探讨PD1抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中的应答差异.docx

1、探讨PD1抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中的应答差异探讨PD-1抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中的应答差异白杰1,2; 高志涛1; 石龙2; 底静2; 李嵩2; 李祥1; 聂晶1; 韩为东1【摘 要】目的探讨不同肿瘤小鼠荷瘤模型对PD-1(programmed death-1)抑制剂应答的差异。方法构建免疫健全小鼠荷瘤模型(B16黑色素瘤、CT26结肠癌、MC38结肠癌荷瘤模型),B16黑色素瘤与CT26结肠癌肿瘤模型设置以下两组:PBS对照组,PD-1抑制剂治疗组;MC38结肠癌肿瘤模型设置以下四组:PBS对照组,PD-1抑制剂治疗组,PD-1抑制剂治疗高剂量组以及PD-1抑制剂延迟治疗组;记录各组小鼠

2、肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线与小鼠生存曲线。采用小鼠CD8磁珠分选肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞分析其绝对数量差异,流式细胞术分析各组小鼠肿瘤T细胞亚群的比例差异,探究PD-1抑制剂抗瘤活性相关免疫细胞类型及其变化。结果CT26结肠癌小鼠荷瘤模型对PD-1抑制剂相对抵抗;B16黑色素瘤小鼠荷瘤模型对PD-1抑制剂应答不敏感;MC38结肠癌小鼠荷瘤模型对PD-1抑制剂的应答相对敏感并存在个体差异性,且与PD-1抑制剂治疗时间与剂量相关;PD-1抑制剂治疗后肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞绝对数量增加(P均0.05),CD8+Ki67+、CD8+IFN-+、CD8+Ki67+IFN-+T淋巴细胞比例均上升(P

3、均0.05)。结论MC38结肠癌小鼠荷瘤模型为研究PD-1抑制剂抗瘤效应的适宜模型;PD-1抑制剂能够促进肿瘤浸润CD8+T细胞的增殖与功能,增强抗肿瘤免疫反应。【期刊名称】解放军医学院学报【年(卷),期】2019(040)004【总页数】7页(PP.357-363)【关键词】免疫治疗; PD-1抑制剂; 小鼠肿瘤模型【作 者】白杰1,2; 高志涛1; 石龙2; 底静2; 李嵩2; 李祥1; 聂晶1; 韩为东1【作者单位】1解放军总医院第一医学中心生物治疗病区/分子免疫室 北京100853; 2解放军联勤保障部队第980医院 河北石家庄050051【正文语种】中 文【中图分类】其他解放军医学院

4、学报 Acad J Chin PLA Med Sch Apr2019，40（4） 357基础研究论著探讨 PD-1 抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中的应答差异 白杰 1,2，高志涛 1，石龙 2，底静 2，李嵩 2，李祥 1，聂晶 1，韩为东 1 1解放军总医院第一医学中心生物治疗病区 / 分子免疫室，北京100853 ； 2 解放军联勤保障部队第 980医院，河北石家庄050051摘要 ： 目的探讨不同肿瘤小鼠荷瘤模型对 PD-1(programmed death-1) 抑制剂应答的差异。方法构建免疫健全小鼠荷瘤模型(B16 黑色素瘤、 CT26 结肠癌、 MC38 结肠癌荷瘤模型 )， B16

5、黑色素瘤与 CT26 结肠癌肿瘤模型设置以下两组： PBS 对照组， PD-1 抑制剂治疗组 ； MC38 结肠癌肿瘤模型设置以下四组 ： PBS 对照组，PD-1 抑制剂治疗组，PD-1 抑制剂治疗高剂量组 以及 PD-1 抑制剂延迟治疗组 ； 记录各组小鼠肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线与小鼠生存曲线。采用小鼠 CD8 磁珠分选肿瘤 浸润 CD8+ T 淋巴细胞分析其绝对数量差异，流式细胞术分析各组小鼠肿瘤 T 细胞亚群的比例差异，探究 PD-1 抑制剂抗瘤 活性相关免疫细胞类型及其变化。结果CT26 结肠癌小鼠荷瘤模型对 PD-1 抑制剂相对抵抗 ； B16 黑色素瘤小鼠荷瘤模型 对PD-1

6、抑制剂应答不敏感 ； MC38 结肠癌小鼠荷瘤模型对 PD-1 抑制剂的应答相对敏感并存在个体差异性，且与 PD-1 抑 制剂治疗时间与剂量相关 ； PD-1 抑制剂治疗后肿瘤浸润 CD8+ T 淋巴细胞绝对数量增加 (P均 0.05)，CD8+ Ki67+、CD8+IFN-+、CD8+ Ki67+ IFN-+ T 淋巴细胞比例均上升 (P均 0.05)。结论MC38 结肠癌小鼠荷瘤模型为研究 PD-1 抑制剂抗 瘤效应的适宜模型 ； PD-1 抑制剂能够促进肿瘤浸润 CD8+ T 细胞的增殖与功能，增强抗肿瘤免疫反应。关键词 ： 免疫治疗 ； PD-1 抑制剂 ； 小鼠肿瘤模型中图分类号 ：

