分子生物学复习资料.docx

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分子生物学复习资料

1.分子生物学的主要研究内容

核酸的分子生物学；蛋白质的分子生物学；分子生物学技术

2.理论上的三大发现

40年代，Avery发现了生物遗传物质的化学本质是DNA;

50年代，Walson-crick提出了DNA结构的双螺旋模型，搞清楚了生物遗传的分子机制;

60年代，确定了遗传信息的传递方式：

DNA→RNA→protein.

3.技术上的3大发明

“基因剪刀”—限制性核酸内切酶发明;

载体（“车子”）－基因工程（技术）诞生的第2个技术准备;

1970年，Baltimore和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学的中心法则，使真核基因的制备成为可能。

4.证明遗传物质是核酸的试验：

肺炎球菌转化试验；噬菌体转染试验

5.B-DNA双螺旋结构

1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型。

DNA是由两条反向平行的多核苷酸链组成的，分子的主链（磷酸核糖骨架）位于螺旋的外侧，碱基则堆积于螺旋的内部，两条多核苷酸链通过碱基间的氢键相结合。

6.双螺旋模型参数

直径20Å；螺距为34Å（任一条链绕轴一周所升降的距离）；每圈有10个核苷酸（碱基）；两个碱基之间的垂直距离是3.4Å。

螺旋转角是36度；有大沟和小沟配对碱基并不充满双螺旋空间，且碱基对占据的空间不对称。

7.大沟中碱基差异容易识别，往往是蛋白质因子结合特异DAN序列的位点。

8.DNA的双螺旋结构稳定因素

氢键；碱基堆积力，碱基处于疏水环境中；磷酸基上负电荷被胞内组蛋白或正离子中和，离子键；范德华力

9.B-DNA来自相对湿度为92％所得到的DNA钠盐纤维；还发现了A、C、D、E等右手双螺旋和左手双螺旋,Z构象等形式。

在溶液中，DNA一般为B型。

但在水的活度降低时，就转变为A型。

自然状态下，A-DNA可能存在于DNA-RNA的杂交分子，和双链RNA分子中。

与B-DNA相比，Z-DNA更为细长。

有证据表明，Z-DNA存在于天然DNA中，但量极微小，有些证据表明，Z-DNA的存在与基因表达的调控有关。

三种DNA双螺旋构象比较

ABZ

外型粗短适中细长

螺旋方向右手右手左手

螺旋直径2.55nm2.37nm1.84nm

碱基直径0.23nm0.34nm0.38nm

每圈碱基数1110.412

碱基倾角（度）1919

大沟很窄很深很宽较深平坦

小沟很宽、浅窄、深较窄很深

10.DNA和RNA的碱基有共轭双键，而使核酸在240~290nm有光吸收，最大吸收在260nm附近。

11.影响Tm值的因素

GC含量，高则高；盐浓度，高泽高，但有一定范围；有变性剂存在，如尿素，降低；极端pH条件的影响

12.DNA复性条件

有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力，常用的盐浓度为0.15至0.50mo1/L的NaCI；有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键，但又不能太高．否则配对碱基之间的氢键又难以形成的。

一般使用比Tm低20℃-25℃的温度。

13.影响DNA复性过程的因素

阳离子浓度；复性反应的温度；低于Tm值25℃左右（60-65℃）；S.S,DNA的初始浓度C0

S.S.DNA分子的长度（片段的大小）；DNA分子中,dNt的排列状况（随机排列,重复排列）。

14.DNA的变化情况：

DNA在水溶液中,构型偏B型状态;DNA以10.5bp/helix为最稳定构型;小于10.5bp/helix向正超螺旋发展（紧缩态）;大于10.5bp/helix向负超螺旋发展（松弛态）;天然的DNA都是负超螺旋;但一些生命活动过程中存在正超螺旋.

