推荐下载关于超声联合酶法提取黄芪总多糖的影响因素分析.docx
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关于超声联合酶法提取黄芪总多糖的影响因素分析
【编者按】医药论文是科技论文的一种是用来进行医药科学研究和描述研究成果的
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关于超声联合酶法提取黄芪总多糖的影响因素分析
【摘要】目的采用超声联合酶法对黄芪总多糖进行有效提取。
方法通过单因素实
验考察超声提取时间、超声提取温度、固液比及酶用量对黄芪总多糖提取率的影响,
并运用正交试验优化其提取工艺。
结果影响黄芪总多糖提取率的因素按大小次序排列
为:
超声提取时间超声提取温度酶量固液比,优化工艺参数为:
超声提取时间30
min、超声提取温度40℃、固液比1∶20(g∶mL)、酶量10mg。
结论与黄芪多糖的
传统水提工艺相比,采用超声联合酶法进行提取,黄芪多糖的提取率明显提高,优选
得到的工艺稳定可行。
【关键词】超声酶法;黄芪;总多糖;正交试验
1
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Abstract:
ObjectiveTostudyonanovelextractionprocessofastragaluspolysaccharidesby
ultrasoundcombinedwithcelluloseenzyme.MethodsTheoptimumextractingconditions
weretestedwithorthogonalexperimentaldesign.ResultsThesignificanceofthesefactorsin
sequencewereenzymeamount,solid/liquidratio,ultrasoundtemperatureandultrasound
extractiontime.Theoptimalparameterswere:
ultrasoundtimeof30min,ultrasound
temperatureof40℃,solid?
liquidratio1∶20,theenzymeamountof10mg.ConclusionThe
optimalprocessofultrasoundcombinedwithcelluloseenzymeisavailableandworkablefor
highyieldoftotalAPScomparedwithtraditionalwaterextraction.
Keywords:
ultrasoundcombinedwithenzyme;Astragalusmongholicus;total
polysaccharides;orthogonalexperiment
黄芪为豆科植物黄芪Astragalusmembra?
naceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge)Hsiao
或荚膜黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge的干燥根。
具有补气固表、利尿脱毒、
排脓、敛疮生肌的功效,为历代常用之补益中药。
黄芪多糖(Astragalus
Polysaccharides,APS)是黄芪中重要的天然有效活性成分,具有促进免疫器官功能和抗体
生成,抗菌抗病毒及抗肿瘤,抗衰老,防辐射,双向调节血糖等作用[1,2]。
由于其多种生物
活性及良好的临床效果,多年来在国内外已成为中药提取及中草药现代化研究的焦点之
一[3]。
目前已有黄芪多糖冲剂、黄芪精口服液、黄芪注射液等药品应用于临床,其提取
工艺的选择直接影响到药品的质量。
2
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目前黄芪多糖的提取主要采用传统的水提工艺,多糖粗品的收率极低,而提取成本却很
高,使得黄芪多糖的开发利用受到限制。
酶技术是近年来用于植物有效成分提取的生物
工程技术,选用恰当的酶可以比较温和地将植物组织分解,加速有效成分的释放,从
而提高其提取率[4,5]。
超声提取法是基于超声波的空化作用来加速物质分子运动的频
率和速度、增加溶剂穿透能力,以提高药物溶出速度和溶出次数,从而有利于植物有效成
分溶出的一种提取方法,同时它还避免了高温加热对有效成分的破坏。
基于酶法与超声
提取法的优点,作者首次采用超声联合纤维素酶法提取黄芪中的总多糖,通过正交试
验确定最优提取工艺,旨在提高黄芪多糖的得率,最大限度地利用黄芪资源,为其工
业化生产提供参考依据。
1仪器与试剂
1.1仪器
HH?
6恒温水浴锅(江苏金坛市宏华仪器厂);RE?
52CS旋转蒸发器(巩义市英峪予华仪
器厂);循环水真空泵(河南省巩义市英峪予华仪器厂);UV1101紫外/可见分光光度仪(上
海天美科学仪器有限公司);AY120电子分析天平(日本岛津公司);KH?
