气相色谱质谱气质联用GC-MS在代谢组学的应用.ppt

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GC-MS技术在代谢组学中的应用,主要内容,GC,MS,GC-MS技术的结构流程，原理，特点样品的采集与制备及数据处理GC-MS技术在代谢组学的应用,GC结构流程,载气系统,进样系统,色谱柱,检测系统,温控系统,GC的分离原理,气固色谱的分离机理:

吸附与脱附的不断重复过程；气液色谱的分离机理：

气液两相间的反复多次分配过程。

当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附;随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附;挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附;随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行。

MS结构流程,质谱分析原理,基本原理概述：

质谱分析是将样品转化为运动的带电气态离子碎片，于磁场中按质荷比（m/z）大小分离并记录的分析方法。

其过程为可简单描述为：

其中，z为电荷数，e为电子电荷，U为加速电压，m为碎片质量，V为电子运动速度。

GC-MS联用技术简介,自1957年J.C.Holmes和F.A.Morrell首先实现了GC-MS联用以来，该技术得到了迅速发展，至今气-质联用（GC/MS）已被广泛应用于复杂组分的分离与鉴定，其具有GC的高分辨率和质谱的高灵敏度，是生物样品中药物与代谢物定性定量的有效工具。

GC-MS的结构原理,GC-MS主要由气相色谱仪-接口-质谱仪组成。

GC-MS联用的关键部件是接口。

GC-MS联用的主要困难是两者工作压力的差异。

气相色谱的柱出口压力一般为大气压（约1.01x105Pa），而质谱仪是在高真空下（一般低于10-3Pa）工作的。

所以必须通过一个接口使两者压力基本匹配，才能实现联用。

GC-MS联用技术的特点,GC-MS的主要优点是：

集色谱法的高分离能力和质谱法的结构鉴定能力于一体，灵敏度高，可检测到大量低含量的小分子代谢产物。

与CE-MS、LC-MS或LC-NMR等分析仪器相比，GC-MS仪器的购置价格较低，在色谱分析重复性、分辨率和电子轰击电离源得到的质谱碎片重复性方面具有明显的优势，且受基体效应影响较小。

GC-MS的主要不足是样品中难挥发或极性较大的代谢产物需经过衍生化后才能进行分析。

GC-MS联用分析的特点,1.适合于多组分混合物中未知组分的定性分析；2.可以判断化合物的分子结构；3.可利用选择离子检测技术收集更多的信息量（即质谱仪只对少数几个特征质量的峰自动进行反复扫描记录），从而提高色谱-质谱检测的灵敏度；4.可以鉴别出部分分离甚至未分离的色谱峰；5.可用计算机对复杂多组分样品的大量质谱数据进行收集、储存、处理和解释。

常规的气相色谱分析方法存在的缺陷,目前大多数气相色谱仪器为一维气相色谱，使用一根色谱柱，适合含几十至几百个物质的样品分析。

但是对于代谢产物这样复杂体系的分离分析，使用常规的色谱分析方法，仅仅靠提高柱效或提高柱选择性都难以得到满意的分析结果。

传统多维色谱（GC-GC）依然存在不足,例如中心切割式二维色谱虽然拓展了一维色谱的分离能力但是这种以中心切割为基础的二维色谱仅仅是将第一根色谱柱流出的一段或几段感兴趣的馏分送入第二根柱进一步分离，而无法进行全面分析。

全二维气相色谱-飞行时间质谱联用技术,全二维气相色谱,全二维气相色谱是20世纪90年代发展起来的具有高分辨率、高灵敏度、高峰容量等优势的多维色谱分离技术，也是迄今为止能够提供最高分辨率的分离技术。

