梅等通过静态法对部分国内外树脂的银杏黄酮吸附量进行了初步筛选，发现D140树脂具有最高的吸附量，AB—8次之。
结果表明，D140树脂12个周期反复使用的平均银杏黄酮吸附率达66.61％，产物收率为3.54％，产物黄酮含量为25.54％，是一种综合性能较佳的银杏黄酮专用吸附树脂，已成功地用于工业化生产。
提取工艺流程如图5所示。
图5
此银杏叶黄酮提取液制备提取工艺中采用了水提法和醇提法两种，结果显示当叶重：
提取液为1：
1（质量／体积）时，提取液中黄酮含量约为1mg／m1，黄酮得率为2.5％一3.0％。
两种方法比较，水提法成本低，可以除去脂溶性杂质，如叶绿素；醇提法可去除水溶性较强的杂质，如胶质、躁质、蛋白质、多糖等，但成本高。
银杏提取液须处理对树脂吸附与洗脱有影响，银杏叶提取液无论水提或醇提都是棕黄色浑浊液体。
为了减轻提取液对树脂的污染，延长树脂使用周期，提高提取物的纯度，过树脂柱前需进行预处理。
第四章回流法提取银杏叶中的黄铜
4.1回流提取法的原理与工艺流程
根据活性成分的特性，本实验中主要采用了简单易行、比较常用的有机溶剂提取法来进行有效成分的提取。
溶剂提取法按其实现方式和操作工艺的不同，可分为以下几种：
a．浸渍法；b．渗施法；c．煎煮法；d．回流提取法等。
由于回流提取法是利用易挥发的有机溶剂进行加热提取，并采用冷却装置使溶剂连续回流，使植物有效成分能充分提出，且此法简单易行，溶剂用量少，提取较完全，故本实验中采用了回流提取法。
图6银杏叶中黄铜的提取工艺流程
提取工艺采取回流提取法从银杏叶中提取黄酮的工艺流程如图6所示，回流提取过程实验装置如图7所示。
4.2试剂与仪器
试剂：
芸香叶苷标准品（纯度≥95％），银杏叶，乙醇，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠。
仪器：
紫外—可见分光光度计、粉碎机，烘箱，分析天平，恒温水浴锅，搅拌器，搅拌叶，升降架，冷凝管，温度计（量程100℃），真空泵，三口烧瓶（100ml）容量瓶（10ml、50ml）。
4.3具体步骤
1、银杏黄酮的提取将银杏叶干燥，粉碎，筛分，精确称量20目的银杏叶样品10g。
（1）将其和35mL70％乙醇水溶液加入到100mL带搅拌、冷凝管和温度计的三口烧瓶中进行回流提取，在50℃搅拌提取2h。
（2）将粗提液过滤、抽滤，再用70％乙醇定容至50mL。
（3）定容液中黄酮类化合物的含量用紫外—可见分光光度计测定。
2、银杏黄酮的测定
（1）标准溶液的配制精确称取芸香叶苷5mg，置于50mL容量瓶中，加入适量60%乙醇，在水浴上加热溶解，自然冷却，用60％乙醇稀释至刻度，摇匀。
（2）标准曲线的制作取10mL容量瓶6只，分别准确吸取标准溶液1.0mI、2.0mI、3.0mI、4.0mI、5.0mL置于10mL容量瓶中，另一容量瓶中不加标准溶液（配制空白溶液，作参比）。
然后各加30％乙醇补充至5mI，加入5％亚硝酸钠溶液0.3mI，摇匀，放置6min，再加10％硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，再放6min，加4％NaOH溶液4mL，用水稀释到10mI，放置20min。
在紫外—可见分光光度计上，先取两个2cm比色皿加空白溶液，调零。
取出一个比色皿，分别加入不同浓度的溶液，在波长510nm处测定吸光度，以酮含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（3）未知液中酮含量的测定吸取2mL未知液代替标准溶液，其他步骤均同上，测定吸光度。
由未知液的吸光度在标准曲线上查出2mL未知液中黄酮的含量。
4.4结果讨论
由于银杏黄酮含量较低，所以在提取中过滤定容的移液过程都需用乙醇洗三次，否则会造成含量偏低。
分析过程中，标准液及未知液的配制要充分摇匀和放置，防止因反应不充分或悬浮物不均匀为而造成测量结果不准确
在提取时，乙醇溶剂由于扩散、渗透所用逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解可溶性物质，造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散，溶剂又不断进入药材组织细胞中，如此往返，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡，因此。
溶剂需要一定的浓度，并不是越高越好。
实验以回流温度为80℃，提取时间为3h，当浓度低于60%时，浓度的增加有利于有效成分溶出，当大于60%时，这种促进作用将会消失，甚至过高的乙醇浓度会适得其反妨碍乙醇向细胞内扩散，影响有效成分渗出来，因此应根据条件选择合适的浓度。
第五章 展望
目前,全球对银杏叶提取物制品的需求量日益增多,由于其独特的药理作用和疗效,世界上许多国家正在开发和利用。
近十几年来,欧、美、日等国主要的研究精力放在总提取物、总内酯、总黄酮等有效成分提纯上。
随着研究工作的深入,提取有效成分的工艺也不断更新,总的趋势是朝着提高有效成分收率,减少有害成分和杂质在药物中的残留,减少环境污染等方向发展。
银杏叶深度加工技术的研究不仅会提高我国银杏叶提取物的品牌和档次,还能增强其国际竞争力。
超临界流体技术由于其独特的优点,已成为各国工业界关注的对象,完全有希望在21世纪迅速发展成为工业过程中和实验室首先的萃取技术。
广大研究人员应进一步拓超临界流体萃取技术在天然药物资源上的应用范围,促进国民经济的发展。
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