7、 R 730.51 文献标志码 ： A 文章编号 ： 2095-5227(2019)04-0357-07 DOI ： 10.3969/j.issn.2095-5227.2019.04.013 网络出版时间 ： 2019-05-10 13:59 网络出版地址 ： 引用本文 ： 白杰，高志涛，石龙，等.探讨 PD-1 抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中的应答差异J.解放军医学院学报， 2019，40（4） ： 357-363.Differential PD-1 inhibitor efcacy among different mouse tumor models BAI Jie1,2, GAO Zhita

8、o1, SHI Long2, DI Jing2, LI Song2, LI Xiang1, NIE Jing1, HAN Weidong1 1Department of Molecular Biology and Bio-therapeutic, Institute of Basic Medicine, the First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2Chinese PLA Joint Logistics Support Force No.980 Hospital, Shijiazh

9、uang 050051, Hebei Province, ChinaCorresponding author: HAN Weidong.Email: hanwdrsw; NIE Jing.Email: nnjj2002Abstract: ObjectiveTo explore the different responses to PD-1 (programmed death-1) inhibitor in different mouse tumor models.MethodsMouse tumor models, including B16 melanoma, CT26 colon canc

10、er, MC38 colon cancer, were established.B16 melanomaand CT26 colon cancer tumor models were divided into control group and PD-1 inhibitor treatment group, and MC38 colon cancertumor model was divided into four groups, control group, PD-1 inhibitor treatment group, high dose PD-1 inhibitor treatment

11、groupand delayed PD-1 inhibitor treatment group.Tumor size data in each group was recorded, tumor growth and survival curve weredrawn.The tumor inltrating CD8+ T lymphocytes were sorted by CD8 beads and the quantitative differences were analyzed.Thetumor inltrating T lymphocyte subsets were measured

12、 by ow cytometry to explore the types of immune cells related to the anti- tumor activity of PD-1 inhibitor.ResultsPD-1 inhibitor had no anti-tumor efcacy in CT26 colon tumor model, and minor anti- tumor efcacy in B16 melanoma tumor model; but signicant anti-tumor efcacy in MC38 colon tumor model.Th

13、e efcacy variedby treatment duration and dose of PD-1 inhibitor in MC38 colon tumor model.After PD-1 inhibitor treatment, the absolute numberof tumor inltrating CD8+ T lymphocytes increased, and the proportion of CD8+ Ki67+, CD8+ IFN-+, CD8+ Ki67+ IFN-+ tumorinltrating T lymphocytes all increased (P

14、 0.05, respectively).ConclusionMC38 colon tumor model is appropriate to study theanti-tumor efcacy of PD-1 inhibitor; PD-1 inhibitor can promote the proliferation and function of tumor inltrating CD8+ T cellsand enhance the anti-tumor immune response.Keywords: immunotherapy; PD-1 inhibitor; mouse tu

15、mor modelCited as: Bai J, Gao ZHT, Shi L, et al.Differential PD-1 inhibitor efcacy among different mouse tumor modelsJ.Acad J Chin PLA Med Sch, 2019, 40（4）: 357-363.肿瘤基因突变的累积促进肿瘤生长，同时也 增加了被免疫细胞识别的风险，然而在肿瘤发生 演变过程中，肿瘤细胞能够借助免疫抑制性细胞 因子、趋化因子、调节性免疫细胞及免疫检查点收稿日期 ： 2018-11-30作者简介 ： 白杰，男，在读硕士。研究方向 ： 肿瘤免疫治疗与表观

16、 遗传学调控机制及临床转化研究。Email: baijieplagh 通信作者 ： 韩为东，男，博士，主任医师，教授。Email: hanwdrsw ； 聂晶，女，博士，副研究员。Email: nnjj2002解放军医学院学报 Acad J Chin PLA Med Sch Apr2019，40（4） 357探讨 PD-1 抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中的应答差异白杰 1,2，高志涛 1，石龙 2，底静 2，李嵩 2，李祥 1，聂晶 1，韩为东 11解放军总医院第一医学中心生物治疗病区 / 分子免疫室，北京100853 ； 2 解放军联勤保障部队第 980摘要 ： 目的探讨不同肿瘤小鼠荷瘤模型对