1991年，Phillips和Liu用他们以前在快速色谱中使用的在线热调制器发展出了一种新的二维气相色谱系统。

由于采用这个系统全部的样品均被分析，而不是仅仅是被中心切割的馏分，因此这个系统被称命名为全二维气相色谱，以区别传统的二维色谱。

全二维气相色谱原理,柱1和柱2分离机制不同且相互独立并以串联的方式结合。

这个技术的关键是柱1跟柱2交接处的调制器，它对从第一根柱后流出的样品起捕集、聚焦、再传送的作用，可被当作第二根柱的进样器。

经第一根色谱柱分离后的每一个色谱峰，都经调制器调制后再以脉冲方式送到第二根色谱柱进一步分离。

通常第一根色谱柱使用非极性的常规高效毛细管色谱柱，采用较慢的程序升温速率（一般为15/min）。

调制器将第一维柱后流出的组分切割成连续的小切片，这些小切片的宽度一般不超过第一维色谱峰宽的1/4。

每个切片再经重新聚焦后进入第二根色谱柱分离。

第二根色谱柱通常使用对极性或构型有选择性的细内径短柱，组分在第二维的保留时间非常短，一般在110s，因此该分离液可近似看作恒温分离。

全二维气相色谱谱图的生成,分为调制、转换和可视化三个步骤。

可视化是通过颜色、阴影或等高线的方式在二维平面上呈现出来的，有时也用三维图形描述。

X-第一维柱保留时间，Y-第二维柱保留时间，Z-色谱峰强度。

全二维气相色谱的特点,与1DGC和GC-GC相比，全二维气相色谱的主要优点如下：

可以提高更多的峰容量；由于调制器的再聚焦作用，组分分离和检测灵敏度都得到提高；采用适当的色谱操作条件，可以得到包含结构信息的二维结构谱图。

结构谱图可以用于族组成定性，或对未知组分提供辅助定性信息。

全二维气相色谱对检测器的要求,GCxGC的第二维分离速度非常快（组分应该在调制周期内完成第二维的分离，否则，前一脉冲的迟流出组分可能会与后一脉冲的前面组分交叉或重叠。

），而且由于第二维近似恒温操作，对于给定的色谱条件来说第二维的峰宽取决于保留时间。

对于峰宽很窄的色谱峰检测就需要快速检测器。

快速检测器需要较小的内部体积、较短的响应时间和足够高的数据采集频率才能确保二维谱图的准确构建。

飞行时间质谱（TOFMS）因其具有非常高的采集速度（最高采集频率达500次全扫描/s），是目前唯一可以与GCxGC很好匹配的质谱技术。

飞行时间质谱计（TimeOfFlight,TOFMS）,原理用一个脉冲将离子源中的离子瞬间引出，经加速电压加速，它们具有相同的动能而进入漂移管，质荷比最小的离子具有最快的速度因而首先到达检测器，质荷比最大的离子则最后到达检测器。

MALDI-TOF（基质辅助激光解析电离-TOF）工作原理图,飞行时间质谱计的特点,特别适合于生物大分子的质谱测定。

不同质荷比的离子同时检测，因而飞行时间质谱计的灵敏度高，适合于作串联质谱的第二级，例如MALDI-TOFTOF。

扫描速度快，适于研究极快的过程。

结构简单，便于维护。

基于GC-MS,GC*GC-TOFMS的代谢组学技术平台,样品的采集与制备,1.实验设计中对样品收集的时间，部位，种类样本群体等应给予充足的考虑。

2.分析过程中要有严格的质量控制，需要考虑如样本的重复性，分析精度，空白等3.处理生物样本时要特别注意避免由于残留酶活性或氧化还原过程降解代谢物，产生新的代谢物。

4.通常需对所收集的样品进行快速猝灭，如液氮冷冻，酸处理等。

GC-MS分析技术中代谢物的分类,1.不需要化学衍生的挥发性代谢物采样方法：

直接收集和分析顶空样品，用固体吸附剂富集顶空或液体样品中的代谢产物，固相微萃取和溶剂萃取2.需要化学衍生的非挥发性代谢物如血液，尿液中的氨基酸，脂肪酸，胺类，糖类，甾体类物质

（1）.样品干燥,损失挥发性的代谢物;

（2）.通过两步化学反应赋予代谢物挥发性和热稳定性.具体过程包括与O-烷基羟基胺生成,再与N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺反应,将极性官能团的活泼氢用非极性的三甲基硅烷基取代,增加挥发性常用的衍生化试剂：

