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基因工程技术
第1章绪论
1基因工程：
在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA），转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。
2基因工程要素：
包括外源DNA；载体分子、工具酶和受体细胞等。
3基因工程的研究内容：
（1）目的基因的获取：
从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：
将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：
将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。
（4）重组体的培养:
对转入重组子的受体细胞进行培养,以扩增DNA重组子或使其整合到受体细胞的基因组中。
（5）克隆的鉴定：
挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）
（6）目的基因的表达：
使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章基因工程的酶学基础
第一节限制性核酸内切酶
一、限制性核酸内切酶：
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
来源：
主要来源于原核生物
性质：
内切酶，即在DNA分子内部制造切口的酶
功能：
自我保护
细菌的限制修饰系统：
限制，将侵入细菌的外援DNA进行分解形成小片段；修饰，细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。
2、限制性内切酶的类型
Ⅰ型限制性内切酶、Ⅱ型限制性内切酶、Ⅲ型限制性内切酶
1、Ⅱ类限制性内切酶的基本特性：
（1）识别位点序列：
未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是呈典型的旋转对称型的回文结构）。
与DNA的来源无关，即没有种的特异性。
（2）切割位点：
识别位点处，切开双链DNA，形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。
[1]粘性末端：
含有几个核苷酸单链的末端，分为5’端突出，和3’端突出
[2]粘性末端的意义：
①连接便利：
i）不同的DNA双链：
只要粘性末端碱基互补就可以连接
ii）同一个DNA分子内连接：
通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。
②末端标记：
A末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记
B末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性末端。
③补平成平齐末端：
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端
[3]平齐末端（bluntend）：
在识别序列的对称轴上同时切割
[4]平齐末端的特点：
连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接效率的1%，这种连接常出现多联体连接
粘性末端与平齐末端连接的处理方法：
ⅰ）添补法：
利用DNA聚合酶Ⅰ（klenowfragment）将碱基添补到目的基因的粘性末端上。
ⅱ）削除（平）法：
利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端
[5]同裂酶（Isoschizomer）：
不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。
①完全同裂酶：
识别位点和切点完全相同
②不完全同裂酶：
识别位点相同，但切点不同。
[6]同尾酶（Isocaudamers）：
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别
[7]限制酶的酶活性：
限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。
①星号（*）活性：
如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。
②诱发星号（*）活性的原因：
ⅰ）高甘油含量
ⅱ）内切酶用量过大
ⅲ）低离子强度
ⅳ）高pH
ⅴ）含有机溶剂，如乙醇
ⅵ）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二价阳离子的存在
[8]Ⅱs型限制性内切酶
移动切割（shiftedcleavage）:
在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。
（3）Ⅱ型限制性内切酶不具有甲基化功能：
Ⅱ型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。
它们识别相同的DNA序列，但功能不同。
（4）II型限制性内切酶对单链DNA的切割：
定义为切割双链DNA，但有一些还可以特异识别并切割单链DNA的相应位点，只是切割效率比较低
3.Ⅲ类限制性内切酶
在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）
4、限制性内切酶酶解反应条件
1.标准酶解体系的建立：
一个单位（U）的限制性内切酶定义：
在合适的温度和缓冲液中，在20μl的反应体系中，1h完全酶解1μgDNA所需要的酶量。
2酶解过程：
配酶解体系、混匀、反应终止、酶解结果鉴定
第2节DNA连接酶
一、定义：
一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶
二、特点：
1.两种共价连接DNA限制片段的DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶
：
只能连接粘性末端，背景低，准确性高
（2）T4噬菌体的连接酶，不但能连接粘性末端；还能连接齐平末端
2.连接条件
（1）必须是两条双链DNA
（2）DNA3’端有游离的-OH，
5’端有一个磷酸基团（P）
（3）需要能量动物或噬菌体中：
ATP大肠杆菌中：
NAD+
（4）DNA连接酶的反应条件：
1UDNA连接酶的酶活性：
在最佳反应条件下15℃反应1小时，完全连接1mgl-DNA（HindⅢ片段）所需的酶量。
第3章 基因工程载体
一、载体（vector）
1定义：
是由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一种遗传成分；
基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。
