caspase家族及在细胞凋亡中的作用.docx

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caspase家族及在细胞凋亡中的作用

caspase家族及在细胞凋亡中的作用

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注:

本文仅是基础知识,目前这方面进展十分快，需要更新更多的知识。

如caspase家族目前发现至少14种。

这里仅介绍几种常见的成员。

目的是让大家了解到caspase家族的概况,以及在细胞凋亡中的作用。

一caspase家族蛋白酶的组成

未活化的caspase家族蛋白酶是以酶原形式存在的，酶原的氨基端有一段被称为“原结构域”（pro-domain）的序列.酶原活化时不但要将原结构域切除，并且要将剩余部分剪切成一大一小两个亚基，分别称为P20和P10,活性酶就是由这两种亚基以（P20/P10）2的形式组成的。

这种活化反应也是Asp特异的，剪切发生在酶原中保守序列的Asp与其后的氨基酸残基之间，一般是先切下羧基端的小亚基，然后再从大亚基的氨基端切去原结构域.这种剪切可以是酶原及中间活性酶自我催化，也可以是其它ICE家族蛋白酶的作用，还有其它酶类如颗粒酶B参与。

表5。

caspase家族蛋白酶的识别序列及作用底物

蛋白酶名称

别名

识别序列

底物

caspase1

ICE

YVAD

pro—IL—1β,pro-caspase3,pro—caspase4

caspase4

TX，ICH—2，ICErel-II

pro—caspase1

caspase5

ICErel—III，TY

mICH3

mICH4

caspase2

ICH-1

PARP

caspase9

ICE-LAP6，Mch6

PARP

caspase3

CPP32，Yama,apopain

DEVD

PARP,DNA-PK，SRE/BP,rho—GDI，KCθ

caspase6

Mch2

VEID

laminA

caspase7

Mch3,ICE—LAP3,CMH-1

DEVD

PARP,pro-caspase6

caspase8

MACH，FLICE，Mch5

DEVD

pro—caspase3，4,7,9,10

caspase10

Mch4

YVAD

caspase11

ICH3，FLICE2

CED—3

已命名的caspase家族成员均已克隆成功,它们不但在氨基酸序列上具有同源性，而且在空间结构上也很相似。

目前已经获得了caspase—1（ICE）和caspase—3（CPP32）的X线结晶图像，结果显示它们具有相似的空间结构,在P20的C端和P10的N端有200多个氨基酸残基的序列尤为保守，在空间结构上组成相似的β折叠中心和相邻的α螺旋，保守的、对蛋白酶活性有特殊意义的氨基酸残基均位于这一段，并形成特定的结构。

不同源的序列主要存在于P20的N端和P20与P10交界处，这两个部位的氨基酸残基在蛋白酶活化过程中一般被全部或部分切除。

所有的成员都保守性地包含有与底物P1Asp作用的氨基酸残基，如在ICE中，它们是催化中心的Cys285,与酶/抑制剂复合物的巯基半缩醛以氢键结合的His237,以及可以稳定反应中间物氧阴离子的Gly238。

另外，Arg179、Arg341、Gln383和Ser347形成容纳P1Asp的“口袋”，Ser339靠近Cys285的巯基，以氢键结合P1位的酰胺。

与P2~P4作用的氨基酸残基则变异比较大，这可能是各个成员识别不同底物的特异性之所在。

在活性Cys周围的氨基酸序列也很保守，一般都有Gln—Ala—Cys-Arg-Gly（QACRG）五肽序列,在caspase—8、caspase—10中为QACQG，在caspase—9中是QACGG，这三个成员都有一个氨基酸残基的变异，但这种变异不影响蛋白酶的剪切活性和特异性。

