干旱逆境下烟草植株的各项指标分析.docx
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干旱逆境下烟草植株的各项指标分析
生物技术
大实验
课程题目：
逆境胁迫下烟草的各项指标分析
学生姓名：
李方
学号：
20075973
专业班级：
生物技术07-1班
指导老师：
江力
2011年01月08日
目录
中文摘要……………………………………………………………………………03
1引言………………………………………………………………………………04
2材料与方法……………………………………………………………………04
2.1实验材料…………………………………………………………………04
2.2实验方法…………………………………………………………………05
2.3试验指标的测定…………………………………………………………06
（一）叶片中游离脯氨酸含量的测定……………………………………06
（二）植物叶片中丙二醛含量的测定……………………………………07
（三）植株叶片中叶绿素含量的测定…………………………………08
（四）植物体内可溶性蛋白含量的测定…………………………………09
3结果与分析……………………………………………………………………10
3.1干旱胁迫对植株中游离脯氨酸含量的影响……………………………10
3.2干旱胁迫对植株中丙二醛含量的影响…………………………………10
3.3干旱胁迫对植株中叶绿素含量的影响…………………………………11
3.4干旱胁迫对植株中可溶性蛋白含量的影响……………………………11
4讨论与总结……………………………………………………………………12
谢辞………………………………………………………………………………15
参考文献…………………………………………………………………………15
干旱胁迫下烟草植株的各项指标分析
摘要：
采用盆栽实验法，设置0-7天的连续干旱处理，研究植株幼苗对抗干旱胁迫的能力。
实验采用随机分组设计，对处理植株叶片中的游离脯氨酸，丙二醛，叶绿素及可溶性蛋白的含量等指标进行测定分析。
结果表明：
干旱逆境下，随干旱处理时间的延长，叶片中游离脯氨酸的含量呈现为逐步上升的趋势；丙二醛与脯氨酸的变化趋势基本相同；而叶绿素和可溶性蛋白的含量却基本保持下降的趋势。
根据盆栽试验结果及对其在培养过程中的生长表现，认为植物对干旱的具有较好的抗性，其体内对抗衰老的物质含量升高较平稳。
关键词：
干旱逆境，植株，脯氨酸，丙二醛，叶绿素，可溶性蛋白，含量，分析
1引言
烟草（tobaccoplants）是茄科一年生草本植物，烟草属大约有60多种，但真正用于制造卷烟和烟丝的，基本只有红花烟草，此外还有少部分用黄花烟草，其他品种很少用。
一般来说“烟草”在台湾称为作菸草，港澳称为作烟草。
辛，温。
有毒。
有消肿解毒，杀虫的功能。
脯氨酸是植物体内一种细胞质渗透调节物质且具有清除活性氧的作用,几乎所有的逆境都会引起植物体内脯氨酸含量的改变。
在干旱逆境的条件下，植株体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。
丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。
它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。
叶绿体中含有绿色素（叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（胡萝卜素和叶黄素）。
这两类色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用酒精或丙酮等提取。
叶绿体色素可用色层分析法加以分离。
其原理主要是色素种类不同，被吸附剂吸附的强弱就不同，当用适当溶剂推动时，不同色素的移动速度不同，色素便被分离。
植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少。
2材料与方法
2.1实验材料
2.1.1实验植株：
健康的烟草幼苗或小白菜，泥土若干
2.1.2实验器材：
分光光度计；电子分析天平；高速冷冻离心机；培养皿（12cm）18套；研钵及研棒（或组织捣碎机）16套；漏斗4个；漏斗架2个；滤纸5包；剪刀4把；洗耳球4个；试管及试管架3套；刻度吸管（1ml、5ml、10ml）2、8、2支；吸管架2个；小电炉2个；25ml容量瓶4个；试剂瓶（100ml、250ml、500ml）5、15、5个；玻璃棒4支；棕色试剂瓶（100ml、250ml）3、3个；25ml刻度试管18支，软木塞若干，烧杯（50ml、100ml、500ml）4、6、10个；离心管10ml24支；量筒（50ml、100ml、500ml）3、3、3个，注射器3个，移液枪（100ul、1000ul可调）4、4个；标签纸5张；标记笔4支。
2.1.3实验试剂：
（1）丙酮,甲醇,醋酸酮,盐酸,氢氧化钾,石英砂,碳酸钙（粉）,无水硫酸钠,四氯化碳,乙醚、冰醋酸；甲苯；10％三氯乙酸；0.6％硫代巴比妥酸（TBA）溶液；80﹪乙醇；95﹪酒精；石油醚；20﹪KOH甲醇溶液；30﹪醋酸；醋酸铜粉；氯化钠。
（2）2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：
将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol·L－1磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。
（3）3％磺基水杨酸配配制：
3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml，贮于冰箱中。
（4）10μg·ml-1脯氨酸标准母液配制：
