探讨PD1抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中的应答差异.docx
《探讨PD1抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中的应答差异.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《探讨PD1抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中的应答差异.docx（21页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
探讨PD1抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中的应答差异
探讨PD-1抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中的应答差异
白杰[1,2];高志涛[1];石龙[2];底静[2];李嵩[2];李祥[1];聂晶[1];韩为东[1]
【摘要】目的探讨不同肿瘤小鼠荷瘤模型对PD-1（programmeddeath-1）抑制剂应答的差异。
方法构建免疫健全小鼠荷瘤模型（B16黑色素瘤、CT26结肠癌、MC38结肠癌荷瘤模型）,B16黑色素瘤与CT26结肠癌肿瘤模型设置以下两组:
PBS对照组,PD-1抑制剂治疗组;MC38结肠癌肿瘤模型设置以下四组:
PBS对照组,PD-1抑制剂治疗组,PD-1抑制剂治疗高剂量组以及PD-1抑制剂延迟治疗组;记录各组小鼠肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线与小鼠生存曲线。
采用小鼠CD8磁珠分选肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞分析其绝对数量差异,流式细胞术分析各组小鼠肿瘤T细胞亚群的比例差异,探究PD-1抑制剂抗瘤活性相关免疫细胞类型及其变化。
结果CT26结肠癌小鼠荷瘤模型对PD-1抑制剂相对抵抗;B16黑色素瘤小鼠荷瘤模型对PD-1抑制剂应答不敏感;MC38结肠癌小鼠荷瘤模型对PD-1抑制剂的应答相对敏感并存在个体差异性,且与PD-1抑制剂治疗时间与剂量相关;PD-1抑制剂治疗后肿瘤浸润CD8^+T淋巴细胞绝对数量增加（P均<0.05）,CD8^+Ki67^+、CD8^+IFN-γ^+、CD8^+Ki67^+IFN-γ^+T淋巴细胞比例均上升（P均<0.05）。
结论MC38结肠癌小鼠荷瘤模型为研究PD-1抑制剂抗瘤效应的适宜模型;PD-1抑制剂能够促进肿瘤浸润CD8^+T细胞的增殖与功能,增强抗肿瘤免疫反应。
【期刊名称】《《解放军医学院学报》》
【年（卷）,期】2019（040）004
【总页数】7页（PP.357-363）
【关键词】免疫治疗;PD-1抑制剂;小鼠肿瘤模型
【作者】白杰[1,2];高志涛[1];石龙[2];底静[2];李嵩[2];李祥[1];聂晶[1];韩为东[1]
【作者单位】[1]解放军总医院第一医学中心生物治疗病区/分子免疫室北京100853;[2]解放军联勤保障部队第980医院河北石家庄050051
【正文语种】中文
【中图分类】其他
解放军医学院学报AcadJChinPLAMedSchApr2019，40（4）357基础研究论著探讨PD-1抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中的应答差异白 杰1,2，高志涛1，石 龙2，底 静2，李 嵩2，李 祥1，聂 晶1，韩为东11解放军总医院第一医学中心生物治疗病区/分子免疫室，北京 100853；2解放军联勤保障部队第980医院，河北石家庄 050051摘要：
目的探讨不同肿瘤小鼠荷瘤模型对PD-1（programmeddeath-1）抑制剂应答的差异。
方法构建免疫健全小鼠荷瘤模型（B16黑色素瘤、CT26结肠癌、MC38结肠癌荷瘤模型），B16黑色素瘤与CT26结肠癌肿瘤模型设置以下两组：
PBS对照组，PD-1抑制剂治疗组；MC38结肠癌肿瘤模型设置以下四组：
PBS对照组，PD-1抑制剂治疗组，PD-1抑制剂治疗高剂量组以及PD-1抑制剂延迟治疗组；记录各组小鼠肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线与小鼠生存曲线。
采用小鼠CD8磁珠分选肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞分析其绝对数量差异，流式细胞术分析各组小鼠肿瘤T细胞亚群的比例差异，探究PD-1抑制剂抗瘤活性相关免疫细胞类型及其变化。
结果CT26结肠癌小鼠荷瘤模型对PD-1抑制剂相对抵抗；B16黑色素瘤小鼠荷瘤模型对PD-1抑制剂应答不敏感；MC38结肠癌小鼠荷瘤模型对PD-1抑制剂的应答相对敏感并存在个体差异性，且与PD-1抑制剂治疗时间与剂量相关；PD-1抑制剂治疗后肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞绝对数量增加（P均＜0.05），CD8+Ki67+、CD8+IFN-γ+、CD8+Ki67+IFN-γ+T淋巴细胞比例均上升（P均＜0.05）。
结论MC38结肠癌小鼠荷瘤模型为研究PD-1抑制剂抗瘤效应的适宜模型；PD-1抑制剂能够促进肿瘤浸润CD8+T细胞的增殖与功能，增强抗肿瘤免疫反应。
关键词：
免疫治疗；PD-1抑制剂；小鼠肿瘤模型中图分类号：
R730.51文献标志码：