二caspase家族蛋白酶的结构与功能

按照结构同源性的大小，可以将caspase蛋白酶分为三个组，分别以caspase-1、caspase—2和caspase—3为代表。

其中最重要的是caspase—1、caspase—3和caspase-8。

（一）caspase—1（ICE）

（二）caspase-3

（三）caspase—8

（四）其它caspase蛋白酶

（一）caspase-1（ICE）

1。

ICE的结构与生物学作用

ICE即IL-1β转化酶（IL-1βconvertingenzyme），是单核细胞合成的一种蛋白酶，可以将34kD的IL—1β前体（pro-IL-1β）剪切为17kD的成熟IL-1β，这种剪切对于IL-1β活性的发挥是必须的.不表达ICE的细胞系转化IL—1β基因后可以产生pro—IL-1β，但不能分泌有活性的成熟IL—1β；ICE特异性抑制剂可以阻断金黄色葡萄球菌刺激引起的IL—1β的分泌。

ICE属于半胱氨酸蛋白酶，活性中心有高活性的巯基，对氧化剂很敏感，但对丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶的抑制剂不敏感.

（1）ICE活化时的剪切过程：

ICE基因定位于11q13-23，编码的ICE前体（pro-ICE）全长404aa,约45kD，蛋白酶活性中心是位于283～287位置的Gln-Ala-Cys-Arg-Gly（QACRG）五肽序列，其中Cys285是发挥酶切活性的关键残基。

在活化过程中pro—ICE在4个位点Asp103~Ser104、Asp119～Asn120、Asp297～Ser298和Asp316～Ala317进行自我催化剪切形成两个片段P20和P10，P20和P10首先形成异源二聚体，然后两个P20/P10异源二聚体再通过P10小亚基多聚化形成同源二聚体，所以ICE的活性形式是（P20/P10）2。

pro-ICE活化过程中的剪切并不是在四个酶切位点同时进行的，最先被剪切的是第三个位点（Asp297~Ser298）,形成P35和P12两个片段，P35的酶切活性比pro-ICE要高，它既可以进一步在第三个酶切位点剪切其它pro-ICE，还可以剪切其它三个酶切位点，形成P20和P10两个片段,再由P20和P10形成四聚体。

四聚体形式的ICE酶切活性非常强，实验证明即使在单核细胞大量分泌IL—1β时，细胞浆中活性形式的ICE也仅占很小的比例.从pro—ICE上剪切下来的原结构域可以抑制ICE的进一步剪切，这可能是一种反馈机制。

（2）ICE识别的剪切位点和特异性抑制剂：

ICE识别的剪切位点是一个四肽序列,除了在P1位置的Asp外，还要求在P4位置的氨基酸残基具有一个较大的疏水性集团，P2和P3位置上的氨基酸的变异则较大,P1’位置上一般是一个较小的疏水性氨基酸。

根据这一研究结果，人们合成了ICE的人工特异性四肽底物YVAD，醛化的YVAD（Ac—YVAD—CHO）是ICE的特异可逆抑制剂，醯酮化YVAD（Ac-YVAD—CMK）是特异性不可逆抑制剂。

YVAD抑制剂可以抑制单核细胞中成熟IL-1β的释放，而对其它细胞因子的释放没有作用，在体的实验也有同样的结果，说明这些特异性抑制可能具有一定的临床实用前景。

牛痘病毒产生的一种38kD的蛋白质CrmA（cytokineresponsemodifierA）与丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin）很相似，但它并不抑制丝氨酸蛋白酶的活性，反而抑制ICE的活性.研究发现这是因为CrmA的氨基酸序列中有LVAD四肽结构，与ICE的特异性抑制剂YVAD很相似,可以作为假底物结合ICE,阻断ICE对pro—IL—1β的剪切，从而降低IL—1β的分泌。

所以CrmA在病毒感染时可以干扰宿主的炎症反应,促进病毒在体内的复制。

（3）ICE的空间构型：

利用不可逆的抑制剂Ac—YVAD—CMK,Walker等于1994年获得了活性ICE的X线结晶图像.分析发现，ICE是首先由P20/P10构成一个完整的结构域，然后两个相同的结构域再通过P10结合成一个蛋白酶。

