农业试验测定方法大全.docx

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农业试验测定方法大全

淀粉酶的定测

称取鲜样0.2克，加1%NaCl8毫升研磨（低温），放置15分钟，不时摇动。

3000rpm离心10分钟。

（1）取1ml酶液，加1％淀粉1ml

（2）空白：

取1ml酶液，100度水浴10min，加1％淀粉1ml，混匀，40度水浴5min（准确）,取出，将各试管各加入DNS　2ml，煮沸5min，冷却，定容至25ml，然后在520nm下比色。

注：

淀粉临时配制。

1％淀粉：

1g溶于100ml水中。

DNS试剂：

精确称取3、5－二硝基水杨酸1g溶于20ml1mol/lNaOH中，加50ml蒸馏水中，再加入30g酒石酸钾钠，溶解后盖紧瓶塞，勿使CO2进入。

麦芽糖标液称取麦芽糖0.1000g溶于少量蒸馏水中，定容至ml即为1mg/ml的麦芽糖标液。

标准曲线的制作：

取25ml具塞刻度试管7支，按下表加入各种试剂混匀，在沸水浴中加热5分钟，取出，冷却后加蒸馏水至25ml刻度，摇匀，在520nm下比色，绘出标准曲线。

管号麦芽糖含量（ml）麦芽糖标液（ml）蒸馏水（ml）DNS试剂（ml）

0

1

2

3

4

5

60

0.2

0.6

1.0

1.4

1.8

2.00

0.2

0.6

1.0

1.4

1.8

2.02.5

2.3

1.9

1.5

1.1

0.7

0.52.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

硝酸还原酶的测定

试剂：

1、亚硝酸钠标准液：

称取分析纯NaNO20.1000g水溶后定容至100毫升，吸取5毫升用水稀释定容至1000毫升。

2、0.1mol/lpH7.5的磷酸缓冲液K2HPO419.24g，KH2PO42.2g，加水溶解后定容至1000毫升。

3、1%对氨基苯磺酸溶液：

称取1.0g加入25毫升浓盐酸中，用蒸馏水定容至100毫升。

4、0.2%α—萘胺溶液：

称取0.2gα—萘胺溶于25毫升冰醋酸中，用蒸馏水定容至100毫升。

5、30%三氯乙酸溶液：

75.0g三氯乙酸，水溶后定容至250毫升。

6、KNO3•异丙醇•磷酸缓冲液混合液：

称3.03gKNO3溶于300毫升0.1mol/l的磷酸缓冲液中，再加3毫升异丙醇混匀。

方法

1、标准曲线的制作：

取7支干洁的15毫升刻度试管按下表顺序加试剂，摇匀后在30度保温箱或恒温水浴中保温30分钟，然后在540nm波长下比色。

1234567备注

亚硝酸钠标准液00.20.40.81.21.62.0

蒸馏水2.01.81.61.20.80.40.0摇匀

1%对氨基苯磺酸4444444摇匀

0.2%α—萘胺溶液4444444摇匀

每管含亚硝酸态氮（μg）00.20.10.81.21.32.0

2、酶反应和酶活性测定：

①取样：

将材料洗净，用蒸馏水冲洗，滤纸吸干，剪成0.5-1.0平方厘米的小块，混匀后每个样品称0.5-1.0克3份，放入试管并编号。

②反应：

向各试管中加入KNO3•异丙醇•磷酸缓冲液混合液9毫升，其中一管立即加1毫升30%三氯乙酸溶液，混匀（作对照）。

然后将所有试管置真空干燥器中接真空泵抽气，反复几次直至叶片沉在管底。

将各试管置30度下于黑暗中保温30分钟，分别向处理管加1毫升30%三氯乙酸溶液，摇匀终止酶活性。

③：

比色：

将各试管静止2分钟吸取上清液2毫升加入另一组试管，分别加入1%对氨基苯磺酸溶液4毫升和0.2%α—萘胺溶液4毫升，摇匀显色30分钟，以对照为空白，在540nm波长比色，并计算酶活性。

酶活性（Nμg•g-1FW•h-1）=标准曲线查得值（μg）*分取倍数/样重（g）/时间（h）

硝酸还原酶活力的测定（活体法）

[试剂]

亚硝酸钠标准液称取分析纯NaNO20.1000g水容后定容至100ml,吸取5ml用水稀释至1000ml,即为每ml含NaNO25µg（亚硝态氮近似1µg/ml）的标准液.

0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液：

K2HPO419.24g,KH2PO42.2g,加水溶解定容至1000ml..

1%（w/v）对-氨基苯磺酸溶液：

称取1.01g加入25ml浓HCL中,用蒸馏水定容至100ml.

