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氨基酸分析方法包测定饲料中氨基酸

VenusilAA氨基酸分析方法包测定饲料中氨基酸

马淑伟李倩杨定忠朱旭东孙永超

（天津博纳艾杰尔科技有限公司

摘要:

氨基酸分析是饲料中含氮量测定和蛋白质含量测定的一种重要辅助手段,随着反相色谱技术的发展,采用反相HPLC色谱测定氨基酸越来越普遍。

本文使用Venusil-AA氨基酸分析方法包建立了饲料中氨基酸分析的HPLC方法,在50-1250nmol/mL的浓度范围内,18种氨基酸具有良好的线性范围,相关系数r大于0.999,检测限约为5pmol,具有良好的重复性和稳定性,并且通过使用不同的HPLC仪器验证了该方法具有良好的耐用性。

1实验部分

1.1仪器

高效液相色谱仪（配制要求:

可梯度洗脱,紫外检测,可控柱温;Venusil-AA氨基酸分析方法包（天津博纳艾杰尔科技,包括:

VenusilAA氨基酸分析专用柱1支,4.6×250mm,5μm;PITC异硫氰酸苯酯衍生剂10瓶,25μL/瓶;含17种氨基酸的标准溶液2瓶,2mL/瓶;内标物正亮氨酸1瓶,100mg/瓶;衍生溶媒三乙胺2瓶,1.4mL/瓶;塑料离心管,1.5mL;实验室用样品粉碎机;样品筛:

孔径0.25mm;离心机;真空泵;恒温干燥箱;水解管:

安瓿瓶体积20~30mL（用去离子水冲洗干净并烘干;氮吹仪,喷灯等

1.2.试剂

盐酸（优级纯;无水醋酸钠（分析纯;冰醋酸（分析纯;乙腈（色谱纯;去离子水;苯酚（蒸馏;高纯氮气（纯度99.99%;冷冻剂（市售食盐与冰按1:

3混合

1.3.液相色谱条件

色谱柱:

Venusil-AA氨基酸分析专用柱（100Å,4.6mm×250mm,5μm

检测波长:

254nm;柱温:

40℃

流动相A:

称取15.2g无水醋酸钠,加水1850mL,溶解后用冰醋酸调pH至6.5,然后加乙腈140mL,混匀,用0.45µm滤膜过滤。

流动相B:

80%（V/V乙腈溶液,进样量:

2µL

流速:

1mL/min,梯度洗脱（不同色谱仪器,梯度洗脱条件略有不同,见表1

表1不同色谱仪器洗脱梯度程序（不同型号仪器梯度条件略有不同:

时间（minB（%

时间

（min

B（%

时间

（min

B（%

时间

（min

B（%

时间

（min

B（%

00000000005120201171420124151014713.9123334152025302930141533.0210024.520334532502934411002710033.11003310029.0210041.020

3310038100391003710049033.1038.1039.1037.020

450450450450

普析通用公司

L6-2

高效液相色谱仪Agilent1100

HPLC

岛津LC-20AD

HPLC

岛津

LC-10AD/AT

HPLC

Waters1525

HPLC

1.4溶液配制

1.4.10.1mol/L盐酸溶液:

量取9.0mL浓盐酸,加去离子水稀释至1000mL。

1.4.2正亮氨酸内标溶液:

称取正亮氨酸约10mg,加0.1mol/L盐酸溶液10mL溶解,混

匀。

1.4.3三乙胺乙腈溶液:

取三乙胺1瓶,加乙腈8.6mL,混匀。

1.4.4异硫氰酸苯酯乙腈溶液:

取异硫氰酸苯酯1瓶,加乙腈2mL,混匀。

1.4.56mol/L盐酸（含0.1%苯酚:

称取苯酚20mg,加浓盐酸10mL和水10mL溶解,混匀。

1.4.6混合氨基酸标准溶液（标液氨基酸浓度见表2:

