黑曲霉产柠檬酸资料.docx

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黑曲霉产柠檬酸资料

柠檬酸发酵工艺条件的优化

 摘要 

柠檬酸（2-羟基丙烷三羧酸），是重要的工业原料。

可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。

实验研究了不同硫酸铵浓度分别对黑曲霉摇瓶发酵和实罐发酵生产柠檬酸的影响。

在菌浓度、发酵过程PH、酸度、残糖、温度在发酵过程中的变化几个方面对实罐和摇瓶发酵进行了相关比较。

结果表明：

1）摇瓶发酵的最适硫酸铵浓度为0.4%；实罐发酵最适硫酸铵浓度为0.5%，实罐发酵时硫酸铵浓度过高将产生大量泡沫不利发酵；2）实罐发酵与摇瓶发酵在起始含糖量、菌浓度及发酵温度相同的情况下，随发酵进行，摇瓶发酵的温度更稳定，两者的菌浓度、残糖、PH值变化规律高度一致，酸度变化规律基本一致。

另外实验还就温度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响作用进行了探讨，结果表明实罐发酵的最适温度约为35℃，温度过高会导致发酵液水分流失过多而使发酵失败。

 1. 课题背景 

1.1柠檬酸简介

柠檬酸（citric acid）是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。

 柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸、2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸.

分子式：

C6H8O7 （相对分子质量：

192.13） 物理性质：

无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。

极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大。

 化学性质：

从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质。

加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。

柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离； 加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。

1.2柠檬酸用途

柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。

另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。

它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。

柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。

 1.3柠檬酸循环

又称三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle），克雷布斯循环（Krebs cycle）。

体内物质糖、脂

肪或氨基酸有氧氧化的主要过程。

通过生成的乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成三羧酸（柠檬酸）开始，再通过一系列氧化步骤产生CO2、NADH及FADH2，最后仍生成草酰乙酸，进行再循环，从而为细胞提供了降解乙酰基而提供产生能量的基础。

由克雷布斯（Krebs）于20世纪30年代最先提出。

1.4实验发酵机理 

1）以薯干粉、玉米粉或淀粉等糖类为原料经黑曲霉柠檬酸产生菌（我们采用黑曲霉M288）糖化后产生高浓度的葡萄糖。

2）、黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸：

葡萄糖以EMP（糖酵解途径或者）、HMP（磷酸戊糖循环）两种途径产生丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧形成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应后生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰CoA缩合产生柠檬酸。

3）生理调节：

柠檬酸是黑曲霉的良好碳源，故柠檬酸的积累是菌体代谢失调的结果。

1）Mn2+抑制蛋白质合成造成NH4+的浓度增大，从而解除对PFK的抑制，使EMP通畅；2）柠檬酸脱氢酶在柠檬酸浓度高的情况下活性降低，进一步促进柠檬酸的积累。

1.5发酵方法

发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵 3种方法。

固态发酵是以薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的农副产品为原料，配好培养基后，在常压下蒸煮，冷却至接种温度，接入种曲，装入曲盘，在一定温度和湿度条件下发酵。

采用固态发酵生产柠檬酸，设备简单，操作容易。

液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。

发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。

深层发酵生产柠檬酸的主体设备是发酵罐。

微生物在这个密闭容器内繁殖与发酵。

现多采用通用发酵罐。

它的主要部件包括罐体、搅拌器、冷却装置、空气分布装置、消泡器，轴封及其他附属装置。

发酵罐径高比例一般是1:

2.5，应能承受一定的压力,并有良好的密封性。

除通用式发酵罐外，还可采用带升式发酵罐、塔式发酵罐和喷射自吸式发酵罐等。

为了得到产柠檬酸的优良菌种，通常是从不同地区采集的土壤或从腐烂的水果中分离筛选，然后通过物理和化学方法进行菌种选育。

例如薯干粉深层发酵柠檬酸的菌种就是通过柠檬酸不断变异和选育得到的。

菌种适合在高浓度下发酵，产酸水平较高。

  1.6黑曲霉菌柠檬酸发酵的影响因素

 柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温度、通风量及pH值等条件。

一般认为，黑曲霉适合在28～30℃时产酸。

温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。

微生物生成柠檬酸要求低pH，最适pH为2～4，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。

柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量。

通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。

随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。

采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60％饱和度对产酸有利。

柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下降。

尽管经过几十年的研究，关于柠檬酸发酵机制仍然有很多不够了解的地方，柠檬酸的合成积累涉及到一系列的酶，它们是相互关联的，影响制约柠檬酸发酵的因子也是多种多样的，发酵液中金属离子的含量对柠檬酸的合成有非常重要的作用，过量的金属离子引起产酸率的降低，铁离子能刺激乌头酸水合酶的活性，从而影响柠檬酸的积累。

柠檬酸发酵用的糖蜜原料，因含有大量金属离子，必须应用离子交换法或添加亚铁氰化钾脱铁方能使用。

然而微量的锌、铜离子又可以促进产酸。

相对来说，发酵培养基中的金属离子以及小分子量的有机物是比较容易控制的因子。

但是每种因子的影响不是绝对的，如金属离子Fe2+ 、Mn2+ 等，他们并不是可以无条件降低其浓度，同时它们也是微生物其它正常代谢途径中必须因子，我们只能寻找一个最合适于柠檬酸发酵的浓度。

 资料表明：

高浓度Mn2+将刺激乙酰辅酶A，造成草酰乙酸浓度下降，不利于合成柠檬酸。

铜离子能抑制柠檬酸裂解酶活力[6]，培养基中加Cu2+ ，有利于达到最高柠檬酸产量。

柠檬酸在顺乌头酸酶的催化下转化为顺乌头酸，进而转化为异柠檬酸，Fe2+是乌头酸水合酶专一激活剂，但柠檬酸发酵开始时，需要少量铁存在以促进菌体生长和为柠檬酸合成作准备，随后要控制Fe2+ 的存在才能开始并大量积累柠檬酸。

Johnson等在研究黑曲霉的CO2 固定作用时发现有两个CO2 固定系统，这两个系统需要Mg2+、K + 。

也有说几种常见的金属离子对柠檬酸合成酶的抑制作用，且Ca2+> Mg2+ >Na+ >K+ ，当然还与离子强度有关。

AMP、无机磷和NH4+对磷酸果糖激酶（PFK）有活化作用，NH4+还能有效的解除柠檬酸和ATP对其抑制，NH4+的浓度和柠檬酸生产速度有密切关系。

发酵过程中加入甲醇能明显提高柠檬酸产量。

其可能的机理为：

甲醇抑制a一酮戊二酸脱氢酶活力，提高丙酮酸羧化酶的活力，增加柠檬酸穿过细胞膜能力，降低胞内柠檬酸浓度，促进柠檬酸的合成，甲醇还能抑制柠檬酸裂解酶的活力。

同时发现，甲醇对细胞有一定毒性影响。

据报道，某些氨基酸，B族维生素和生物素也能提高柠檬酸产量，另有多种化合物，如NaF、乙二胺四乙酸钠等，也能增加柠檬酸积累，还有植酸、植酸钠、物理因素能提高柠檬酸产量。

3. 工作内容 

3.1 实验菌株 ;黑曲霉柠檬酸生产菌株M228。

 3.2 主要仪器 

电子天平、生化培养箱、10L机械搅拌式发酵罐、配套设备（空压机、过滤器、蒸汽发生器等）、立式灭菌锅、恒温水浴锅、血球计数板和显微镜、台式高速离心机、碱式滴定装置、离心机、电磁炉。

3.3 种子培养 

茄形瓶斜面培养扩大制备孢子。

马铃薯培养基，35℃恒温培养箱培养3~4天。

标准糖液中加入0.5%的硫酸铵，八层纱布封口，121℃灭菌20min，用无菌移液管吸取25mL无菌水至茄形瓶斜面内，并用酒精灯烧过的接种环轻轻刮下孢子，摇匀后倒入已冷却好的100mL的种子培养基内，包扎好后摇床35℃、200r/min培养20h[17]。