精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg·ml－1脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml,加蒸馏水稀释定容至100ml,即为10μg·ml-1脯氨酸标准液，贮于冰箱中。
（5）Tris提取液（50mmol·L－1Tris－HCl，pH7.8，含0.5mmol·L－1MgCl2，1mmol·L－1EDTA，1mmol·L－1二硫苏糖醇,缩写：
DTT）。
（0.5mmol·L－1MgCl2，1mmol·L－1EDTA，1mmol·L－1二硫苏糖醇,可以不用，直接用Tris－HCl即可）
（6）考马斯亮蓝溶液配制：
称取考马斯亮蓝G－250100mg，加95％乙醇50ml，和85％磷酸100ml，然后定容至1000ml。
（可大致配200-300ml）
（7）牛血清蛋白标准母液配制:
用0.15mol·L－1NaCl溶液配成100μg·ml－1牛血清蛋白标准液。
2.2实验方法
从正在培养的7个长势一致的烟草培养物随机挑出3个进行逆境胁迫培养，即：
7各培养皿都置于室温和有光照的环境中培养，4个有水，标为1、2、3、4、5、6、7，而挑出的3个不浇水，标为A、B、C、D、E、F，对其进行干燥处理。
其他条件均是最适条件，在幼苗培养出的叶子有三片及以上数量（或保证叶片重量达3g以上），即可进行指标的测定。
在指标正式进行测定时，第一天对1号进行测定，第二至第七天，依次对2-A、4-B、4-C、5-D、6-E、7-F进行测定，并做3个重复。
对7次测得的13批数据进行整理。
2.3试验指标的测定
（一）叶片中游离脯氨酸含量的测定
1.1脯氨酸标准曲线的制作
1.1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～12μg的脯氨酸标准液。
加入表1.中试剂后，置于沸水浴中加热30min。
取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
表1.脯氨酸标准曲线绘制—各试管中试剂加入量
试剂
管号
0
1
2
3
4
5
10μg·ml-1脯氨酸标准液（ml）
蒸馏水（ml）
冰醋酸（ml）
2.5﹪酸性茚三酮（ml）
0
2
2
2
0.2
1.8
2
2
0.4
1.6
2
2
0.6
1.4
2
2
0.8
1.2
2
2
1.0
1.0
2
2
每管脯氨酸含量（μg）
0
2
4
6
8
10
1.1.2用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。
1.1.3标准曲线的绘制
以1～5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
1.2样品的测定
1.2.1脯氨酸的提取
称取不同处理的烟草叶片各0.5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。
1.2.2测定
吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。
冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000r/min离心5min。
用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。
1.3计算结果
从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：
X×提取液总量（ml）
脯氨酸含量（μg·g－1Fw）＝———————————————————
样品鲜重（g）×测定时提取液用量（ml）
公式中：
X－从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg）
（二）植物叶片中丙二醛含量的测定
2.1丙二醛的提取
称取受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片1g，加入少量石英砂和10％三氯乙酸2ml，研磨至匀浆，再加8ml10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。
2.2显色反应及测定
取4支干净试管，编号，3支为样品管（三个重复），各加入提取液2ml，对照管加蒸馏水2ml，然后各管再加入2ml0.6％硫代巴比妥酸溶液。
摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心。
取上清液分别在532、600和450nm波长下测定吸光度（A）值。
2.3丙二醛含量计算：
由于蔗糖－TBA反应产物的最大吸收波长为450nm，毫摩尔吸收系数为85.4×10－3，MDA－TBA反应产物在532nm的毫摩尔吸收系数分别是7.4×10－3和155×10－3。
532nm非特异性吸光值可以600nm波长处的吸光值代表。
按双组分分光光度法原理，建立方程组，解此方程组即可求出MDA及可溶性糖浓度。
方程组：
A450=（85.4×10－3）·C糖
（A532－A600）=（155×10－3）·CMDA+（7.4×10－3）·C糖
解得：
A450
C糖=——————=11.71A450（mmol·L－1）
85.4×10－3
CMDA=6.45（A532－A600）－0.56A450-（μmol·L－1）
公式中：
A450—在450nm波长下测得的吸光度值
A532—在532nm波长下测得的吸光度值
A600—在600nm波长下测得的吸光度值
﹡—1.55×105为摩尔比吸收系数
C糖、CMDA分别是反应混合液中可溶性糖、MDA的浓度。
2.3.1按下式计算提取液中MDA浓度
反应液体积（ml）