准确量取氨基酸标准溶液1.0mL,置于5mL容量瓶中,加0.1mol/L盐酸溶液定容至刻度。

（该溶液在4°C可保存2个月,在-20°C下可保存6个月。

1.4.7异硫氰酸苯酯乙腈溶液:

取异硫氰酸苯酯1瓶,加乙腈2mL,混匀。

表2Venusil-AA氨基酸分析方法包中的氨基酸标准溶液中各氨基酸浓度

氨基酸分子量

浓度

（μmol/mL

浓度

（μg/mL

稀释5倍的氨基酸标准溶液浓度（μg/mL

Asp133.12.5332.866.55

Glu147.132.5367.873.57

Ser105.092.5262.752.55

Gly75.072.5187.737.54

His155.162.5387.977.58

Arg174.22.5435.587.10

Thr119.122.5297.859.56

Ala89.092.5222.744.55

Pro115.132.5287.857.57

Tyr181.192.5453.090.60

NH4Cl53.492.5133.726.74

Val117.152.5292.958.58

Met149.212.5373.074.61

Cys240.31.25300.460.08

Ile131.172.5327.965.59

Leu131.172.5327.965.59

Phe165.192.5413.082.60

Lys146.192.5365.573.10

总氨基酸5636.31127.26

由于在酸水解过程中,色氨酸（Trp几乎被破坏,因此如需测定色氨酸,则应采用碱水解法来水解样品。

Venusil-AA氨基酸分析方法包的氨基酸标准溶液中不含有色氨酸,如要测定色氨酸,需单独购买,用前配制。

1.5样品制备

1.5.1饲料游离氨基酸含量测定样品溶液制备

准确称取适量饲料（使样品中需测定的单个氨基酸含量在5~10mg或总氨基酸含量在100-150mg范围内,置于烧杯中,加0.1mol/L盐酸30mL,搅拌提取15min,静置5分钟,将上清液过滤到100mL容量瓶中,残渣加0.1mol/L盐酸25mL,搅拌3min,重复提取两次,再将上清液过滤到上述容量瓶中,用水冲洗滤纸上的残渣,收集滤液并加0.1mol/L盐酸定容至刻度,摇匀。

1.5.2饲料水解氨基酸含量测定样品溶液制备

1.5.

2.1酸水解法:

准确称取一定量样品,使样品氨基酸总量在50~75mg范围内,置于20-30mL安瓿瓶中,加入10mL含0.1%苯酚的6mol/L盐酸,振摇使样品溶解或使样品均匀分散于溶液中,将安瓿瓶置-20℃冰箱中冷冻3~5min,充氮后用喷灯熔封,然后置110±1℃烘箱中水解24小时,取出冷却,打开安瓿瓶,将水解液全部转移到50mL容量瓶内,用超纯水或去离子水定容至刻度,混匀,供衍生使用。

1.5.

2.2碱水解法:

准确称取一定量样品,使样品氨基酸总量在50~75mg范围内,置于聚四氟乙烯衬管中,加4mol/L氢氧化锂溶液（称取一水合氢氧化锂16.78g,用水溶解并稀释至100mL,使用前取适量超声或通氮脱气1.50ml,于液氮中冷冻,而后将衬管插入水解玻管,抽真空至

7Pa（≤5Х10-2,mm汞柱,封管。

然后,将水解管放入（110士1℃恒温干燥箱,水解20小时。

取出水解管,冷至室温,开管,将水解液定量地转移到50mL容量瓶中,加入6mol盐酸溶液1.00mL中和,并加水定容刻度。

用0.45μm滤膜过滤后,取清液贮于冰箱中,供衍生使用。

（注:

若样品颗粒较大,则在称样前应对样品粉碎,过孔径为0.25mm的样品筛,并充分混匀。

另外若在试样提取过程中,过滤太慢,也可离心10min（4000r/min。

1.5.3氨基酸标准溶液和样品溶液的衍生

准确量取样品溶液200μL,置1.5mL塑料离心管中,准确加入20μL正亮氨酸内标溶液,混匀,加220μL0.1mol/L盐酸溶解,加入三乙胺乙腈溶液100μL,异硫氰酸苯酯乙腈溶液100μL,混匀,室温放置1小时,然后加入正己烷400μL,振摇后放置10分钟,取下层溶液,用0.45µm滤器过滤。

另准确量取混合氨基酸标准溶液200μL,置于1.5mL塑料离心管中,准确加入20μL正亮氨酸内标溶液,混匀,加入三乙胺乙腈溶液100μL,异硫氰酸苯酯乙腈溶液100μL,混匀,室温放置1小时,然后加入正己烷400μL,振摇后放置10分钟,取下层溶液,用0.45µm滤器过滤。

2结果和分析

2.1专属性

图1专属性验证图谱

出峰顺序:

1Asp（门冬氨酸

2Glu（谷氨酸

3Ser（丝氨酸

4Gly（甘氨酸

5His（组氨酸

6Arg（精氨酸

7Thr（苏氨酸

8Ala（丙氨酸

9Pro（脯氨酸10NH3（氨?

11Tyr（酪氨酸12Val（缬氨酸13Met（蛋氨酸14Cy2（胱氨酸15Ile（异亮氨酸16Leu（亮氨酸17Nle（正亮氨酸（内标18Phe（苯丙氨酸19Trp（色氨酸20Lys（赖氨酸

专属性实验结果表明,包括氨及内标物在内的20种氨基酸得到完全分离,相邻氨基酸峰之间均达到基线分离,分离度均大1.5,本方法具有良好的专属性。

2.2线性范围及检测限

表3线性范围和检测限数据

氨基酸线性范围（nmol/mL回归方程检测限（pmolAsp50-1250Y=1225.9X-33.94r=0.99914.0

Glu50-1250

Y=1186.4X-19.625,r=0.99955.6Ser50-1250

Y=1013X-15.56,r=0.99975.1Gly50-1250

Y=929.56X-8.69,r=1.0004.6His50-1250

Y=947.35X-6.0674,r=15.0Arg50-1250

Y=958.73X-14.17,r=0.99984.4Thr50-1250

Y=1000.3X-18.106,r=0.99985.1Ala50-1250

Y=934.8X-7.37,r=0.99994.7Pro50-1250

Y=856.34X-11.96,r=0.99993.9Tyr50-1250

Y=825.57X-8.96,r=13.6Val50-1250

Y=845.34X-9.88,r=0.99993.7Met50-1250

Y=859.65X-6.05,r=13.8Cy250-1250Y=1120.3X+42.84,r=0.999915.8

Ile50-1250

Y=821.02X+7.97,r=14.0Leu50-1250

Y=843.89X-5.85,r=13.5

Phe50-1250

Y=838.76X-7.74,r=13.5Trp50-1250

Y=746.83X-9.717,r=12.9Lys50-1250

Y=454.26X-8.88,r=11.3

在50-1250nmol/mL的浓度范围内,18种氨基酸具有良好的线性范围,相关系数r大于0.999,检测限约为5pmol。

2.3重复性

2.3.1进样重复性

表4进样重复性数据

氨基酸保留时间RSD%

（n=6

氨基酸峰面积/内标峰面积

RSD%（n=6

Asp0.180.95Glu0.140.73Ser0.090.37Gly0.060.14His0.060.21Arg0.050.30Thr0.030.31Ala0.070.19Pro0.000.18Tyr0.030.25Val0.000.21Met0.020.16Cys20.000.59Ile0.020.10Leu0.020.17Nle0.020.00Phe0.020.16Trp0.020.06Lys0.000.22