400KDB型高功率
数控超声清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司,频率40kHz,功率400W);摇摆式高速
中药粉碎机(大德中药机械有限公司)。
3
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1.2试剂
葡萄糖对照品(分析纯,纯度99%,广州汕头市西陇化工厂);纤维素酶(活性单位15
Umg-1)由上海伯奥生物科技有限公司提供。
黄芪药材(购自广州致信中药饮片有限公
司,批号:
08207)。
实验用水为蒸馏水,其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1样品前处理
将黄芪药材经粉碎机粉碎后过40目筛,备用。
2.2葡萄糖对照品溶液的制备
精密称取葡萄糖对照品25.0mg,置50.0mL容量瓶中,加入蒸馏水溶解,并稀释至
刻度,摇匀,即得(每1mL中含葡萄糖0.500mg)。
2.3标准曲线的制备
4
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分别精密吸取上述葡萄糖对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL至7个25
mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀。
分别精密吸取1.0mL于试管中,于冰水
浴条件下缓慢加入5%苯酚溶液1.0mL,摇匀,迅速加入浓硫酸溶液5.0mL,振摇5
min,沸水浴10min,然后置冷水浴中冷却20min。
同时以苯酚-浓硫酸溶液作为空白
对照,在490nm处测量其吸光度值。
以葡萄糖的质量浓度()为横坐标,溶液的吸光度
(A)为纵坐标,绘制标准曲线。
经回归分析,得标准曲线方程:
A=13.154+0.0158,
r=0.9981。
葡萄糖的质量浓度在0.02~0.12mgmL-1范围内与吸光度线性关系良好。
2.4黄芪中黄芪多糖提取率的测定
tips:
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蒿甲虚热清颗粒解热作用及机制的研究
作者:
江涛,唐春萍,曾昭智1,张锦红,陈艳芬
【摘要】目的探讨蒿甲虚热清颗粒的解热作用及机制。
方法采用家兔阴虚热盛证
模型和酵母混悬液复制大鼠发热模型,观察蒿甲虚热清颗粒的解热作用,并采用放射
免疫法测定下丘脑中cAMP含量的变化。
结果蒿甲虚热清颗粒对家兔阴虚热盛证模型
和酵母混悬液复制大鼠发热模型的动物体温升高有明显的抑制作用,并能抑制下丘脑
中cAMP含量的增高。
结论蒿甲虚热清颗粒有明显的解热作用,其机制可能与其减少
下丘脑cAMP生成与释放有关。
【关键词】蒿甲虚热清;解热;cAMP
(1.LaboratoryAnimalCenter;2.SchoolofTraditionalChineseMedicine,Guangdong
PharmaceuticalCollege,Guangzhou,Guangdong510006,China)Abstract:
ObjectiveToexplore
theantipyreticeffectsofHaojiaXureqinggranulesandthemechanismoftheantipyretic
effects.MethodsRabbitmodelofextremeheatduetodeficiencyofyinandratfevermodel
inducedbysubcutaneousinjectionofbeeryeastsuspensionwereused,theantipyreticof
HaojiaXureqinggranuleswasobserved,andvariationsofcAMPlevelinhypothalamuswas
determinedwithradioimmunoassay.ResultsIntragastricadministrationwithHaojiaXureqing
granulesshowedobviousinhibitiveeffectsontemperatureelevationintherabbitmodelof
6
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extremeheatduetodeficiencyofyinandratfevermodelinducedbysubcutaneousinjection
ofbeeryeastsuspension,andinhibitedtheincreasingofcAMPlevelin
hypothalamus.ConclusionHaojiaXureqinggranuleshadsignificantantipyreticeffects,andthe
mechanismmightberelatedtothegenerationandreleaseofcAMPinhypothalamus.
Keywords:
HaojiaXureqinggranules;antipyreticeffects;cAMP
蒿甲虚热清颗粒是根据《温病条辨卷三下焦篇》中青蒿鳖甲汤的改良剂型。
该药由
青蒿、醋鳖甲、石斛、生地、知母、葛根、丹皮、甘草等8味药材组成,具有清热、
养阴、透邪等功效,主治瘟病后期,阴液损伤、阴虚邪伏之证,是治疗瘟病后期阴虚
发热的代表方剂[1]。
前期的研究表明,该药对阴虚小鼠模型有明显的影响(另文发
表),本文选用家兔阴虚热盛模型和啤酒酵母致热大鼠模型,研究蒿甲虚热清颗粒的解
热作用及机制,以期为临床应用蒿甲虚热清颗粒治疗阴虚热盛证发热提供依据。
1试验材料
1.1药物及试剂
蒿甲虚热清颗粒(4g/袋,每袋含丹皮酚6mg、葛根素12mg,批号:
20080401,由
广东药学院药物研究所提供);阳性对照药:
小柴胡颗粒(广州光华药业股份有限公司,
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批号:
K24802);速尿注射液(20mg/支,江苏武进制药厂生产);大肠杆菌内毒素工作标准
品(8EU/mL,批号:
20080518,湛江海洋生物制品厂生厂);啤酒酵母(500g/包,安琪酵
母股份公司生产,批号:
20080912);cAMP放免试剂盒(上海中医药大学同位素室)。
1.2动物
SPF级SD大鼠、普通级新西兰兔,由广东省医学实验动物中心提供,生产许可证
号:
SYXK(粤)2003?
0002,正常饲养3d后供试。
1.3仪器
TSN?