CMDA×—————————
1000
提取液中MDA浓度（μmol·ml－1）=———————————————
测定时提取液用量（ml）
2.3.2按下式计算样品中MDA含量
提取液中MDA浓度（μmol·ml－1）×提取液总量（ml）
MDA含量（μmol·g－1Fw）=————————————————————————
植物组织鲜重（g）
（三）植株叶片中叶绿素含量的测定
3.1叶绿素的提取
称取烟草鲜叶0.20g（可视叶片叶绿素含量增减用量），剪碎放入研钵中，加少量碳酸钙粉和石英砂及3～5ml95﹪乙醇研成匀浆，再加约10ml95﹪乙醇稀释研磨后，用滤纸过滤入25ml容量瓶中，然后用95﹪乙醇滴洗研磨及滤纸至无绿色为止，最后定容至刻度，摇匀，即得叶绿素提取液。
3.2测定
取光径为1cm的比色杯，倒入叶绿素提取液距杯口1cm处，以95﹪乙醇为空白对照，在652nm波长下读取吸光度（A）值。
3.3计算
将测得的吸光度A652值代入公式
（1）,即可求得提取液中叶绿素浓度。
所得结果再代入公式
（2），即可得出样品中叶绿素含量（mg·g－1Fw）。
A652
C（mg·ml－1）=————……………………………………………………
（1）
34.5
公式中：
C—叶绿素（a和b）的总浓度（mg·ml－1）
A652—表示在652nm波长下测得叶绿素提取液的吸光度
34.5为叶绿素a和b混合溶液在652nm波长的比吸收系数（比色杯光径为1cm,样品浓度为1g·L－1时的吸光度）。
C（mg·ml－1）×提取液总量（ml）
叶绿素含量（mg·g－1Fw）=————————————————……
（2）
样品鲜重（g）
（四）植物体内可溶性蛋白含量的测定
4.1.牛血清蛋白标准曲线的制作
4.1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～100μg的牛血清蛋白标准液。
表2.牛血清蛋白标准曲线—各试管中试剂加入量
试剂
管号
0
1
2
3
4
5
100μg·ml－1牛血清蛋白标准液（ml）
Tris缓冲液（ml）
考马斯亮蓝溶液（ml）
0
1
5
0.2
0.8
5
0.4
0.6
5
0.6
0.4
5
0.8
0.2
5
1.0
0
5
每管牛血清蛋白含量（μg）
0
20
40
60
80
100
加入表中试剂后，摇匀，以0号管为空白对照，在595nm波长处测定其吸光度（A）值。
4.1.2标准曲线绘制
以牛血清蛋白含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
4.2蛋白质的提取
称取叶片0.3～0.5g，剪碎于冷冻过的研钵中加提取液3ml，加少量石英砂，在冰浴中快速研磨成匀浆，匀浆倒入离心管中，再用5ml提取液（分两次）将研钵中匀浆洗入离心管，然后在10000r/min，4℃条件下离心20min，上清液即为可溶性蛋白质提取液。
4.3测定
将上清液取0.1ml放入试管中，再加Tris缓冲液0.9ml，空白对照管加Tris缓冲液1ml，然后各管分别再加入考马斯亮蓝染色液5ml，摇匀，在595nm波长处测定吸光度（A）值。
4.4结果计算
根据所测得的样品液吸光度值，从标准曲线查出蛋白质含量，按下公式计算可溶性蛋白质和非可溶性蛋白质含量。
标准曲线上查得蛋白质含量（μg）×提取液量（ml）
可溶性蛋白质的含量＝————————————————————————
（μg·g－1·Fw）样品鲜重（g）×测定时提取液用量（ml）
3结果与分析
3.1干旱胁迫对植株中游离脯氨酸含量的影响
图1.脯氨酸标准曲线
表3游离脯氨酸含量（μg•g－1Fw）
时间/天
1
2
3
4
5
6
7
正常
15.24
14.58
16.03
15.96
15.81
15.70
15.63
干旱
24.90
25.52
26.67
28.06
27.63
29.19
图2.游离脯氨酸含量的变化趋势
从表3和图2中可以看出，随干旱时间的延长，植株叶片中游离脯氨酸的含量呈上升趋势，针对测定的数据中有个别出现误差，可能是因为取材的原因，由于叶片来源于不同的植株，或多或少的引起数据的波动，所以做多组数据研究其变动趋势，测得植株叶片中游离脯氨酸的含量相对于正常培养的植株要高，且随干旱胁迫时间的延长游离脯氨酸的含量基本呈上升趋势。
3.2干旱胁迫对植株中丙二醛含量的影响
表4丙二醛含量（μmol·g－1Fw）
时间/天
1
2
3
4
5
6
7
正常
0.00695
0.008479
0.00588
0.003926
0.004959
0.005688
0.006705
干旱
0.008212
0.009313
0.009066
0.008911
0.008638
0.010004
图3.植株叶片中丙二醛含量的变化趋势
从表4和图3中可以看出，随干旱时间的延长，植株叶片中丙二醛的含量基本呈上升趋势，针对图3中平稳线性和测定数据中的个别误差，可能是因为取材的原因，由于叶片来源于不同的植株，或多或少的引起数据的波动，所以做多组数据研究其变动趋势，测得植株叶片中丙二醛的含量相对于正常培养的植株要高，且随干旱胁迫时间的延长丙二醛的含量呈上升趋势。
3.3干旱胁迫对植株中叶绿素含量的影响
表5叶绿素含量（mg·g－1Fw）
时间/天
1
2
3
4
5
6
7
正常
1.9337
2.0092
1.9337
2.0380
1.9646
1.9999
2.0329
干旱
1.6553
1.6158
1.4960
1.4086
1.4112
1.3727
图4.植株叶片中叶绿素含量的变化趋势
从表5和图4中得出，随干旱时间的延长，植株叶片中叶绿素的含量明显呈下降的趋势，针对图4中测定数据中的平稳线性，可能是因为取材的原因，由于叶片来源于不同的植株，或多或少的引起数据的偏差，所以做多组数据研究其变动趋势，测得干旱植株叶片中叶绿素的含量相对于正常培养的植株要低，且随干旱胁迫时间的延长叶绿素的含量呈下降趋势。