17、PD-1(programmed death-1) 抑制剂应答的差异。方法构建免疫健全小鼠荷瘤模(B16 黑色素瘤、 CT26 结肠癌、 MC38 结肠癌荷瘤模型 )， B16 黑色素瘤与 CT26 结肠癌肿瘤模型设置以下两组： PBS 对照组，PD-1 抑制剂治疗组 ； MC38 结肠癌肿瘤模型设置以下四组 ： PBS 对照组，PD-1 抑制剂治疗组，PD-1 抑制剂治疗高剂量组以及 PD-1 抑制剂延迟治疗组 ； 记录各组小鼠肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线与小鼠生存曲线。采用小鼠 CD8 磁珠分选肿瘤浸润 CD8+ T 淋巴细胞分析其绝对数量差异，流式细胞术分析各组小鼠肿瘤 T 细胞亚群的比例差

18、异，探究 PD-1 抑制剂抗瘤活性相关免疫细胞类型及其变化。结果CT26 结肠癌小鼠荷瘤模型对 PD-1 抑制剂相对抵抗 ； B16 黑色素瘤小鼠荷瘤模型对PD-1 抑制剂应答不敏感 ； MC38 结肠癌小鼠荷瘤模型对 PD-1 抑制剂的应答相对敏感并存在个体差异性，且与 PD-1 抑制剂治疗时间与剂量相关 ； PD-1 抑制剂治疗后肿瘤浸润 CD8+ T 淋巴细胞绝对数量增加 (P均 0.05)，CD8+ Ki67+、CD8+ IFN-+、CD8+ Ki67+ IFN-+ T 淋巴细胞比例均上升 (P均 0.05)。结论MC38 结肠癌小鼠荷瘤模型为研究 PD-1 抑制剂抗瘤效应的适宜模型

19、； PD-1 抑制剂能够促进肿瘤浸润 CD8+ T 细胞的增殖与功能，增强抗肿瘤免疫反应。中图分类号 ： R 730.51 文献标志码 ： A 文章编号 ： 2095-5227(2019)04-0357-07 DOI ： 10.3969/j.issn.2095-5227.2019.04.013网络出版时间 ： 2019-05-10 13:59 网络出版地址 ： ： 白杰，高志涛，石龙，等.探讨 PD-1 抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中的应答差异J.解放军医学院学报，2019，40（4） ： 357-363.Differential PD-1 inhibitor efcacy among diffe

20、rent mouse tumor modelsBAI Jie1,2, GAO Zhitao1, SHI Long2, DI Jing2, LI Song2, LI Xiang1, NIE Jing1, HAN Weidong11Department of Molecular Biology and Bio-therapeutic, Institute of Basic Medicine, the First Medical Center, Chinese PLA General Abstract: ObjectiveTo explore the different responses to P

21、D-1 (programmed death-1) inhibitor in different mouse tumor models.MethodsMouse tumor models, including B16 melanoma, CT26 colon cancer, MC38 colon cancer, were established.B16 melanoma and CT26 colon cancer tumor models were divided into control group and PD-1 inhibitor treatment group, and MC38 co

22、lon cancer tumor model was divided into four groups, control group, PD-1 inhibitor treatment group, high dose PD-1 inhibitor treatment group and delayed PD-1 inhibitor treatment group.Tumor size data in each group was recorded, tumor growth and survival curve were drawn.The tumor inltrating CD8+ T l

23、ymphocytes were sorted by CD8 beads and the quantitative differences were analyzed.The tumor inltrating T lymphocyte subsets were measured by ow cytometry to explore the types of immune cells related to the anti-tumor activity of PD-1 inhibitor.ResultsPD-1 inhibitor had no anti-tumor efcacy in CT26

24、colon tumor model, and minor anti-tumor efcacy in B16 melanoma tumor model; but signicant anti-tumor efcacy in MC38 colon tumor model.The efcacy varied by treatment duration and dose of PD-1 inhibitor in MC38 colon tumor model.After PD-1 inhibitor treatment, the absolute number of tumor inltrating C

25、D8+ T lymphocytes increased, and the proportion of CD8+ Ki67+, CD8+ IFN-+, CD8+ Ki67+ IFN-+ tumor inltrating T lymphocytes all increased (P 0.05, respectively).ConclusionMC38 colon tumor model is appropriate to study the anti-tumor efcacy of PD-1 inhibitor; PD-1 inhibitor can promote the proliferati

26、on and function of tumor inltrating CD8+ T cells and enhance the anti-tumor immune response.肿瘤基因突变的累积促进肿瘤生长，同时也增加了被免疫细胞识别的风险，然而在肿瘤发生演变过程中，肿瘤细胞能够借助免疫抑制性细胞因子、趋化因子、调节性免疫细胞及免疫检查点作者简介 ： 白杰，男，在读硕士。研究方向 ： 肿瘤免疫治疗与表观遗传学调控机制及临床转化研究。Email: baijieplagh通信作者 ： 韩为东，男，博士，主任医师，教授。Email: hanwdrsw ； 聂晶，女，博士，副研究员。Email