2载体的功能：
运送外源基因高效转入受体细胞
为外源基因提供复制能力或整合能力
为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
3载体的要求:
A、复制起点：
能在受体中复制；
B、筛选标记；
C、限制性内切酶切割位点；
D、载体的大小：
原则上要求载体越小越好；
E、适当的拷贝数；
F、载体的安全性：
质粒不能随便转移;
G、外源基因的表达：
启动子。
第1节表达载体
1常用的遗传标记基因
β-半乳糖苷酶基因（lacZα和lacZβ）
β-半乳糖苷酶基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。
该蛋
白质可分为两部分：
α链和β链。
前者负责四聚体装配，后者具β-半乳
糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为
α-互补作用。
这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。
为α链编
码的基因称之为lacZα（编码145AAs）。
这两个基因（LacZα和LacZβ）
均可作为标记基因。
β-半乳糖苷酶基因的优点:
a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观
b.lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性
c.lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
2常用质粒载体
（1）pBR322
复制起点ori：
pMB1系列（来源于ColE1）高拷贝型复制起点
Ampr基因：
pSP2124质粒的Ampr基因
Tetr基因：
pSC101的Tetr基因。
长 度：
4363bp
选择标记：
氨苄青霉素和四环素抗性。
克隆位点：
含有多个克隆位点。
Ampr基因内可被PstI，PvuI，SacI切开，而Tetr基因可被
BamHI，HindIII切开，通过插入失活筛选重组子。
pBR322重组克隆的筛选
重组克隆的“插入失活”筛选方法
pBR322—→插入在Tetr中，基因型为Tets、Ampr——→在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在含有四环素培养基上不生长；
pBR322—→插入在Ampr中，基因型为Tetr、Amps、——→在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素培养基可生长；
而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。
这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。
（2）pUC系列质粒载体
在pBR322的基础上改造而成。
属正选择载体，其组成如下：
含有pBR322完整的Ampr基因和复制起始点。
含有大肠杆菌-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码-肽链的DNA序列，即lacZ’基因。
在lacZ’基因中靠近5’端的一段有MCS区段，但并不破坏该基因的功能。
（3）穿梭质粒载体（shuttlevector）：
这种质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，因此能在两种不同种属的受体细胞中复制并检测，如大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒、大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒等。
第2节表达载体
克隆载体（cloningvector）：
主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可；
表达载体（expressionvector）：
能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。
这类载体既有复制子，更要有强启动子；
穿梭载体（shuttlevector）：
这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
表达载体构建的一般原则
1.阅读框架与外源基因高效表达
2.启动子与外源基因高效表达
3.转录的有效延伸和终止与外源基因高效表达
4.有效的翻译起始与外源基因高效表达
5.终止密码子选择与外源基因高效表达
6.外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达
真核基因在原核细胞中表达，载体必须具备的条件：
⑴载体能够独立复制，具有复制起点。
⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆
鉴定和筛选。
⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。
⑷应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。
⑸应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定。
⑹所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。
最佳启动子具备的条件：
第一必须是强启动子
第二启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平
第三启动子应是诱导型的（热或化学诱导）
第4章目的基因的制取
第1节目的基因
1.基因的组成
基因：
染色体上具有遗传功能的DNA片段，它包括结构基因和相关的调控序列。
1）原核生物的基因组成
操纵子（Operon）：
功能密切相关的基因聚集在一起，处于同一个转录启动区的调控
之下，并具有相同的转录终止区.
启动区：
RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。
SD序列：
核糖体识别和结合的序列，通常位于起译密码子上游4-9bp处。
序列特征为：
AGGAGG,它与核糖体核糖体16SrRNA的3‘序列3’UCCUCC5’互补配对，从而使核糖体与mRNA结合,启动翻译过程。
编码区：
翻译起始密码（ATG）：
位于SD序列后4-9bp；多肽链编码区：
翻译终止密码（TAG，TGA,TAA）：
某些基因后面只有一个终止密码，某些基因后面有两个终止密码.
转录终止区:
终止子：
原核生物基因在转录终止前的一段提供转录终止信号的DNA序列（Terminator）.
特点：
回文结构，转录后可形成发夹状的结构，从而使聚合酶减慢或停止前进.
a）不依赖于终止因子的终止子（简单终止子）
含有寡聚T序列和一段富含GC的序列
b）依赖于终止因子（ρ）的终止子.