在P20/P10异源二聚体中，中心位置是由6个β折叠股组成，其中4个来自于P20呈平行排列，另两个来自P10，其中一个与P20的4个折叠股平行排列，另一个则呈反平行排列。

β折叠股形成的核心周围是由分别来自P20和P10的α螺旋所包围。

两个P20/P10异源二聚体以反平行方式通过P10结合在一起，在外表形成一个可以容纳底物P1Asp侧链羧基基团的“口袋”。

这个“口袋”由P20的Arg179、Gln283和P10的Arg341、Ser347组成,Gly238和His237也参与这种构型的维持，活性中心的Cys285通过氢键与底物结合.对ICE/CED-3家族其它成员的研究发现，在ICE中形成活性中心的氨基酸序列和形成容纳底物的“口袋”的四个氨基酸都很保守，提示它们可能具有相似的空间结构。

2.ICE在细胞凋亡中的作用

Yuan等于1993年将CED-3基因克隆出来，发现它所编码的蛋白质的与人ICE很相似,在一级结构上有28％的同源性.CED—3包含503个氨基酸残基，有100aa富含丝氨酸，与ICE的同源性主要表现在非富含丝氨酸的区域，尤其是羧基端的115aa，与ICE同源性高达43％,其中也包含活性中心QACRG（361~365）.CED—3可能象ICE一样，也是一种半胱氨酸蛋白酶，通过剪切底物蛋白来参与细胞凋亡。

ICE是人体中CED-3的同源物，可以发挥与CED—3相似的作用，参与人体细胞的凋亡过程。

用ATP或过量内素毒素刺激单核细胞，可以通过活化ICE增加IL-1β的分泌,这些刺激同时也可以促进细胞凋亡.将ICEcDNA转染入大鼠成纤维细胞系中过量表达ICE可以引起细胞凋亡，这种凋亡可以被牛痘病毒蛋白CrmA或细胞凋亡拮抗蛋白BCL—2所抑制；如果在转染前将ICE基因中编码酶切活性中心的氨基酸残基（Cys285、Gly287）突变，则不能诱导细胞发生凋亡；将CrmA导入鸡背根神经节细胞可以阻断撤除神经生长因子而引起的神经元细胞的凋亡过程。

但是有些研究与上述结果不相吻合:

稳定高表达IL—1β的细胞系并不自动发生凋亡；ICE基因剔除的小鼠虽然不能分泌成熟IL—β，但其发育并不受影响,也不发生自身免疫性疾病，这些小鼠的胸腺细胞和巨噬细胞在受到特定信号刺激后仍能发生凋亡；在具有ICE活性的细胞中用YVAD抑制ICE活性后,细胞凋亡过程也不受影响；凋亡的鸡细胞DU249的细胞提取液不具有剪切pro-IL—1β的能力，但凋亡的DU249细胞提取液的另一种成分prICE（proteolyticresemblingICE）则可以将不能作为ICE底物的PARP剪切成典型的凋亡片段。

这些结果说明ICE本身可能不是人体细胞凋亡的真正效应剂，至少不是最主要的因素，在人体中可能有其它更重要的ICE样的蛋白酶参与细胞凋亡过程.

（二）caspase-3

1994年Fernandez—Alnemri等在BenBank表达序列标记（expressionsequencetag,EST）数据库中找到一段ICE/CED—3活性中心同源的序列，用它合成探针后，筛选人JurkatT淋巴细胞cDNA文库，从中克隆到一种新基因，因其编码分子量为32kD的半胱氨酸蛋白酶而称之为CPP32（cysteineproteaseprotein,32kD）。