硅烷化试剂，烷基化试剂，酰基化试剂，缩合反应试剂和手性衍生化试剂,数据采集,1.高效毛细管气相色谱柱,对复杂生物样品而言,不能提供足够分辨率.2.被分离出来的组分可由EI（最普遍采用）或CI（质谱碎片最少）质谱检测.区别:

四级杆质谱SIM方式可增强检测灵敏度,但仅适合已知的代谢物;GC-TOFMS可以检测到的挥发性化合物要多得多.因此常可以检测到特殊的或不常见的代谢物.3.GC*GC-TOFMS用于代谢物组成常用的柱系统与分析其他复杂混合物相似,通常第一维采用非极性或弱极性的色谱柱,第二维采用中等极性的色谱柱.,酵母细胞内代谢物的GC*GC-TOFMS等高线图,基于GC-MS，GC*GC-TOFMS技术的代谢组学数据处理,数据预处理方法1.滤噪和峰检测2.重叠峰解析重叠峰解析的原理：

假定纯物质的质谱在整个出峰过程是不变的，可以用某单个质量数谱图来描述化合物的峰型美国Leco公司的ChromsTofTM,NIST免费的AMIDS软件包3.峰对齐、匹配使相同的代谢物在同一矩阵中由同一个变量表示，使各样品数据得到正确的比较4.归一化目的是消除分析过程中的系统偏差同时保留分析数据中有意义的生物学差异,代谢差异研究的GC*GC-TOFMS数据处理方法,1.平行因子算法（PARAFAC）2.主成分分析法（PCA）3.Fisher准则:

适合具有生物多样性的样本分析4.DotMap算法:

目标化合物必须是已知的,代谢物的结构鉴定,基于GC-MS,GC*GC-TOFMS技术得到的代谢物可通过与标准品的保留时间或保留指数对照、质谱解释或使用保留指数/质谱数据库等多种方法进行识别和确认,代谢组学应用,1.GC-MS在代谢组学研究中的应用2.全二维气象色谱在代谢研究中的应用,GC-MS在代谢组学中的应用,全二维气象色谱在代谢组学研究中的应用,WernerWelthagen和OliverFiehn等最先将全二维气相色谱/飞行时间质谱方法应用与代谢组学的研究。

为了证实该技术用于代谢组学研究的可行性，他们以哺乳动物生物学研究为例，分析了小鼠脾组织提取物的复杂代谢产物轮廓。

全二维气象色谱在代谢组学研究中的应用,GC-TOFMS和GC*GC-TOFMS测得的峰的数目和质量,研究证实了GC*GC-TOFMS得到的代谢轮廓可以用于生物标记物的检测。

研究小组又对GC*GC-TOFMS用于代谢组学研究寻找生物标记物的数据统计去做了讨论。

研究结果表明后俩种方法在用与生物标记物的识别中有相似的结果,用于研究氨基酸和有机酸三甲基硅烷化衍生物的GC*GC-TOFMS方法,此外，J.l.Hope等建立了用于研究氨基酸和有机酸三甲基硅烷化衍生物的GC*GC-TOFMS方法。

为了证实该方法用于实际样品的有用性，他们将所建立得方法用于普遍草坪草提取物中的代谢物研究，试图揭示收割前后其生理变化。

1#样品是将草收割后立即冷冻，2#样品为收割后再放置1h再提取。

下图给出了俩个样品提取物谱图差异最明显的地方。

GC*GC-TOFMS方法用于研究氨基酸和有机酸三甲基硅烷化衍生物,发展与展望,上述研究结果表明GC*GC-TOFMS可以用于代谢组学研究，尽管这方面得工作还刚刚起步，但随着该技术的不断成熟和代谢组学研究的不断深入，GC*GC-TOFMS技术将被越来越多地用于代谢产物的全面快速分析研究，包括目标化合物研究，特定化合物的寻找，代谢指纹等，可以预计，GC*GC-TOFMS将在代谢组学研究方面发挥更大得作用,谢谢大家,