A文章编号：
2095-5227（2019）04-0357-07DOI：
10.3969/j.issn.2095-5227.2019.04.013网络出版时间：
2019-05-1013:
59网络出版地址：
引用本文：
白杰，高志涛，石龙，等.探讨PD-1抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中的应答差异［J］.解放军医学院学报，2019，40（4）：
357-363.DifferentialPD-1inhibitorefficacyamongdifferentmousetumormodelsBAIJie1,2,GAOZhitao1,SHILong2,DIJing2,LISong2,LIXiang1,NIEJing1,HANWeidong11DepartmentofMolecularBiologyandBio-therapeutic,InstituteofBasicMedicine,theFirstMedicalCenter,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China;2ChinesePLAJointLogisticsSupportForceNo.980Hospital,Shijiazhuang050051,HebeiProvince,ChinaCorrespondingauthor:
HANWeidong.Email:
hanwdrsw@;NIEJing.Email:
nnjj2002@Abstract:
ObjectiveToexplorethedifferentresponsestoPD-1（programmeddeath-1）inhibitorindifferentmousetumormodels.MethodsMousetumormodels,includingB16melanoma,CT26coloncancer,MC38coloncancer,wereestablished.B16melanomaandCT26coloncancertumormodelsweredividedintocontrolgroupandPD-1inhibitortreatmentgroup,andMC38coloncancertumormodelwasdividedintofourgroups,controlgroup,PD-1inhibitortreatmentgroup,highdosePD-1inhibitortreatmentgroupanddelayedPD-1inhibitortreatmentgroup.Tumorsizedataineachgroupwasrecorded,tumorgrowthandsurvivalcurveweredrawn.ThetumorinfiltratingCD8+TlymphocytesweresortedbyCD8beadsandthequantitativedifferenceswereanalyzed.ThetumorinfiltratingTlymphocytesubsetsweremeasuredbyflowcytometrytoexplorethetypesofimmunecellsrelatedtotheanti-tumoractivityofPD-1inhibitor.ResultsPD-1inhibitorhadnoanti-tumorefficacyinCT26colontumormodel,andminoranti-tumorefficacyinB16melanomatumormodel;butsignificantanti-tumorefficacyinMC38colontumormodel.TheefficacyvariedbytreatmentdurationanddoseofPD-1inhibitorinMC38colontumormodel.AfterPD-1inhibitortreatment,theabsolutenumberoftumorinfiltratingCD8+Tlymphocytesincreased,andtheproportionofCD8+Ki67+,CD8+IFN-γ+,CD8+Ki67+IFN-γ+tumorinfiltratingTlymphocytesallincreased（P＜0.05,respectively）.ConclusionMC38colontumormodelisappropriatetostudytheanti-tumorefficacyofPD-1inhibitor;PD-1inhibitorcanpromotetheproliferationandfunctionoftumorinfiltratingCD8+Tcellsandenhancetheanti-tumorimmuneresponse.Keywords:
immunotherapy;PD-1inhibitor;mousetumormodelCitedas:
BaiJ,GaoZHT,ShiL,etal.DifferentialPD-1inhibitorefficacyamongdifferentmousetumormodels［J］.AcadJChinPLAMedSch,2019,40（4）:
357-363.肿瘤基因突变的累积促进肿瘤生长，同时也增加了被免疫细胞识别的风险，然而在肿瘤发生演变过程中，肿瘤细胞能够借助免疫抑制性细胞因子、趋化因子、调节性免疫细胞及免疫检查点收稿日期：
2018-11-30作者简介：
白杰，男，在读硕士。