随后，其它学者独立地将这一蛋白基因克隆出来，并分别命名为prICE、apopain（凋亡素）和Yama（印度传说中的死亡之神）。

1996年这种蛋白酶被命名为caspase-3。

现在一般认为caspase—3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。

1.caspase-3的结构

pro-caspase-3含有277个氨基酸残基，分子量约32kD，与ICE有30%同源性，与CED-3有35%同源，是caspase家族中与CED—3同源性最高的，不论从结构同源性还是从底物特异性来看都与CED-3很相似，所以有人认为它是CED-3在哺乳动物中的同源蛋白。

caspase—3的原结构域明显短于ICE只有28个氨基酸残基，但蛋白酶活性中心和与结合底物有关的保守的氨基酸均与ICE一致。

pro—caspase—3在活化过程中从Asp28~Ser29和Asp175~Ser176两处被剪切，形成P17（29~175）和P10（182～277）两个片段，相当于ICE的P20和P10，两种亚基再组成活性形式的caspase-3。

pro—caspase-3本身并没有催化活性，在活化时首先由颗粒酶B（GrzB）或caspase-10在D175剪切下小片段后它才被部分活化，随后则可进行下一步的自我催化。

在剪切原结构域时可能还有其它caspase如ICE的参与。

2。

caspase-3的活化和参与细胞凋亡

caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用,caspase-3基因转染昆虫Sf9细胞后引起细胞凋亡,这个过程可以被BCL—2阻断；在发生凋亡的细胞提取液中去除caspase—3后，这些提取液就失去了诱导细胞凋亡的能力;再加入纯化的caspase-3它就又恢复了致凋亡的功能.

caspase—3可以被多种因素活化,在CTL细胞的杀伤作用中，它既可被Fas/FasL途径活化，也可以通过颗粒酶B途径活化。

颗粒酶B是CTL细胞颗粒中的一种丝氨酸酯酶，是哺乳动物中caspase蛋白酶外唯一的在Asp后剪切的蛋白酶,它可以特异性剪切ICE家族蛋白酶催化亚单位C端的IxxD序列，并活化caspase2、3、6、7、8、9、10。

ICE也可以被颗粒酶剪切，但剪切后并不被活化。

3。

caspase—3引起细胞凋亡的机制

caspase-3最主要的底物是多聚（ADP—核糖）聚合酶PARP（poly（ADP—ribose）polymerase）,该酶与DNA修复、基因完整性监护有关。

在细胞凋亡启动时，116kD的PARP在Asp216—Gly217之间被caspase-3剪切成31kD和85kD两个片段,使PARP中与DNA结合的两个锌指结构与羧基端的催化区域分离，不能发挥正常功能.结果使受PARP负调控影响的Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶的活性增高，裂解核小体间的DNA，引起细胞凋亡.这种裂解过程可被caspase—3的特异性抑制剂Ac—DEVD-CHO所抑制,但不能被CrmA抑制.caspase3还可以剪切U1-70K、DNA—PK、PKCδ和PKCθ.PKCδ和PKCθ都属于新型PKC（novelPKC，nPKC），当被caspase3剪切后，可以切除调节区域，而成为活性形式的PKC,另外实验还证明，过量表达PKCδ和PKCθ均可以引起细胞凋亡，说明它们都参与了细胞凋亡的诱导.

（三）caspase-8

在caspase-8发现之前,人们虽然知道多种细胞膜外的因素可以引起细胞凋亡,而且知道caspase家族蛋白是这种细胞凋亡过程中的效应物质，但对凋亡信号如何由细胞膜外转递到细胞浆,并如何引起caspase蛋白酶活化的过程却知之甚少.含有死亡结构域的胞浆信号蛋白的发现，证明死亡信号是通过这些蛋白质向胞浆内部传递，并最终引起caspase蛋白酶的活化的。

1995年Enari等证明CrmA可以阻断Fas与TNFRI引起的细胞凋亡，并且发现在Fas和TNFRI活化时有caspase-3和caspase—7的活化，而CrmA在阻断细胞凋亡的同时也抑制了caspase-3和caspase—7的活化，这说明caspase-3、caspase-7等ICE家族蛋白酶参与了Fas和TNFRI引起的细胞凋亡过程，并且提示CrmA可以通过抑制caspase-3、caspase—7的上游ICE样蛋白酶来阻断凋亡过程。