695B型放免测量仪(上海原子核所日环仪器厂)。
2方法
2.1对家兔阴虚热盛证模型的影响[2]
新西兰兔48只,体质量2.0~2.5kg,雌雄各半。
实验室温度23~25℃,实验前2
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d先测兔肛温,每隔15min测1次,连续3次,以每天体温波动不超过0.2℃、基础
体温均值为38.7~39.3℃的动物供试验用。
实验前18h开始禁食禁水,实验当日先测
动物体温2次(波动不超过0.2℃),作为基础体温,自家兔耳缘静脉注射速尿,剂量为
2.5mL/kg,1h后再注射等量的速尿,2h后耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素4Eu/kg(0.5
mL/kg)。
选取注射大肠杆菌内毒素0.5h后体温上升超过0.5℃家兔40只,随机分为
5组:
(A)大肠杆菌内毒素+生理盐水对照组;(B)大肠杆菌内毒素+柴胡冲剂组;(C)大肠杆
菌内毒素+蒿甲虚热清颗粒低、中、高剂量组,各组家兔灌胃给予相应药物,正常对照
组给予等容量生理盐水,给药后于0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0h各测定兔体温,以给
药前家兔体温平均值为基础体温,计算各测定时间点家兔体温的变化。
2.2对大鼠背部皮下注射啤酒酵母混悬液致热实验的影响[3]
取SD大鼠,雌雄各半,实验室温度23~24℃,实验前2d将温度计插入肛门内2
cm,每日测定体温1次,连续3d,使大鼠适应测体温操作。
选取体温36.6~38.3℃
之间,体温波动在0.2℃以内者,测定给药前体温,随后皮下注射10%()啤酒酵母混
悬液(用质量分数0.5%CMC?
Na配制),给药容积为10mL/kg,5h后测定体温1次,选
择体温升高1℃以上者作为实验对象,然后随机分成5组:
(A)啤酒酵母混悬液+生理
盐水对照组;(B)啤酒酵母混悬液+柴胡冲剂组;(C)啤酒酵母混悬液+蒿甲虚热清颗粒
低、中、高剂量组,立即灌胃给予相应的药物,给药容积为5mL/kg,生理盐水对照组
给予等量的生理盐水,测定给药后1.0、2.0、3.0、4.0、5.0h大鼠体温,以给药前大鼠
体温平均值为基础体温,计算各测定时间点大鼠体温的变化。
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2.3对酵母致发热大鼠下丘脑cAMP含量的影响[4]
取SD大鼠,雌雄各半,实验室温度、啤酒酵母混悬液的使用及体温测量方法同
2.2。
选择体温升高1℃以上大鼠40只,随机分成4组,即模型组、模型组+蒿甲虚
热清颗粒高、中、低剂量组,并另取体温正常大鼠10只作为正常对照组。
每组灌胃给
予相应的药物,给药容积为5mL/kg,正常对照组给予等量的生理盐水,给药2h后测
体温,记录并比较各组间体温变化值(T=药后2h体温-基础体温)。
然后快速断头取全
脑,在冰浴下于灰结节和视交叉之间的中心点取出下丘脑,按cAMP放免药盒说明书
操作步骤处理下丘脑组织并测定cAMP的含量。
2.4统计学处理
采用SPSS12.0软件,计量资料以(s)表示,采用单因素方差分析,相关分析用直线相
关分析法,以P0.05为差异有显著性。
3结果
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取黄芪中黄芪多糖提取液用紫外分光光度计于490nm下测出吸光度A,代入回归方
程及以下公式,即可计算出黄芪中黄芪多糖的提取率。
提取率(%)=CV10-3W100%
式中:
C为黄芪多糖提取液浓度(mgmL-1),V为定容体积(mL),W为黄芪药粉质量
(g)。
2.5酶解条件的确定
2.5.1考察酶解时间对提取率的影响称取黄芪粉1g,进行酶解试验。
酶解温度为50
℃,料液比为1∶20,酶量为8mg,根据文献[4]选择pH=4.5,考察不同酶解时间对提
取率的影响。
当酶解时间为30、60、90、120、150min时,提取率分别是19.05%、
21.75%、22.31%、22.13%、20.82%。
在考察范围内随着酶解时间的增加,黄芪多糖的
提取率呈先上升后下降的趋势。
为节省时间,选择酶解时间为60min。
2.5.2考察酶解温度对提取率的影响称取黄芪粉1g,进行酶解试验。
酶解时间60
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min,料液比为1∶20,酶量为8mg,pH=4.5。
当酶解温度分别为30、40、50、60、
70℃时,提取率分别是19.01%、22.01%、23.84%、22.39%、21.08%。
随着酶解温度
的增加,黄芪中多糖的提取率呈先上升后下降趋势,50℃时提取率最高。
因此本实验
选择酶解温度为50℃。
2.5.3考察酶用量对提取率的影响(见2.6)
2.6单因素实验
取黄芪约1g,精密称取,加入缓冲溶液和一定比例的酶,按2.5项下确定的酶解
条件(酶解时间60min,酶解温度50℃,pH=4.5),在不同条件下进行提取,滤过,按
2.3项下方法测定其吸光度,以考察超声提取时间、超声提取温度、固液比及酶用量对
黄芪总多糖提取率的影响,结果见图1。
2.7正交试验
根据单因素试验结果,设计了四因素三水平正交试验,结果见表1、表2、表3。
由表2可以看出,在影响超声酶法提取黄芪多糖的四个因素中,影响黄芪多糖提取
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率的大小次序先后为超声提取时间超声提取温度酶量固液比,超声提取时间影响最
大,固液比影响最小。
各因素的优化工艺参数为A2B2C2D3,即超声时间30min、超
声温度40℃、固液比1∶20、酶量10mg。
医药卫生栏目
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