0.2%（w/v）a-萘胺溶液：

称取0.2ga-萘胺溶于25ml冰醋酸中,用蒸馏水定容至100ml.

30%三氯乙酸溶液：

30.0g三氯乙酸,水溶后定容至100ml.

KNO3（0.1mol/L）、（1%v/v）、磷酸缓冲液（0.1mol/L）混合液；称取3.03gKNO3溶于300ml0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加3ml异丙醇混匀。

[方法]

1．标准曲线制作取7支洁净烘干的试管按下表顺序加试剂，即配成0-2.0ug的系列标准亚硝态氮溶液。

摇匀后在30保温箱或恒温水浴中保温30min，然后，在540nm波长下比色。

以亚硝态氮（µg）为横坐标，光密度值为纵坐标绘标准曲线或建立回归方程。

试剂（ml）1234567

亚硝酸钠标液

蒸馏水

1%对-氨基苯磺酸

0.2%a-萘胺

每管含亚硝态氮（µg）0

2.0

4

4

00.2

1.8

4

4

0.20.4

1.6

4

4

0.40.8

1.2

4

4

0.81.2

0.8

4

4

1.21.6

0.4

4

4

1.62.0

0.0

4

4

2.0

2．酶反应和酶活性测定

（1）取样称取0.5000g烟叶（剪成0.5-1.0cm的小块），混匀后放入试管，重复2次。

（2）反应向各试管加入KNO3-异丙醇-磷酸缓冲液混合液9ml,其中一管立即加入1.0ml三氯乙酸,混匀（做对照）.然后将所有的试管置于30°C下于黑暗处保温30min,分别向各处理管中加1.0ml三氯乙酸,摇匀终止酶活性.

（3）比色将各试管静止2min,吸取上清液2ml加入另一组试管,以对照管做参比,按标准曲线做法进行显色测定,并计算酶活性.

转化酶的测定

转化酶又称蔗糖酶，是一种水解酶，植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶，它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆的水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用、植物细胞代谢及生长强度的指标。

试剂：

1、10%蔗糖溶液

2、葡萄糖标准液（500μg/ml）

3、0.05mol/l的磷酸缓冲液

4、（DNS）3，5二硝基水杨酸：

将6.3g二硝基水杨酸和262ml2mol/lNaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。

方法：

1、酶的提取：

1g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml，在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。

2、酶活性的测定：

吸酶液2ml，放入试管中，再加入pH6.0的缓冲液5ml及10%蔗糖溶液1ml，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即按3，5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。

以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照。

3、还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定

①标准曲线：

取6支20ml刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标准液：

管号123456

葡萄糖原液量（ml）00.40.81.21.62.0

加蒸馏水量（ml）2.01.61.20.80.40

葡萄糖浓度（μg/ml）0100200300400500

在上述各管中分别加入1.5ml3，5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml，混匀，以1号管为空白，测540nm波长下的OD值。

以OD值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

②酶反应液中还原糖的含量的测定：

吸取2ml反应液，加入1.5ml3，5二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml，测定540nm波长下的OD值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。