之后Kischkel等发现Fas活化时可以与至少4种蛋白相连，分别称为CAP1（cytotoxicity—dependentAPO-1—associatedproteins1）、CAP2、CAP3和CAP4,这4种蛋白与活化的Fas受体一起被称为死亡诱导信号复合物（death—inducingsignalingcomplex,DISC）。

随后的研究证实CAP1和CAP2是不同形式丝氨酸磷酸化的FADD蛋白,CAP3和CAP4则被证明是一种新蛋白的两种不同剪接形式，这个蛋白被命名为FLICE（FADD-likeICE）。

同年，另两组研究者分别用酵母双杂交系统和根据蛋白的同源性也发现了这个蛋白,分别将其命名为MACH（MORT1-associatedCED—3homolog）和Mch5（mammalianCedhomolog5）,这个蛋白质就是后来统一命名的caspase-8。

1。

caspase-8的结构和分布

Caspase—8前体共有479aa，分子量为55kD,其显著的特点是在N端有2个70aa左右的结构域，与FADD的N端的死亡效应结构域（deatheffectordomain,DED）同源，这种同源的结构域可以发生相互聚合,提供了caspase—8与FADD相互结合的一个部位.caspase-8的C端与ICE结构同源，它的活性中心与其它ICE家族蛋白酶活性中心有所不同，不是通常的QACRG，而是由QACQG五肽组成，但这样的结构不影响其蛋白酶活性的发挥。

caspase—8一级结构中其它与结合底物有关的氨基酸残基都很保守.caspase—8分布于胎儿和成人的各种组织中，但在胎脑中没有分布。

在外周血白细胞中水平较高，可能与白细胞的凋亡有关.

2。

caspase—8的活化和参与细胞凋亡

caspase-8可以自我活化，也可以在颗粒酶B的剪切下活化.caspase8特异性识别的序列是DEVD，活化的caspase-8不但可以剪切PARP，而且还参与其它ICE家族蛋白酶，如caspase-3和caspase—7的活化过程。

用caspase—8基因转染MCF-7乳腺癌细胞系，可以引起细胞凋亡，出现典型的形态变化。

caspase-8引起的细胞凋亡可以被广谱的ICE家族蛋白酶抑制z-VAD—fmk所阻断,也可以被CrmA阻断，提示它可能是CrmA的靶蛋白。

3。

caspase-8参与细胞凋亡的机制

由于caspase-8具有FADD样DED结构域，并且能够通过DED结构域与FADD结合，所以caspase—8可以在凋亡过程中间接与细胞膜受体发生联系，从而将细胞膜事件转化为细胞浆事件。

他们认为，在非活化情况下caspase-8的两个FADD样DED结构是互相结合在一起的。

当细胞膜表面的Fas与其配体FasL或相应的单抗结合后，受体发生多聚化，引起FADD与受体胞浆区死亡结构域互相结合。

这种结合使FADD的DED结构域发生变构，变构后的DED可以与胞浆中caspase—8的一个DED结构域结合，使caspase—8的两个DED结构域分开，同时使caspase-8的ICE同源区解放出来，恢复蛋白酶活性，通过自我催化生成活性形式的caspase—8蛋白酶，后者再作用于胞浆中其它ICE家族蛋白酶，使它们发生逐级活化。

（四）其它caspase蛋白酶

1。

caspase—2

Kumar等首先在小鼠胚脑中发现了一种称为Nedd-2（neuronally—expressed,developmentallydownregulated）的蛋白酶，这种蛋白酶随着动物的成熟其表达水平逐步下降，在成年鼠脑中找不到Nedd-2的表达。