15.DNA超螺旋结构形成的意义:

使DNA形成高度致密状态从而得以装入核中；推动DNA结构的转化以满足功能上的需要,如负超螺旋分子所受张力会引起互补链分开导致局部变性，利于复制和转录。

16.拓朴异构酶可分I型和II型两类

拓扑异构酶I通过使DNA的一条链发生断裂和再连接，能使超螺旋DNA转变成松弛型环状DNA，每催化一次可消除一个负超螺旋，即使L增加１，反应无需供给能量；

拓扑异构酶II则刚好相反，可使松弛型环状DNA转变成负超螺旋DNA，每催化一次，L减少２，可引入负超螺旋。

拓扑异构酶II亦称促旋酶，它可以使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要ATP提供能量。

17.DNA的序列分析

化学法（Maxam-Gilbert）测序原理：

化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列n=1），经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。

用放射性核素标记待测DNA一侧末端；将标记DNA分为G、A+G、C+T、C4个反应体系；用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物；电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列。

18.病毒的核酸类型

单股正链RNA病毒，SARS冠状病毒；单股负链RNA病毒，禽流感病毒（H5N1）；双链RNA病毒，呼肠孤病毒；逆转录病毒，人类免疫缺陷病毒（HIV）；线性双链DNA病毒，腺病毒；双链环状DNA病毒，乳头瘤病毒；单链环状DNA病毒，噬菌体phiX174；开环部分双链DNA病毒，乙型肝炎病毒（HBV）；开环部分双链DNA病毒，乙型肝炎病毒（HBV）；

19.质粒的特点：

自主复制性；可扩增性；可转移性；不相容性。

质粒在分子生物学研究中因其以下几个方面的特点而常常作为载体：

体积小，便于DNA的分离与操作；呈环状，使其在化学离过程中能保持性能稳定；有不受核基因组控制的独立复制起始点；拷贝数多，使外源DNA可很快扩增；存在抗药性基因等选择性标记。

20.真核生物基因和基因组的特点：

真核基因组比原核基因组大得多；真核生物的主要的遗传物质DNA与组蛋白等构成染色体，被包裹在核膜内，核外还有与核基因组发生互作的线粒体基因组、叶绿体基因组等；真核基因组主要是二倍体，真核生物一个结构基因转录成一条mRNA，即mRNA是单顺反子，基本上没有操纵子的结构。

4）真核细胞中许多来源相同、结构相似、功能相关的基因往往成套组合成一个基因家族（genefamily）；非编码序列多于编码序列；原核生物编码蛋白质的基因序列绝大多数是连续的，而真核生物编码蛋白质的基因绝大多数是不连续的，是被一些称作内含子（intron）的序列隔开，为间隔基因；原核基因组中除了rDNA、tDNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。

高等动植物基因组中存在大量的重复序列；原核生物基因组一般是一个复制子，而真核生物基因组的复制起始点很多，有多个复制子。

21.间隔基因共同的性质：

内含子DNA序列结构有一定的特征，内含子的5，末端（即供体位点）核苷酸全部为GT（G90T90）；内含子的3‘末端核苷酸中有85个AG（A85G85），提出了“GT-AG规律”；间隔基因的外显子在基因中的排列顺序和它在成熟mRNA产物中的排列顺序是相同的；某种间隔基因在所有组织中都具有相同的内含子成分；核基因的内含子通常在所有的可读框中都含有无义密码子（nonsensecodon），因此一般没有编码功能；大多数内含子上发生的突变不影响蛋白质的结构。

但也有例外，例如一些发生在内含子上的突变可通过抑制外显子的相互剪接阻止信使RNA的产生。

间隔基因的存在对生物的意义：

有利于储存较多的信息，增加信息量。

一些断裂基因以不同的剪接方式可以产生两种以至多种mRNA，于是编码不同功能的多肽；有利于变异和进化；增加重组机率；可能是基因调控装置。

22.真核生物重复序列的类型

单拷贝序列uniquesequence重复数为一个到几个；大多数结构基因即编码各种蛋白质的基因存在于单一序列中．单拷贝基因的表达能力很高。

中度重复序列moderatelyrepetitivesequence中度重复（１００－１００００）；多为串联重复拷贝；这些基因的产物往往机体需求量很大．如ｒＲＮＡ基因,组蛋白基因。

高度重复序列（highlyrepetitivesequence）重复频率（１０５－１０７）；通常序列较短；通常集中在染色体的中心粒和端粒处；在密度梯度离心时，在主带旁形成伴随带，因此这些重复序列也称卫星ＤＮＡsatelliteDNA；功能不详，可能与染色体稳定有关，也有种属的特异性．卫星DNA依照其重复单位的的大小分为卫星序列、小卫星序列（minisatellitesequence）、微卫星序列（microsatellitesequenc）。

23.DNA的复制酶和相关蛋白

聚合酶：

催化DNA的合成。

引物酶：

启动RNA引物链的合成。

引发酶：

引物与典型的RNA（如mRNA）不同,它们在合成以后并不与模板分离,而是以氢键与模板结合。

可见这种引物可能是由一种性质独特的RNA聚合酶所合成。

这种合成DNA引物的酶就称为引发酶。

引发体：

引发酶是一条单肽链,分子量为60KDa,每个细胞中有50~100个分子,它是由dnaG基因所编码的。

该酶单独存在时是相当不活泼的，只有在与有关蛋白质相互结合成为一个复合体时才有活性。

这种复合体就称.