27、: nnjj2002358解放军医学院学报 Acad J Chin PLA Med Sch Apr2019，40（4） 通路下调机体免疫功能等逃避免疫系统的监视， 维持肿瘤的免疫耐受 1-2。随着肿瘤治疗研究的日 益深入，抗肿瘤免疫调节及肿瘤免疫治疗受到广 泛关注，已成为重要的肿瘤治疗手段。肿瘤免疫 抑制在有效的抗肿瘤免疫反应中具有显著的阻碍 作用，PD-1/PD-L1 抑制剂等免疫检验点抗体药物 能够激活效应 T 淋巴细胞，阻断肿瘤免疫抑制机 制，恢复肿瘤患者被抑制的免疫活性，从而识别 并杀死肿瘤细胞，为肿瘤免疫治疗提供了新思路 和新方法 3-4。截止 2018 年 12 月，PD-1 抑制

28、剂， 包括 Pembrolizumab (Keytruda)、Nivolumab (Opdivo) 等已经批准用于 10 余种肿瘤的治疗，包括肺癌、 恶性黑色素癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤、肝癌等， 肿瘤客观缓解率及生存期均显著提升 5-6。然而， PD-1 抑制剂也有其自身的局限性，其单药使用反 应率一般在 10% 40% 之间，不是对所有肿瘤类 型有效，且即使在敏感型肿瘤中也只有部分人群 能够获益 7 ； 同时越来越多的临床研究发现 PD-1 抑制剂免疫治疗也存在继发耐药现象 8。如何提高 PD-1 抑制剂临床疗效，探索其作用机制与治疗抵 抗机制从而精准预测临床反应性是亟待解决的重 要科学问题与

29、临床难题 ； 解决这些问题离不开探 究性与验证性的动物实验，本研究旨在对比几种 常用小鼠肿瘤模型对 PD-1 抑制剂的反应性差异， 并初步探究其肿瘤浸润 T 淋巴细胞的表型及活性， 为PD-1 抑制剂相关研究提供参考。材料与方法1 实验动物与细胞 B16 黑色素瘤、 CT26 结肠癌、 MC38 结肠癌细胞株均购于国家实验细胞资源共享 平台 ( 北京总部 ) 并保存在本实验室 ； BALB/c 小鼠 (雌性、6 周龄、体质量约 20 g) 以及 C57BL/6 小鼠(雌性、6 周龄、体质量约 20 g) 均购于北京维通利华实验动物技术有限公司。2 主要试剂与仪器 PBS 缓冲液，RMPI164

30、0 培养基，0.25% 胰蛋白酶， 胎牛血清 ( 美国 Gibco 公司 ) ；流 式 细 胞 术 抗 体 anti-CD3-PerCP、anti-CD8-APC、anti-IFN-PE，anti-Ki67-FITC( 美 国 BioLegend 公司 ) ； PD-1 抑制剂 anti-PD-1 mAb( 美 国Bioxcell 公司 ) ； 小鼠肿瘤组织解离试剂盒，小鼠CD8+ T 细胞分选磁珠 ( 德国美天旎公司 ) ； 小 鼠肿瘤组织淋巴细胞分离液 (Solarbio 公司 ) ； BDFACS Calibur 流式细胞仪 ( 美国 BD 公司 )。 3 小 鼠 肿 瘤 模 型体 外

31、培 养 B16、CT26、MC38 细胞并传代至适宜状态后制备细胞悬液，于无菌条件下以 PBS 调整细胞浓度为 2106/ml，CT26 肿 瘤细胞悬液于 BALB/c 小鼠背部皮下无菌接种，接 种量为 100l，肿瘤细胞接种量为 2105/ 只； MC38、B16 肿瘤细胞悬液于 C57BL/6 小鼠背部皮 下无菌接种，接种量为 100l，肿瘤细胞接种量 为2105/ 只。每日观察荷瘤小鼠的生长情况。荷 瘤第 6 天起隔日测量瘤块体积，用游标卡尺测量 瘤体的最长径和最短径。肿瘤体积 = 瘤体长径 瘤体短径 2/2 ； 当肿瘤体积达到 100 mm3 时，视为 荷瘤成功，CT26 荷瘤小鼠约 10 d 可成瘤，MC38、 B16 荷瘤小鼠约 15 d 可成瘤。4 实验动物分组及处理 当肿瘤体积达到 100 mm3 后，CT26 及 B16 荷瘤小鼠随机分为 2 组，于当日 开始腹腔注射给药。PBS 对照组 ： 给予 PBS 100l/ 只，1 次 /2 d，连续 5 次 ； PD-1 抑制剂治疗组 ： 将PD-1 抑制剂原液用 PBS 在无菌条件下调整浓 度至 2g/l，给予 200g(100l)/ 只，1 次 /2 d， 连续 5 次。每 2 d 用游标卡尺测量瘤体的