Wang等利用鼠Nedd-2作为探针，筛选人胚脑cDNA文库,获得两条与鼠Nedd-2高度同源的cDNA序列，并命名为ICH-1（ICEandCED-3homolog1）。

由于不同剪接，ICH—1可以编码两个基因产物:

ICH—1L长435aa，其中原结构域长123aa，301～305有以半胱氨酸为中心的活性位点QACRG，含有与ICE和CED—2相似的序列，分别有28%和27％同源性,高表达可引起哺乳动物细胞凋亡；另一种基因产物ICH-1S长312aa，高表达则能抑制细胞凋亡。

ICH-1L促凋亡的作用可以被BCL—2所阻断，但不被CrmA所阻断。

NorthernBlot和反转录—PCR证实，caspase-2的表达与组织的发育阶段有关。

ICH—1L和ICH—1S均表达于心脏、肾和脑，但ICH—1S在胚脑中表达最高,而ICH—1H在成年胸腺中表达最高。

在细胞发生凋亡时，48kDa的caspase-2首先被一种caspase-3样蛋白酶在Asp316剪切成p33和p14，然后再缓慢地在Asp152和Asp330处剪切为p18和p12组成的活性蛋白酶,后一过程要在2~3h后才能完成。

caspase-2可能参与CTL细胞的杀伤作用，但它并不能被颗粒酶B直接活化,必须被一种caspase-3样蛋白酶活化。

2.caspase-4

caspase—4是1995年Kamens等在松驰杂交（lowstringencyhybridization）的条件下用人ICE基因探针筛选人胸腺细胞cDNA文库,找到的一个与ICE和CED-3同源的基因，当时将它命名为ICH-2（ICEandCED-3homolog2）。

同年另外两组科学家也分别独立地发现了这个基因，并分别命名为TX和ICErel-II。

caspase—4基因定位于人染色体11q22。

2-22。

3,所编码的蛋白包含377aa，分子量约43kD,一级结构与ICE有53％的同源性，在切除104aa的原结构域后同源性更高达60%,所有与酶活性中心（QACRG）和与结合底物有关的氨基酸残基都得到了保留。

caspase-4分布较广，除脑组织外在所有检测的组织中都有表达.

虽然caspase4与ICE高度同源,但它并不能催化pro-IL—1β为成熟分子,但可以活化ICE前体及其自身的前体.caspase4不能剪切DNA-PK，ICE敏感的抑制剂YVAD—CHO可以阻断caspase4的活性，但其敏感性仅为ICE的1/20。

caspase—4的活性形式也是由P20和P10两种亚基组成。

将caspase—4基因转染Sf9昆虫细胞系可以引起典型的凋亡变化，提示caspase-4在细胞凋亡中起一定的作用.

3。

caspase-5

caspase5是Munday等发现caspase4（ICErel—II）时同时发现的一种蛋白，当时命名为ICErel-III，另外一组研究者则命名为TY。

caspase—5包含418aa,分子量47。

7kD，与ICE有51%的同源性，并具有保守的活性中心QACRG.但caspase-5不能剪切pro—IL-1β，在过量表达时可以诱导凋亡的发生.

4.caspase-6

caspase6是通过搜索有保守的QACRG活性中心和GSWFI保守的抑制剂结合位点的方法用PCR的手段找到的，命名为Mch2，与caspase-3有38%同源性,可以在昆虫细胞中引起细胞凋亡。

随后的研究证明，caspase6可以剪切层蛋白B，而且其活性对Zn2+敏感，这是唯一一个可以剪切层蛋白的caspase。

caspase识别的序列也是VEID。

它不能剪切U1—70K和DNA-PK,但可以部分剪切PARP,并可活化caspase3。

5。

caspase—7

caspase7是通过PCR扩增caspase保守序列得到的,称为Mch3（mammalianCedhomolog3）,另外也被称为ICE—LAP3（ICElikeapoptoticprotease3）和CMH1（CPP32/Mch2homolog1）。

caspase—7