解螺旋酶，旋转酶：

把双链变成单链的酶。

连接酶：

是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。

24.复制的忠实性

DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为710-6）；DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3’-5’外切酶切除）；起始时以RNA作为引物。

25.双脱氧核苷酸链终止法（dideoxy-terminationsequencing）：

原理：

双脱氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3’端不具OH基，DNA链合成至此中断。

由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。

.在测序用的缓冲液中含有四种dNTP及聚合酶.测序时分成四个反应,每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A,C,G,T核苷三磷酸（称为ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP）,然后进行聚合反应.在第一个反应物中,ddATP会随机地代替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA链,由于其3位的羟基变成了氢,所以不能继续延伸.所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了;同理第二个反应产生的都是以C结尾的;第三个反应的都以G结尾,第四个反应的都以T结尾,电泳后就可以读出序列了.

26.真核生物的DNA聚合酶

α、β、δ、ε、γ五种

αβδεγ

位置核内核内核内核内线粒体

合成与引发修复合成合成,修复复制

功能酶结合前导链后随链

3’－5’校NONOYesYesYes

正活性

27.DNA损伤的来源：

碱基的脱落；碱基（核苷）的改变（碱基类似物；碱基的自身改变）；DNA复制中的错误；插入（insertion）和缺失（deletion）；嘧啶碱基的二聚体化；链的断裂；DNA链的交联。

28.DNA突变类型：

点突变，指DNA上单一碱基的变异。

缺失（deletion）插入（insertion），

倒位或转位（transposition），指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。

双链断裂，对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。

29.DNArepairing----DNA修复

是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这种DNA的损伤而能继续生存。

1）直接修复

光修复　这是最早发现的DNA修复方式。

修复是由细菌中的DNA光解酶（photolyase）完成，此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合，这步反应不需要光；结合后如受300－600nm波长的光照射，则此酶就被激活，将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体，然后酶从DNA链上释放，DNA恢复正常结构。

单链断裂的重接　DNA单链断裂是常见的损伤，其中一部分可仅由DNA连接酶（ligase）参与而完全修复。

此酶在各类生物各种细胞中都普遍存在，修复反应容易进行。

但双链断裂几乎不能修复

碱基的直接插入　DNA链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点，能被DNA嘌呤插入酶（insertase）识别结合，在K＋存在的条件下，催化游离嘌呤或脱氧嘌呤核苷插入生成糖苷键，且催化插入的碱基有高度专一性、与另一条链上的碱基严格配对，使DNA完全恢复。

烷基的转移　在细胞中发现有一种O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶，能直接将甲基从DNA链鸟嘌呤O6位上的甲基移到蛋白质的半胱氨酸残基上而修复损伤的DNA。

2）切除修复（excisionrepair）

是修复DNA损伤最为普遍的方式，对多种DNA损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用。

首先由核酸酶识别DNA的损伤位点，在损伤部位的5′侧切开磷酸二酯键。

不同的DNA损伤需要不同的特殊核酸内切酶来识别和切割。

由5′→3′核酸外切酶将有损伤的DNA片段切除。

在DNA聚合酶的催化下，以完整的互补链为模板，按5′→3′方向DNA链，填补已切除的空隙。

由DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来的DNA断链连接起来。

这样完成的修复能使DNA恢复原来的结构。

3）错配修复（mismatchrepair）

是按模板的遗传信息来修复错配碱基的，因此，修复时首先要区别模板链和新合成的DNA链。

这是通过DNA的甲基化实现的。

E.coli错配修复需要Dam甲基化酶，MutH，MutL，MutS蛋白，DNA解螺旋酶II，SSB，DNA聚合酶，核酸外切酶和DNA连接酶。

这样，半甲基化DNA成为识别模板链和新合成链的基础。

错配修复发生在GATC的邻近处，故这种修复也称为甲基指导的错配修复（methyl-directedmismatchrepair）

4）重组修复（recombinationalrepair）

在某些情况下没有互补链可以直接利用，其修复可用DNA重组方式。

重组修复不能完全去除损伤，损伤的DNA段落仍然保留在亲代DNA链上，只是重组修复后合成的DNA分子是不带有损伤的，但经多次复制后，损伤就被“冲淡”了，在子代细胞中只有一个细胞是带有损伤DNA的。