研究方向：
肿瘤免疫治疗与表观遗传学调控机制及临床转化研究。
Email:
baijieplagh@通信作者：
韩为东，男，博士，主任医师，教授。
Email:
hanwdrsw@；聂晶，女，博士，副研究员。
Email:
nnjj2002@解放军医学院学报AcadJChinPLAMedSchApr2019，40（4）357探讨PD-1抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中的应答差异白 杰1,2，高志涛1，石 龙2，底 静2，李 嵩2，李 祥1，聂 晶1，韩为东11解放军总医院第一医学中心生物治疗病区/分子免疫室，北京 100853；2解放军联勤保障部队第980摘要：
目的探讨不同肿瘤小鼠荷瘤模型对PD-1（programmeddeath-1）抑制剂应答的差异。
方法构建免疫健全小鼠荷瘤模（B16黑色素瘤、CT26结肠癌、MC38结肠癌荷瘤模型），B16黑色素瘤与CT26结肠癌肿瘤模型设置以下两组：
PBS对照组，PD-1抑制剂治疗组；MC38结肠癌肿瘤模型设置以下四组：
PBS对照组，PD-1抑制剂治疗组，PD-1抑制剂治疗高剂量组以及PD-1抑制剂延迟治疗组；记录各组小鼠肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线与小鼠生存曲线。
采用小鼠CD8磁珠分选肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞分析其绝对数量差异，流式细胞术分析各组小鼠肿瘤T细胞亚群的比例差异，探究PD-1抑制剂抗瘤活性相关免疫细胞类型及其变化。
结果CT26结肠癌小鼠荷瘤模型对PD-1抑制剂相对抵抗；B16黑色素瘤小鼠荷瘤模型对PD-1抑制剂应答不敏感；MC38结肠癌小鼠荷瘤模型对PD-1抑制剂的应答相对敏感并存在个体差异性，且与PD-1抑制剂治疗时间与剂量相关；PD-1抑制剂治疗后肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞绝对数量增加（P均＜0.05），CD8+Ki67+、CD8+IFN-γ+、CD8+Ki67+IFN-γ+T淋巴细胞比例均上升（P均＜0.05）。
结论MC38结肠癌小鼠荷瘤模型为研究PD-1抑制剂抗瘤效应的适宜模型；PD-1抑制剂能够促进肿瘤浸润CD8+T细胞的增殖与功能，增强抗肿瘤免疫反应。
中图分类号：
R730.51文献标志码：
A文章编号：
2095-5227（2019）04-0357-07DOI：
10.3969/j.issn.2095-5227.2019.04.013网络出版时间：
2019-05-1013:
59网络出版地址：
：
白杰，高志涛，石龙，等.探讨PD-1抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中的应答差异［J］.解放军医学院学报，2019，40（4）：
357-363.DifferentialPD-1inhibitorefficacyamongdifferentmousetumormodelsBAIJie1,2,GAOZhitao1,SHILong2,DIJing2,LISong2,LIXiang1,NIEJing1,HANWeidong11DepartmentofMolecularBiologyandBio-therapeutic,InstituteofBasicMedicine,theFirstMedicalCenter,ChinesePLAGeneralAbstract:
ObjectiveToexplorethedifferentresponsestoPD-1（programmeddeath-1）inhibitorindifferentmousetumormodels.MethodsMousetumormodels,includingB16melanoma,CT26coloncancer,MC38coloncancer,wereestablished.B16melanomaandCT26coloncancertumormodelsweredividedintocontrolgroupandPD-1inhibitortreatmentgroup,andMC38coloncancertumormodelwasdividedintofourgroups,controlgroup,PD-1inhibitortreatmentgroup,highdosePD-1inhibitortreatmentgroupanddelayedPD-1inhibitortreatmentgroup.Tumorsizedataineachgroupwasrecorded,tumorgrowthandsurvivalcurveweredrawn.ThetumorinfiltratingCD8+TlymphocytesweresortedbyCD8beadsandthequantitativedifferenceswereanalyzed.ThetumorinfiltratingTlymphocytesubsetsweremeasuredbyflowcytometrytoexplorethetypesofimmunecellsrelatedtotheanti-tumoractivityofPD-1inhibitor.ResultsPD-1inhibitorhadnoanti-tumorefficacyinCT26colontumormodel,andminoranti-tumorefficacyinB16melanomatumormodel;butsignificantanti-tumorefficacyinMC38colontumormodel.TheefficacyvariedbytreatmentdurationanddoseofPD-1inhibitorinMC38colontumormodel.AfterPD-1inhibitortreatment,theabsolutenumberoftumorinfiltratingCD8+Tlymphocytesincreased,andtheproportionofCD8+Ki67+,CD8+IFN-γ+,CD8+Ki67+IFN-γ+tumorinfiltratingTlymphocytesallincreased（P＜0.05,respectively）.ConclusionMC38colontumormodelisappropriatetostudytheanti-tumorefficacyofPD-1inhibitor;PD-1inhibitorcanpromotetheproliferationandfunctionoftumorinfiltratingCD8+Tcellsandenhancetheanti-tumorimmuneresponse.肿瘤基因突变的累积促进肿瘤生长，同时也增加了被免疫细胞识别的风险，然而在肿瘤发生演变过程中，肿瘤细胞能够借助免疫抑制性细胞因子、趋化因子、调节性免疫细胞及免疫检查点作者简介：
白杰，男，在读硕士。
研究方向：
肿瘤免疫治疗与表观遗传学调控机制及临床转化研究。
Email:
baijieplagh@通信作者：
韩为东，男，博士，主任医师，教授。
Email:
hanwdrsw@；聂晶，女，博士，副研究员。
Email:
nnjj2002@358解放军医学院学报AcadJChinPLAMedSchApr2019，40（4）通路下调机体免疫功能等逃避免疫系统的监视，维持肿瘤的免疫耐受[1-2]。
随着肿瘤治疗研究的日益深入，抗肿瘤免疫调节及肿瘤免疫治疗受到广泛关注，已成为重要的肿瘤治疗手段。
肿瘤免疫抑制在有效的抗肿瘤免疫反应中具有显著的阻碍作用，PD-1/PD-L1抑制剂等免疫检验点抗体药物能够激活效应T淋巴细胞，阻断肿瘤免疫抑制机制，恢复肿瘤患者被抑制的免疫活性，从而识别并杀死肿瘤细胞，为肿瘤免疫治疗提供了新思路和新方法[3-4]。
截止2018年12月，PD-1抑制剂，包括Pembrolizumab（Keytruda）、Nivolumab（Opdivo）等已经批准用于10余种肿瘤的治疗，包括肺癌、恶性黑色素癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤、肝癌等，肿瘤客观缓解率及生存期均显著提升[5-6]。
然而，PD-1抑制剂也有其自身的局限性，其单药使用反应率一般在10%～40%之间，不是对所有肿瘤类型有效，且即使在敏感型肿瘤中也只有部分人群能够获益[7]；同时越来越多的临床研究发现PD-1抑制剂免疫治疗也存在继发耐药现象[8]。
如何提高PD-1抑制剂临床疗效，探索其作用机制与治疗抵抗机制从而精准预测临床反应性是亟待解决的重要科学问题与临床难题；解决这些问题离不开探究性与验证性的动物实验，本研究旨在对比几种常用小鼠肿瘤模型对PD-1抑制剂的反应性差异，并初步探究其肿瘤浸润T淋巴细胞的表型及活性，为PD-1抑制剂相关研究提供参考。
材料与方法1实验动物与细胞B16黑色素瘤、CT26结肠癌、MC38结肠癌细胞株均购于国家实验细胞资源共享平台（北京总部）并保存在本实验室；BALB/c小鼠（雌性、6周龄、体质量约20g）以及C57BL/6小鼠（雌性、6周龄、体质量约20g）均购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
2主要试剂与仪器PBS缓冲液，RMPI1640培养基，0.25%胰蛋白酶，胎牛血清（美国Gibco公司）；流式细胞术抗体anti-CD3-PerCP、anti-CD8α-APC、anti-IFN-γ-PE，anti-Ki67-FITC（美国BioLegend公司）；PD-1抑制剂anti-PD-1mAb（美国Bioxcell公司）；小鼠肿瘤组织解离试剂盒，小鼠CD8+T细胞分选磁珠（德国美天旎公司）；小鼠肿瘤组织淋巴细胞分离液（Solarbio公司）；BDFACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）。
3小鼠肿瘤模型体外培养B16、CT26、MC38细胞并传代至适宜状态后制备细胞悬液，于无菌条件下以PBS调整细胞浓度为2×106/ml，CT26肿瘤细胞悬液于BALB/c小鼠背部皮下无菌接种，接种量为100μl，肿瘤细胞接种量为2×105/只；MC38、B16肿瘤细胞悬液于C57BL/6小鼠背部皮下无菌接种，接种量为100μl，肿瘤细胞接种量为2×105/只。
每日观察荷瘤小鼠的生长情况。
荷瘤第6天起隔日测量瘤块体积，用游标卡尺测量瘤体的最长径和最短径。
肿瘤体积=瘤体长径×瘤体短径2/2；当肿瘤体积达到100mm3时，视为荷瘤成功，CT26荷瘤小鼠约10d可成瘤，MC38、B16荷瘤小鼠约15d可成瘤。
4实验动物分组及处理当肿瘤体积达到100mm3后，CT26及B16荷瘤小鼠随机分为2组，于当日开始腹腔注射给药。
PBS对照组：
给予PBS100μl/只，1次/2d，连续5次；PD-1抑制剂治疗组：
将PD-1抑制剂原液用PBS在无菌条件下调整浓度至2μg/μl，给予200μg（100μl）/只，1次/2d，连续5次。
每2d用游标卡尺测量瘤体的
升级会员 