3.4 培养条件

3.4.1糖化清液 

细度为40目以上玉米粉15g与100mL去离子水混合调成浆乳，调节pH为5.5-6.0， 加热并搅拌升温至（65±1）℃，按20U/g原料加入α-淀粉酶及1g/LCaCl2，搅拌均匀，恒温保持60min，液化15min后用0.1%碘液检测不显蓝色或极微淡蓝色，即糖化完全。

四层纱布过滤于250ml三角瓶即得糖化清液。

3.4.2 摇瓶发酵培养 

标准糖液100ml，加入硫酸铵后于121℃灭菌20min，冷却至室温，接种。

摇床35℃、200r/min培养。

3.4.3 实罐发酵培养 

玉米粉900g,加入6L去离子水调成浆乳，调节pH为5.5-6.0，加入发酵罐，按20U/g原料加入α-淀粉酶及1g/LCaCl2，搅拌均匀，恒温保持30-60min，液化20min后用0.1%碘液检测不显蓝色或极微淡蓝色为止。

再加入0.5%的硫酸铵。

蒸汽实罐灭菌后，火焰法接种，200r/min,35℃下通空气发酵，罐压控制在表压0.1MPa。

通风量控制0-18h:

200-400L/h，18h以后：

600-800L/h。

接种后半小时测总糖一次（取发酵液5mL），并记录PH和通风量。

以后每4小时记录PH和通风量，每八小时测残糖和酸度一次（取发酵液10mL，离心取上清），最后一个班次每2小时测1次。

3.5 分析方法 

3.5.1 残糖测定 

菲林热滴定定糖法（空白滴定+样品溶液预滴定+样品溶液正式滴定）。

 3.5.2总糖测定 

取5ml发酵液，加50ml水和7.5ml浓硫酸，加热至沸，保持5min，急速冷却。

冷后用40% NaOH溶液中和至PH7-8，定容至500ml，取样后以残糖测定方法进行测量。

3.5.3 酸度测定[20] 

取5ml发酵液，离心取上清液，精确吸取4ml，加入100ml锥形瓶中，加入2-3滴0.1%酚酞指示剂，用0.1429 mol／L（5.75gNaOH溶于煮沸过的冷蒸馏水中，定容到1000ml，混匀后标定）进行滴定，滴定至微红色，平行滴定3次，记录平均消耗NaOH的体积。