5）应急修复（SOS修复）

是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，这是一种无模板指导的复制，故留下的错误较多，故又称为错误倾向修复（errorpronerepair），使细胞有较高的突变率。

RecA在SOS反应中起核心作用，三种功能a、DNA重组活性b、与S.S.DNA结合活性c、少数蛋白的proteinase活性。

当DNA正常复制时RecA不表现proteinase活性

30.细菌的基因转移主要有4种机制：

接合（conjugation）、细菌与细菌接触后细菌DNA转移和重组。

转化（transformation）、外源遗传物质（如质粒DNA等）进入细菌，引起细菌遗传变化的现象。

但外源DNA并不整合到宿主染色体DNA上。

转导（transduction）、是通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程。

细胞融合（cellfusion）、在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜融合导致的基因转移和重组。

31.转座过程的特征：

①能从基因组的一个位点转移到另一个位点，从一个复制子转移到另一个复制子；

②不以独立的形式存在（如噬菌体或质粒DNA），而是在基因组内由一个部位直接转移到另一部位；

③转座子编码其自身的转座酶，每次移动时携带转座必需的基因一起在基因组内跃迁，所以转座子又称跳跃基因；

④转座的频率很低，且插入是随机的，不依赖于转座子（供体）和靶位点（受体）之间的任何序列同源性；

⑤转座子可插入到一个结构基因或基因调节序列内，引起基因表达内容的改变，如使该基因失活，如果是重要的基因则可能导致细胞死亡。

转座子的结构特征：

①两端有20-40bp的反向重复序列（invertedrepetitivesequence,IR）；

②具有编码转座酶（transposase）的基因,这种酶催化转座子插入新的位置。

转座子转座的特征

①转座不依赖于靶序列的同源性

②转座后靶序列重复

③转座子的插入具有专一性

④转座具有排他性

⑤转座具有极性效应

⑥活化临近的沉默基因

⑦区域性优先

转座子的类型：

①简单转座子（simpletransposon）又称为插入序列（insertionsequence，IS）。

只含有与转座有关的酶基因，不含抗药性等其他基因，其两端都具有15～25bp的反向重复序列（invertedrepeat，IR）。

可以在不同的复制子间转移位置，以非正常重组的方式从一个位点插入到另一个位点，从而对该位点的基因的结构与表达产生多种遗传效应。

②复合转座子（compositetransposon，Tn）一些转座子除了除了有转座酶基因外，还携带药物抗性（或其他）标记。

这些转座子以Tn和数码来命名。

其中一类是由携带药物标记的中央区域和两侧的臂（arms）组成的复合因子。

转座子的转座机制：

转座发生时，受体分子中有一段很短的、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。

转座作用的机制仍可分为三种不同类型：

①复制型，通过一个共合体进行。

引起了转座子的一个复制，它插入到一个接受位点。

捐赠位点保持不变，以致捐赠者和接受者都有转座子的一个复制

②非复制型，借助断裂和重聚进行。

允许一个转座子像物体一样从捐赠们点移动到接受位点，这样就在捐赠位点留下了一个断裂。

③保守型，描述了另一种非复制结果，因子在捐赠位点被切除，然后通过一连串的反应插入到一个靶位，这样每一个核苷粘合都被保留。

其中复制型转座需要两种酶，转座酶和解离酶

转座子的某些遗传学效应：

①引起插入突变

②插入位置上出现新的基因

③造成插入位置上出现靶DNA的少数核苷酸对的重复

④转座后原来位置上保持原有的转座子

⑤引起染色体的畸变

⑥切除

32.RNA分子的三大类：

信使RNA（messengerRNA,mRNA）

原核生物mRNA特征：

先导区+翻译区（多顺反子）+末端序列

真核生物mRNA特征：

“帽子”（m7G-5´ppp5´-N-3´p）+单顺反子+“尾巴”（PolyA）

核糖体RNA（ribosomalRNA,rRNA）

单链，与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能。

原核生物由5SrRNA，16SrRNA，23SrRNA组成；