不含寡聚T序列，回文结构不含富GC的序列
终止因子：
帮助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子（Terminationfactor）
2）真核生物基因组成
真核生物基因组的一般特点
a）基因位于染色体上，基因之间存在较长的非编码区
b）一个结构基因内有一个或多个非编码的间隔序列
转录启动区：
真核生物的三类RNA（rRNA,mRNA,tRNA）分别由RNA聚合酶I、II和III进行转录.它们启动子的结构也不相同.编码蛋白质的启动子由RNA聚合酶II识别.
基因区：
特点：
a）无类似于原核基因中的核糖体识别区
b）含有不编码的间隔序列
转录终止区：
含有高度保守序列AATAAA，该序列与mRNA转录后3’端加poly（dA）尾有关
2.基因的特殊排列
对于大多数基因来说，基因组中的基因一个接一个排列在DNA分子上，在基因之间存在长度不等的间隔区，但某些生物基因组中的基因存在重叠，重复，加倍和重排等现象
1）基因重叠：
一个基因内包含另一个基因的现象
a）部分重叠：
两个基因的序列部分重叠
b）完全重叠：
一个基因完全包含在另一个基因内
2）重复基因:
在某些生物基因组中，某些基因存在多个拷贝的现象
*真核生物基因组中组蛋白基因
3）加倍基因:
同一细胞中至少含有两套完全或基本相同的基因
4）基因重排:
在生物的发育过程中，同一基因簇中的基因在不同的细胞中的排列顺序发生改变的现象.它与细胞功能的分化及表达有关.
第2节目的基因的制备
（一）目的基因的分离方法
根据不同类型基因组的大小、基因组成和基因排列方式不同，采用以下的方法可以把目的基因从基因组中分离出来。
1.直接分离法
（1）限制性核酸内切酶酶切分离法
对已知序列的DNA分子；对已知定位的目的基因；其它DNA分子可与基因组文库相结合；
缺点：
该方法适于从基因组简单的生物体中分离目的基因，如病毒等
（2）物理化学法
根据基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如 浮力密度和解链温度等的差异，从生物基因组中分离目的基因。
密度梯度离心法、单链酶解法、分子杂交法
密度梯度离心法：
其原理是GC含量高DNA片段的浮力密度较高，而富含ATDNA片段的浮力密度低，利用密度梯度超速离心技术可以分离GC含量较高的目的基因片段。
单链酶解法：
GC比AT键稳定，加热后AT较多的先变成单链，用单链特异的S1核酸酶酶切，再经氯化铯超速离心，获得无单链缺口的DNA
分子杂交法（Molecularhybridization）:
ssDNA与其互补的核苷酸序列配对形成dsDNA，这就是分子杂交的原理。
2.化学合成法
化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：
基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。
3.基于PCR的分离法
PCR法定向扩增目的基因的基本原理
PCR（PolymeraseChainReaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序
使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：
已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。
（1）直接从基因组中扩增
提取基因组DNA作模板
根据目的基因序列设计引物
PCR扩增
（2）从mRNA中扩增:
RT-PCR
提取基因组totalRNA
反转录合成总cDNA作模板
根据目的基因序列设计引物
PCR扩增
（3）同源序列克隆法
依据：
自然界的长期进化中，一些蛋白质的基因编码序列保持着高度的保守性，在生物的种属之间，基因编码序列有着很高的同源性。
方法：
根据同源序列设计引物进行PCR扩增，利用PCR产物进行RACE扩增或结合DNA文库进行分离目的基因。
4.基于基因文库的分离法
（1）核酸杂交法
原理：
将基因文库的菌落或噬菌斑原位转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜之后，进行裂解，释放DNA并且固定在膜上，利用特异的核酸探针进行筛选，根据碱基配对原则筛选到目的基因。
（2）应用表达文库分离克隆的目的基因（免疫学分离法）
当没有可用的核苷酸序列供作筛选基因文库的探针时，将cDNA克隆在表达载体上，再导入大肠杆菌寄主细胞然后通过对蛋白质产物的鉴定，分离克隆的真核目的基因。
特点：
1）表达的蛋白质以融合蛋白质的形式存在，其中原核蛋白质的氨基酸序列是整合在真核蛋白质的一个末端，不易被原核细胞中的有关蛋白酶消化降解，因而显得比较稳定，可以得到较高的表达水平。
2）cDNA片断必须置于启动子序列下游，在其控制之下；按正确的取向和读码结构插入，确保产生正确的蛋白质。
筛选的方法：
1）利用抗体筛选表达文库；
2）测定蛋白质的功能；
3）用放射性同位素标记的、带有特定蛋白质结合位点的DNA片断作探针筛选表达文库。
二、目的基因的获得
（一）基因组文库的构建
基因文库（genelibrary）概念
又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。
按外源DNA片段的来源分基因文库分为：
基因组DNA文库：
从特定组织提取的染色体基因组DNA
cDNA文库：
mRNA反转录成的cDNA拷贝基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。
目的：
a）分离有用的目的基因b）保存某种生物的全部基因
1基因组DNA文库的类型
根据所选用的载体可以分为：
质粒文库、噬菌体文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库等）
2基因组DNA文库的质量标准
重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力。
载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆。
克隆片段易于从载体分子上完整卸下。
重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
3基因组DNA文库构建的程序
1）．载体DNA片段的制备
DNA分离纯化→限制酶切→脱磷酸化反应
2）．供体DNA片段的制备
总DNA分离纯化→物理切割法[超声波（300bp）或