4、结果计算：

A=（N-N’）*V/（T*W*1000）

A：

转化酶的活性（mg/gfw/h）N：

酶反应液中还原糖的浓度（μg/ml）

N’：

钝化酶反应液中还原糖的浓度（μg/ml）V：

酶反应液的总体积

T：

反应时间W：

材料鲜重

多酚氧化酶的测定

试剂：

1、0.02mol/l焦儿茶酚溶液：

称0.22克焦儿茶酚溶于100毫升蒸馏水中，现用现配。

2、0.1mol/l碘酸钾：

0.3567克碘酸钾溶于蒸馏水，定容至100毫升。

3、0.005mol/l碘液：

碘化钾2.5克溶于200毫升蒸馏水中，加冰醋酸1毫升，再加0.1mol/l碘酸钾12.5毫升，最后加蒸馏水定容至250毫升。

4、pH6.0磷酸缓冲液：

87.7毫升A+12.3毫升B，用蒸馏水稀释至200毫升。

贮备液A：

0.2mol/l磷酸二氢钠（27.6gNaH2PO4•H2O用蒸馏水配成1000ml）。

贮备液B：

0.2mol/l磷酸氢二钠（53.65gNa2HPO4•7H2O或71.7gNa2HPO4•12H2O用蒸馏水配成1000毫升）

5、其它：

1%淀粉；10%偏磷酸；0.1%抗坏血酸（现用现配）

方法：

1、粗酶提取：

称取新鲜样品2克，剪碎，置于研钵中，加入少量pH6.0磷酸缓冲液和少许石英砂，于冰浴中迅速研磨至匀浆，将全部材料用缓冲液冲洗入50毫升容量瓶中，并定容至刻度。

在18~20度下每隔3分钟摇动1次，共5次，然后再静置15~20分钟，其上清液即为粗酶提取液（可倾入干洁的三角瓶中备用）。

2、活性测定：

取干洁50毫升三角瓶6只（编号），按照下表向各瓶中加入pH6.0磷酸缓冲液、0.1%抗坏血酸、0.02mol/l焦儿茶酚，并向③号瓶及⑥号瓶各加10%偏磷酸。

然后将三角瓶置于18~20度水浴或放在室温下使内外温度达到平衡之后，每隔1分钟向各瓶中依次加入酶液2毫升，全部加完后保温3分钟，再按原顺序仍然间隔1分钟向①、②、④、⑤号各瓶加入偏磷酸1毫升（注意：

加完2号瓶后应间隔2分钟再加4号瓶），用于终止酶的活性。

最后向各瓶中加入1%淀粉溶液3滴作为指示剂，摇匀后用微量滴定管以0.005mol/l碘液滴定，当溶液呈现淡蓝色为止，记录碘液消耗量。

3、结果计算：

A多酚=0.44{[⑥-（④+⑤）/2]-[③-（①+②）/2]}*V1/V2/W/t

V1：

提取时酶液总量（毫升）V2：

测定时酶液用量（毫升）

①、②、③、④、⑤、⑥：

测定时消耗碘液量（毫升）t：

酶反应时间（分）

磷酸缓冲液抗坏血酸焦儿茶酚酶液偏磷酸备注

1422测坏血酸氧化酶

2422同上

34221空白测定

44212测多酚氧化酶

54212同上

642121空白测定

淀粉的测定方法-----------蒽酮法

一．原理

用乙醇将烟叶中可溶性糖浸出并分离出去，而后烟叶中淀粉用适量Hcl，因淀粉在稀酸作用下被水解成葡萄糖，再按葡萄糖测定进行。

根据葡萄糖的含量从而算出淀粉含量。

二．仪器设备

三角瓶-50ml容量瓶-100ml移液管10ml、1ml漏斗圆底烧瓶1000ml离心管和离心机水浴锅温度计烘箱滤纸天平分光光度计

三．试剂

盐酸乙醇氢氧化钠蒽酮

四试剂的配制和标准曲线的绘制

1.葡萄糖标准液的配制称取无水葡萄糖（AR级）0.1g溶于蒸馏水中，定容至100毫升，用前取此液10毫升，再用水稀释至100毫升。

2..标准曲线的绘制取6支干洁刻度试管，依次移入葡萄糖标准液（100μg/ml）0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00ml后，再从1至4试管依次补加1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0ml蒸馏水后，再分别加入蒽酮试剂5毫升，于沸水中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色，记录OD值，以吸光值为纵坐标，糖含量为横坐标，绘出标准曲线

3.80%乙醇的配制取400毫升乙醇加水定容至500ml

4.1当量的盐酸配制43毫升浓盐酸加水定容至500ml

5.10%氢氧化钠配制10g氢氧化钠溶于100ml水中

6.蒽酮试剂：

1克蒽酮溶于72%的H2SO41000ml（98%的H2SO4+240的蒸馏水），棕色瓶冰箱保存2~3周。

五实验步骤

1.分离出水溶性糖

0.1g样置于离心管中加入8毫升80%乙醇80℃水浴浸提30分钟冷却后离心5分钟残渣再加入8ml80%乙醇。

重复三次

2.水解

残渣用1当量的盐酸15ml洗入50ml三角瓶，摇匀后烘箱105度加热3.5小时，冷却后加10%氢氧化钠6ml中和，蒸馏水定容100ml，过滤

3.测定

取滤液1ml（空白用1ml蒸馏水代替），加入蒽酮试剂5ml，摇匀，于沸水浴中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色

六结果的计算与表述

C=AN*0.9/W

C—样品淀粉含量（μg/g）

W—样品重量（g）

A—标准曲线查得的糖量（μg）

N—样品提取液占样品反应液的倍数

酸解法测定淀粉

方法11.将除去可溶性糖的残渣用80%乙醇洗入50ml三角瓶（3次重复），水浴或100~105度烘箱加热2~3小时，10%NaOH中和至微碱性（1滴甲基红指示剂，变黄），转入100ml容量瓶，慢慢加入5%ZnSO4和0.15mol*l-1Ba（OH）25ml至产生白色沉淀，加水到刻度，混匀过滤，滤液备用。