滴定1ml样品液，每消耗1ml0.1429mol/LNaOH时的溶液为1%酸度，也即为发酵液产酸率（%）。

3.5.4 PH测定 

精确PH试纸、PH计（台式）、发酵罐PH电极。

 3.5.5 菌种质量检查 

（黑曲霉菌）在发酵液成球形体，散开的菌丝较少，菌细胞短，一头较粗如“鞋底状”，而污染的菌多呈菌丝状生长，一般曲霉菌细胞较长而平滑。

取培养液稀释在显微镜下观察，合格的菌丝球应是致密形的，菌球直径不应超过0．1ram，菌丝短且粗，分支少，瘤状，部分膨胀[28]。

3.5.6菌浓度测定 

采用B种血球计数板，计数室体积为0.1mm3.一个计数室为一个大方格，一个大方格分成25个中格，每个中格又分为16个小格，即一个计数室由400个小方格组成。

计数时，分别在左上、左下、右上、右下和正中五个中格进行计数，然后计算80个小格中平均每小格上菌细胞数，再计算400个小格即整个计数室中的菌体细胞数。

位于中格线上的菌体只记此中格的上方及右方线上的细胞；凡菌体母细胞分裂的子细胞达母细胞大小的一半时，即可作为两个细胞计。

计算公式：

每毫升发酵液中黑曲霉菌细胞数=（80小格内细胞数/80）*400*104*稀释倍数。

将样品稀释50倍后，采用上述方法进行计数，每个样品重复计数3次，取平均值[29]。

3.5.7 氧浓度测定 

通风量的控制及发酵罐氧分压电极测定。

（以下的是在学校图书馆查阅的）

3.1引言

选育出一株优良的高产菌株只是发酵工作的开始，并不意味着就能得到高产，发酵过程中的发酵参数直接影响该菌株的潜力的发挥。

发酵过程中会有较多因素影响柠檬酸发酵产量，在发酵培养基营养成分方面影响较大的有碳源、氮源、（NH4）2SO4添加量、各种金属离子含量等等。

在发酵培养条件中影响较大的有：

发酵温度、发酵初始pH值、发酵接种量、发酵通风量等等。

控制适合菌株发酵的最佳营养条件和最佳发酵条件，对提高柠檬酸发酵产量有重大影响。

在大规模工业生产中又以通气、搅拌对发酵影响最为显著。

由于上述发酵影响因素对黑曲霉柠檬酸发酵的影响较为显著，所以对这些因素进行具体详细的研究是十分必要的。

为了给黑曲霉柠檬酸发酵创造好的条件，本实验研究了玉米粉凊液发酵的工艺条件。

并为黑曲霉柠檬酸补料发酵打下了基础。

本实验利用摇瓶发酵在实验室采用单因子实验和正交实验研究了黑曲霉Wsy-03的最佳发酵培养基组成（包括碳源，氮源），并对影响黑曲霉柠檬酸发酵的发酵温度、发酵初始pH及过程中pH的控制、发酵接种量进行了研究，利用小型自控发酵罐对发酵溶解氧对黑曲霉柠檬酸发酵的影响形成进行了系统研究，以寻求最优发酵培养基和发酵控制条件，同时柠檬酸的补料发酵的研究提供可靠依据和坚实基础。

3.2实验材料

3.2.1菌种

以柠檬酸主要生产菌株黑曲霉（Aspergillusniger）作为实验菌株。

3.2.2培养基

（1）玉米粉种子培养基：

自来水与玉米粉按质量比4：

1的比例混合，110℃保温并不断搅拌，并加入α-高温淀粉酶，恒温20min-30min，用碘指示剂检验不变蓝，即糖化完全，冷却，回复原来体积，得到20％玉米粉糖化液。

将20％玉米粉糖化液经两层纱布过滤得糖化清液。

用盐酸调节pH到4.5，250mL摇瓶加人50mL的20％玉米粉糖化液，纱布封口，121℃灭菌30min，得种子培养基。

（2）玉米粉发酵培养基：

将20％玉米粉糖化液与过滤后的玉米糖化清液按1：

5比例混合（V/V）。

在500mL摇瓶中加入50mL混合后的培养基，添加0.3%（NH4）2SO4，调pH4.5，纱布封口。

121℃灭菌30min，得发酵培养基。

3.2.3试剂及材料邻苯二甲酸氢钾硫酸铜分析纯天津化学试剂有限公司

盐酸琼脂碘化钾氢氧化钠分析纯莱阳化工有限公司

次甲基蓝碘酚酞酒石酸钾钠葡萄糖耐高温α-淀粉酶2万酶活/mL糖化酶2万酶活/mL玉米粉土豆

3.2.4仪器设备

10L全自动发酵罐瑞士BioengineeringAG

空压机龙海力霸通用机械有限公司

PH电极；pH2050epanel瑞士BioengineeringAG

氧电极；DO4050epanel瑞士BioengineeringAG

3.3实验方法

3.3.1初糖含量对柠檬酸发酵的影响

（1）初糖浓度对菌体生长的影响

在无菌状态下，分别调整发酵液初始糖浓度为10%、14%、18%、20%，24%，在玉米液化清液中添加17%玉米液化全液，0.3%（NH4）2SO4，pH4.5，按10%的接种量接种发育成熟的种子液（250mL装液量50mL），35±1℃，300r/min进行柠檬酸发酵，发酵开始后，每隔6h分别从各个不同初糖浓度的发酵液中吸取1ml，进行菌丝体净重测量，记录净重变化。