机械搅拌（8kb）]或酶切法（内切酶Sau3A进行局部消化。
可得到10-30kb的随机片断。
）→分离特定大小DNA片段
3）.载体与基因组DNA大片段的连接
（1）粘性末端直接连接：
载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端
（2）人工接头法（adapter）
（3）同聚物加尾:
人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。
4）重组DNA转化受体细胞：
根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞
4基因组文库的大小（必须包括一定数量的重组子才可能克隆基因组中的任何碱基序列。
）
5DNA文库的保存
1）影印膜滤保存法
2）.液体培养基中扩增保存
方法：
从平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70oC储存（加终浓度为25%的甘油）。
缺点：
因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。
3）保存单个克隆子于含有甘油的培养基中
方法：
从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70oC或-25oC下保存。
缺点：
需保存的克隆子数过多，工作量大
6基因文库的筛选
表型筛选法：
表达性状易于鉴别，如互补筛选．
抗性筛选法：
如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生长．
分子杂交法：
利用分子探针对文库进行筛选．
免疫筛选法：
利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选．
PCR筛选法：
根据保守序列合成引物，扩增特异性片段．
（2）cDNA文库构建
以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。
利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。
cDNA文库的特点
（1）不含内含子序列。
（2）可以在细菌中直接表达（一般选用的载体都是表达型的）。
（3）包含了所有编码蛋白质的基因。
（4）比DNA文库小的多，容易构建。
1cDNA基因文库构建的步骤：
细胞总RNA的提取和mRNA的分离
第一条cDNA合成
第二条cDNA合成
双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖
1.）总RNA（totalRNA）提取和mRNA的分离纯化
提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。
mRNA的分离纯化
（1）原理：
利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。
mRNA只占总RNA的1%-2%。
（2）mRNA的分离纯化，Column（柱），分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。
2）cDNA第一链合成：
逆转录酶能以RNA为模板合成DNA
3）cDNA第二链合成（自身引导法和置换合成法）
剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。
用DNA聚合酶合成第二链DNA。
去掉发卡结构
用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！
）。
4）cDNA与载体连接与转化受体细胞
基因组DNA文库的优点
相对于cDNA文库，基因组文库的优点：
cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列；
cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：
高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难；
从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。
cDNA文库的优点
cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。
cDNA文库的筛选比较简单易行。
每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。
cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。
cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能
cDNA克隆的主要的缺点
cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。
cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。
在cDNA文库中，相应于高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。
第5章基因与载体连接
1、黏性末端与平末端的连接
一）黏性末端DNA分子间的连接:
DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。
1.两段DNA的连接,依靠粘性末端
2.DNA片断与载体的连接:
依靠粘性末端
3粘性末端的更换
二）平末端（bluntend）的连接
1.直接连接:
5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。
2.人工加尾形成“粘性末端”
（1）同聚物加尾法
（2）衔接物（linker）连接
（3）DNA接头（adapter）连接法
二、其他连接方式
一）PCR产物的连接
1.在引物的5’端设计酶切位点
（1）设计原则:
符合载体的多克隆位点（MCS）；避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。
（2）带酶切位点的引物结构:
3’端15~20b
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