真核生物由5SrRNA，5.8SrRNA，18SrRNA和28SrRNA组成。

转移RNA（transferRNA,tRNA）

二级结构特征：

单链三叶草叶形四臂四环

三级结构特征：

在二级结构基础上进一步折叠扭曲形成倒L型。

33.RNA聚合酶的结构

E.coliRNA聚合酶由五个亚基所组成,即α2ββ‘σ。

α、β、β’、σ四种亚基。

σ亚基的最主要的功能是识别启动子。

β亚基可能参与底物（包括前体核苷三磷酸以及已经形成的RNA链）的结合以及催化磷酸二酯键的形成。

α亚基可能参与全酶和启动子的牢固结合。

α2ββ‘σ这样的整个酶分子称为“全酶”（Holo-enzyme）。

而σ亚基解离后的其余部分（α2ββ‘）称为核心酶（Coreenzyme）。

34.原核生物RNA的酶促合成

⑴RNA合成的起始

①起始位点的识别

σ识别正确的启动位点，启动子的结构至少由三部分组成：

-35序列提供了RNA聚合酶全酶识别的信号；-10序列是酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）；第三部分是RNA合成的起始点。

当σ亚基发现其识别位点时,全酶就与-35序列结合（初始结合）,形成一个封闭的启动子复合物。

整个酶分子向-10序列转移并与之牢固结合,然后-10序列及起始位点处发生局部解链,一般为12bp-17bp。

这时的全酶和启动子的复合物称为开放性启动子复合物。

②转录起始

加入的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP。

所形成的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点，σ亚基就会被释放脱离核心酶。

⑴链的延伸

以NTP为原料和能量,DNA模板链为模板，靠核心酶的催化，核苷酸间通过3´,5´-磷酸二酯键成核糖核酸链（RNA）。

σ亚基脱落后，NusA因子就结合到核心酶上，NusA因子可能在延伸和终止中发挥作用。

⑶RNA合成的终止

转录终止信号有两种情况

弱终止子：

依赖ρ因子（终止因子，terminators）的终止。

在转录终止点之前有一段回文序列。

强终止子：

不依赖ρ因子

（1）在终止点之前具有一段富含G-C的回文区域。

（2）富含G-C的区域之后是一连串的dA碱基序列，它们转录的RNA链的末端为一连串U（连续6个）。

35.真核生物有三种RNApolymeraseI,II,III。

是根椐这三种酶对α–鹅膏蕈碱（α-amanitin）的敏感性不同来区别。

36.真核生物的启动子

（1）RNApolI的启动子

RNApolI转录rRNA的基因。

其启动子可分两部分：

①-40~+5称近启动子或核心启动子（corepromoter）。

决定转录起始的精确位置。

②-165~-40称为远启动子或上游调控元件（upstreamcontrolelements，UCE），影响转录的频率。

启动子位于不转录的间隔区。

（2）RNApolII的启动子

是多部位结构。

它们都是由多个短的序列（元件）所构成。

这些元件都在起始位点的上游。

不同启动子所用的元件的种类、数目以及这些元件所处的位置都不同。

RNApolII不能识别这些元件并与之结合，而是由多种转录因子分别识别并结合后，RNApolII才能结合上去启动转录。

主要有四个部位：

①帽子部位，即转录起始位点。

②TATAbox，基本上由AT碱基对所组成。

③CAATbox，一般位于-75附近。

④增强子（enhancer），一般都在-100以上。

对转录有增强效应，主要在于增强子与起始位点的距离效应。

（3）RNApolIII的启动子

RNApolIII转录5SRNA和tRNA，snRNA基因。

这三种RNA基因的启动子有所不同。

RNApolIII的启动子大都位于转录起始位点的下游。

故又称内部启动子。

37.真核生物的转录过程

38.转录产物的加工：

①真核mRNA前体的加工

剪接（Splicing）去除内含子，连接外显子；5’帽端结构的生成；3’端多聚A（polyA）的附加；由RNA末端腺苷酸转移酶催化。

②rRNA前体的加工

 rRNA基因之间以纵向串联的方式重复排列。

  加工过程：

剪切作用：

需核酸酶参与；甲基化修饰：

修饰在碱基上；自我剪接：

一种核酶的作用。

 原核rRNA加工：

rRNA含非转录的间隔区，其产物中含tRNA

真核rRNA加工：

5S自成体系加工