（2）初糖浓度对柠檬酸产酸的影响

在无菌状态下，分别调整发酵液初始糖浓度为10%、14%、18%、20%，24%，在玉米液化清液中添加17%玉米液化全液，0.3%（NH4）2SO4，pH4.5，按10%的接种量接种发育成熟的种子液（250mL装液量50mL），35±1℃，300r/min进行柠檬酸发酵，发酵72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。

3.3.2氮源含量对柠檬酸发酵的影响

（1）有机氮源的需求量

在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度18%，在玉米液化清液中分别添加12%，17%，23%的玉米液化全液，0.3%（NH4）2SO4，pH4.5，按10%的接种量接种发育成熟的种子液（250mL装液量50mL），35±1℃，300r/min进行柠檬酸发酵，发酵72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。

（2）（NH4）2SO4添加量对柠檬酸产量的影响

在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度18%，在玉米液化清液中添加17%的玉米液化全液，再分别添加0.1%，0.2%，0.3%，0.4%（NH4）2SO4，pH4.5，按10%的接种量接种发育成熟的种子液（250mL装液量50mL），35±1℃，300r/min进行柠檬酸发酵，发酵72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。

3.3.2氮源含量对柠檬酸发酵的影响

（1）有机氮源的需求量

在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度18%，在玉米液化清液中分别添加12%，17%，23%的玉米液化全液，0.3%（NH4）2SO4，pH4.5，按10%的接种量接种发育成熟的种子液（250mL装液量50mL），35±1℃，300r/min进行柠檬酸发酵，发酵72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。

（2）（NH4）2SO4添加量对柠檬酸产量的影响

在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度18%，在玉米液化清液中添加17%的玉米液化全液，再分别添加0.1%，0.2%，0.3%，0.4%（NH4）2SO4，pH4.5，按10%的接种量接种发育成熟的种子液（250mL装液量50mL），35±1℃，300r/min进行柠檬酸发酵，发酵72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。

3.3.3温度对柠檬酸发酵的影响

在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度18%，在玉米液化清液中添加17%的玉米液化全液，0.3%（NH4）2SO4，pH4.5，按10%的接种量接种发育成熟的种子液（250mL装液量50mL），分别在30℃，33℃，36℃，39℃，42℃温度下，300r/min进行柠檬酸发酵，发酵72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。

3.3.4接种量对柠檬酸发酵的影响

在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度18%，在玉米液化清液中添加17%的玉米液化全液，0.3%（NH4）2SO4，pH4.5，分别按6%，8%，10%，12%，14%的接种量接种发育成熟的种子液（250mL装液量50mL），35±1℃，300r/min进行柠檬酸发酵，发酵72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。

3.3.5通风量对柠檬酸发酵的影响

采用10L全自动通风机械搅拌发酵罐，玉米粉液化清液添加17%玉米粉液化全液，定容到8L，添加0.3%的（NH4）2SO4，调节初始pH4.5，转速250～300r/min，。

通风量12h前：

0.12VVM；12h-72h：

0.15VVM，35±1℃，培养72h。

从发酵16h开始每隔6h取样，测定发酵液中柠檬酸积累量、还原糖消耗量和pH值的变化情况。

3.4测定方法

1.柠檬酸测定方法：

（粗测法）采用0.1429mol/L氢氧化钠溶液滴定。

2.还原糖测定：

发酵液稀释后，由斐林试剂直接测定。

3.总糖测定：

发酵液经酸水解后，由斐林试剂测糖法测定。

4.氮含量测定：

凯氏定氮法。

5.pH值测定：

酸度计测定或者是精密pH试纸测定。

6.菌丝球大小测定：

测微计测定。

7.孢子计数：

血球计数板计数法测定

8.菌丝球干重的测定：

取出一定量的发酵液，离心机中3000r/min，离心30min，

用蒸馏水洗两遍后，倒掉清液，在烘箱中烘干后称重，记为菌丝净重。

9.pH值测定：

酸度计测定或者是精密pH试纸测定。

10.菌丝球大小测定：

测微计测定。

11.孢子计数：

血球计数板计数法测定

12.菌丝球数量测定：

吸取1mL生长成熟的种子培养基，进行一定倍数的稀释，

在显微镜下进行直接计数

13.糖酸转化率计算公式如下:

糖酸转化率（%）=

式中C——最终柠檬酸酸度（g/100mL）；

A——发酵液起糖浓度（g/100mL）；

B——发酵结束糖浓度（g/100mL）；

14.产酸速率计算公式如下：

产酸速率（g/100ml

h）=

式中

——发酵最高酸度（g/100mL）；

——发酵起始酸度（g/100mL）；

T——总发酵时间（h）。

3.5结果与讨论

3.5.1培养基成分对柠檬酸产量的影响

在柠檬酸发酵过程中，发酵初期黑曲霉会利用培养基中的营养成分，利用碳源提供能量，利用氮源提供自身生长发育所需要的蛋白质和核酸等等。

如果提供的营养成分不够就会影响黑曲霉的菌体生长和发育。

在发酵后期，为了使黑曲霉能有效的积累柠檬酸，必须为菌体提供限量的营养因子。

同时发酵液中的金属离子和各种产酸刺激物和抑制物都会对菌体生长和代谢柠檬酸有较大的影响。

3.5.1.1初糖含量对柠檬酸产量的影响

（1）初糖含量对菌体浓度的影响

不同初糖浓度的发酵培养基对黑曲霉菌丝球的生长发育有不同的影响。

黑曲霉菌丝球接种到发酵培养基后还要继续生长，经过一段时间的生长发育，菌丝球的净重会达到一个饱和值，然后才开始发酵产酸。

将黑曲霉菌丝球接种到不同糖浓度的发酵培养基中，跟踪菌体净重变化，了解不同初糖浓度的发酵培养基对菌丝球生长的影响，结果见图3.1。

从图3.1可以看出，黑曲霉Wsy-03菌丝球在接种到发酵培养基中以后，菌丝球还会继续生长，经过一段时间会达到一个菌丝球浓度饱和值，这个饱和值在初糖浓度18%以下的发酵培养基中都相同，不同在于达到这个饱和值所要用的时间。

从图3.1中可以看出，随着发酵液初糖浓度的提高，黑曲霉Wsy-03菌丝球净重达到这个最大值所用的时间会越来越长，即较高的初糖浓度会对菌丝球生长产生抑制作用。

同时也证明，从菌丝球生长方面看来，控制12%的发酵初糖，有利于补料发酵。

（2）初糖对产酸的影响

发酵液初糖浓度的高低将直接影响黒曲霉菌体的生长与发育，影响柠檬酸产率和糖酸转化率。

从黑曲霉发酵柠檬酸过程分析，如果发酵液初始糖浓度过高，会对孢子的生长发育有抑制作用，同时由于发酵原料是玉米液化液，所以过高的糖浓度还会使发酵培养基浓度过高，严重影响发酵液溶氧，由于在种子生长初期，孢子发育耗氧量非常大，所以发酵液初始糖浓度过高会严重影响菌丝球成型。

但是，如果发酵液初始糖浓度太低，则菌丝球会长的很大，且形状不规则，生长不正常。

不同发酵初糖浓度对黑曲霉Wsy-03柠檬酸发酵的影响见表3.1。

从表3.1可以看出，黑曲霉Wsy-03在发酵液初糖浓度低于18%时，糖酸转化率一直保持在90%以上，且柠檬酸产量随发酵液糖浓度的增加而增加。

但是在初糖浓度高于18%时，如果继续提高发酵液初糖含量，明显可以看出柠檬酸产量开始降低，同时