2.3.2衍生重复性（同一份样品重复衍生6份,分别进样测定

表5衍生重复性数据

氨基酸氨基酸峰面积/内标峰面积

RSD%（n=6

Asp0.81

Glu0.64

Ser0.62

Gly0.65

His0.97

Arg0.97

Thr0.79

Ala0.63

Pro0.71

Tyr0.54

Val0.54

Met0.61

Cys20.83

Ile0.71

Leu0.5

Nle0

Phe0.57

Trp0.52

Lys0.61重复性试验结果表明:

重复性良好,18种氨基酸保留时间RSD<0.2%,各氨基酸峰面积与内标峰面积的比值的RSD<1%,18种氨基酸的衍生重复性RSD<1%。

2.4衍生溶液的稳定性

时间（小时02681216240-24hr氨基酸氨基酸峰面积/内标峰面积均值RSD（%n=7Asp0.29870.29950.30420.30990.31030.31040.31080.30631.62Glu0.28650.29020.29380.29760.29800.30320.30050.29571.98Ser0.32930.33350.33490.33830.33760.33970.33580.33561.04Gly0.34660.34750.34740.34860.34810.34790.34250.34700.59His0.33820.34030.34200.34400.34380.34420.33890.34160.74Arg0.34510.34910.35140.35390.35400.35610.35070.35151.04Thr0.33480.33820.34040.34310.34270.34520.34070.34071.01Ala0.34400.34550.34550.34710.34680.34660.34090.34520.63Pro0.38130.38270.38310.38490.38430.38410.37890.38280.54Tyr0.39240.39290.39340.39610.39580.39480.39020.39360.53Val0.38480.38600.38590.38740.38720.38520.38050.38530.60Met0.37300.37510.37500.37680.37610.37730.37220.37510.51Cy20.23630.23540.23180.22960.22830.21910.19150.22466.97Ile0.40900.40930.40940.41020.40910.41010.40600.40900.34Leu0.37880.38010.38000.38100.38140.38190.37950.38040.29Nle1.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00000.00Phe0.38490.38460.38720.38620.38650.38880.39530.38770.95Trp0.43420.43460.43620.43660.43680.43800.44360.43720.71Lys0.71180.70870.71720.71430.71400.72190.72560.71620.82

结果表明,除胱氨酸外,其他氨基酸的衍生物在室温下可稳定24小时,衍生可靠

图2采用不同HPLC仪器验证耐用性谱图

由图2可以看出:

采用不同品牌的高效液相色谱仪进行分析,均可获得良好的分离效果,表明该方法具有良好的耐用性。

2.6饲料氨基酸分析

测定了市售兔肉肥饲料和益多快长素饲料,分别酸水解和碱水解后测定其氨基酸含量,结果见图3

图3兔肉肥饲料的氨基酸分析图谱与益多快长素饲料的氨基酸分析图谱

PgeneralL6-2HPLC,VWDAgilent1100HPLC,VWD检测器

ShimadzuLC-10ADHPLCVWD

Waters1525BinarypumpHPLC

DualλAbsorbanceDetector

样品溶液中各种氨基酸浓度（μg/mL=f1/f2×C

其中:

f1=样品溶液中各氨基酸峰面积/内标峰面积

f2=混合氨基酸标准溶液中各氨基酸峰面积/内标峰面积

C=氨基酸对照品浓度（μg/mL

样品中总氨基酸含量（%=样品溶液中所有氨基酸浓度总和（μg/mL×V×10-6×100/W

其中:

V=样品溶液的定容体积（mL

W=样品质量（g

4.结论

VenusilAA分析方法使用PITC柱前衍生法测试氨基酸组成快速、灵敏;衍生方便、快速,衍生物单一、稳定,-20°C可贮存数月;结果准确,试剂、副产物、溶剂等多种干扰因素可通过快速蒸发去除;紫外检测（254mm灵敏度高;一、二级氨基酸均可检测。

本方法测定饲料中的氨基酸结果准确可靠,适用于各种品牌的液相色谱仪,值得广泛推广。