3.4干旱胁迫对植株中可溶性蛋白含量的影响
图5.牛血清白蛋白标准曲线
表6可溶性蛋白含量（μg•g－1•Fw）
时间/天
1
2
3
4
5
6
7
正常
478.30
510.79
543.76
530.18
543.03
531.88
532.61
干旱
377.45
288.48
295.76
246.55
262.30
235.88
图6.植株叶片中可溶性蛋白含量的变化趋势
由表6和图6可得出，随干旱时间的延长，植株叶片中可溶性蛋白的含量呈下降的趋势，针对图4中测定数据中的明显波动，可能是因为取材的原因，来源于不同的植株的叶片，或多或少的引起数据的偏差，所以做了多组数据研究其变动趋势，并得出干旱植株叶片中可溶性蛋白的含量相对于正常培养的植株要低得多，且随干旱胁迫时间的延长可溶性蛋白的含量呈明显下降的趋势。
4讨论与总结
在干旱的逆境条件下，植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。
因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。
试验中从第二天的24.90μg•g－1Fw上升到第七天的29.19μg•g－1Fw，且所有实验组的含量都较正常值高。
脯氨酸是植物体内一种细胞质渗透调节物质,几乎所有的逆境都会引起植物体内脯氨酸含量的改变。
脯氨酸具有清除活性氧的作用。
磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。
然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。
在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。
丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。
它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系（含量上升）。
测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸（TBA）在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5－三甲基恶唑2、4－二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。
但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。
植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。
此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。
低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100－300μg·g－1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3＋的终浓度为0.5nmol·L－1。
在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。
试验中，丙二醛的含量由第二天的0.008212μmol·g－1Fw上升到第七天的0.010004μmol·g－1Fw，很明显，干旱使得植株受到了伤害，从而才使得MDA的浓度上升。
植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少。
叶绿体中含有绿色素（叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（胡萝卜素和叶黄素）。
这两类色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用酒精或丙酮等提取。
叶绿体色素可用色层分析法加以分离。
其原理主要是色素种类不同，被吸附剂吸附的强弱就不同，当用适当溶剂推动时，不同色素的移动速度不同，色素便被分离。
植物材料经Tris－HCl缓冲液研磨、离心后，可溶性蛋白质溶于上清液中，非可溶性蛋白则存在于沉淀部分。
将沉淀用碱水解，则会得到非可溶性蛋白的提取液。
蛋白质提取液与考马斯亮蓝G－250反应呈蓝色。
在一定范围内，蛋白质的含量与反应液在595nm波长的吸光度呈正比，由此可求出蛋白质的含量。
从上述的结果以及对其分析来看，干旱的逆境条件在6天的时间中，使得烟草的幼苗植株产生了抵抗机制，并对自体造成了一定的影响，比如说我们研究测定的游离脯氨酸、丙二醛、叶绿素及可溶性蛋白的含量这四个指标都在正常的基础上发生了变化，游离脯氨酸和丙二醛的含量升高，而叶绿素和可溶性蛋白的含量则降低了。
谢辞
为期3周的生物技术大实验圆满的结束，这其中围绕的不光是我们本组同学的辛勤的劳动和而付出，更重要的是为了我们能把实验做得更好的老师和学姐们，没有他们的付出，我们断没有像现在这般完美的实验。
所以，谢谢你们，谢谢你们给我们同学的支持和无私的帮助，同时，也要感谢我们的同学，找工作的和考研的人都能很好的完成自己的工作，让我们的实验能进行得如此好。
【参考文献】
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杨洪兵韩振海许雪峰.NaCl和等渗聚乙二醇对苹果属植物游离脯氨酸含量的影响[J].植物生理学通讯，2005年4月，第41卷第2期：
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[6]期刊：
袁方
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