2.测定：

吸取滤液6ml，加斐林试剂4ml混匀加塞，于沸水浴中加热15分钟，取出后流水冷却，再经1500转离心5分钟，收集上清液，在590nm波长处比色。

3.标准曲线的绘制：

取干洁试管7支，依次加入葡萄糖标准液（100μg/ml）0、1、2、3、4、5、6ml和蒸馏水6、5、4、3、2、1、0ml，加斐林试剂4ml混匀加塞，于沸水浴中加热15分钟，取出后流水冷却，再经1500转离心5分钟，收集上清液，在590nm波长处比色。

斐林试剂:

A液—（CuSO4*5H2O）40克后蒸馏水定容1000ml,B液—酒石酸钾钠（KNaC4O6*4H2O）200克与NaOH150克后蒸馏水定容1000ml；最后将A液B液等体积混匀。

葡萄糖标准液：

80度烘干葡萄糖0.1000克蒸馏水定容100ml，浓度为1mg*ml-1。

滴甲基红指示剂：

0.2克溶于少量酒精后蒸馏水定容100ml

方法2.1.1.将除去可溶性糖的残渣用1当量HCl15ml洗入150ml三角瓶（3次重复），摇匀后100~105度烘箱加热2~3小时，冷却蒸馏水定容100ml过滤加10%NaOH6ml中和

2.测定：

取滤液1ml（空白中用1毫升蒸馏水代替）加入蒽酮试剂5毫升，摇匀，于沸水浴中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色。

1当量HCl：

43mlHCl蒸馏水定容500ml

3、标准曲线的绘制：

取干洁试管6支，依次加入葡萄糖标准液（100μg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml和蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml，再分别加入蒽酮试剂5毫升，于沸水浴中加热10分钟，冷却后在620nm波长处比色，记录OD值，绘出标准曲线。

4、计算：

C=AN*0.9/W

C—样品总糖含量（μg/g）W—样品重量（g）

A—标准曲线查得的糖量（μg）N—样品提取液占样品反应液的倍数

推荐干重0.5~1克鲜重1~2克或参考参考书

氯化三苯基四氮唑（TTC，桶栽）根系活力

试剂：

1、乙酸乙酯

2、低亚硫酸钠（Na2S2O4，俗称保险粉）

3、1%TTC溶液：

准确称取TTC1.0克，溶于少量蒸馏水中，定容至100毫升

4、0.4%TTC溶液：

准确称取TTC0.4克，溶于少量蒸馏水中，定容至100毫升

5、1/15mol/lpH7.0磷酸缓冲液

6、1mol/l硫酸：

用量筒量取比重1.84的浓硫酸55毫升，边搅拌边加入盛有500毫升的蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000毫升

7、0.4mol/l琥珀酸钠：

称取琥珀酸钠（含6个结晶水）10.81克，溶于蒸馏水中，定容至100毫升

方法：

1、TTC标准曲线的制作：

吸取0.25ml0.4%TTC溶液放入10毫升刻度试管中，加少许低亚硫酸钠粉末，摇匀后立即产生红色的TTF，再用乙酸乙酯定容至10毫升，摇匀，然后分别取此液0.25ml、0.5ml、1.00ml、1.5ml、2.0ml置于10毫升刻度试管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比在485nm波长处测定光密度，绘制标准曲线。

2、称取根样品0.5克，放入试管中，（空白先加1mol/l硫酸2毫升再加入根样品），加入0.4%TTC溶液和1/15mol/lpH7.0磷酸缓冲液各5毫升，把根充分浸没在溶液中，在37度下暗处保温1个小时，此后加入1mol/l硫酸2毫升，以终止反应。

3、把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3~4毫升和少量石英砂一起磨碎，以提出TTF。

把红色提出液移入试管，用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二至三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10毫升，用分光光度计在485nm下比色，以空白作参比读出光密度，查标准曲线，求出四氮唑还原量。

4、计算：

四氮唑还原强度=四氮唑还原量（μg）/根重（g）/时间（h）

丙二醛的测定（MDA）

试剂：

0.5%硫代巴比妥酸：

称取硫代巴比妥酸0.5g溶于5%三氯乙酸溶液，并用其定容至100毫升。

方法：

1、样品制备：

称叶片0.3g于研钵中，加入少量石英砂和蒸馏水2毫升，研磨成匀浆。

将匀浆转移到试管中，再用蒸馏水3毫升分两次冲洗研钵，合并提取液。

2、显色反应：

在提取液中加入0.5%硫代巴比妥酸5毫升，摇匀，将试管放入沸水浴中煮沸10分钟，（自试管内溶液中出现小气泡时开始计时），到时间立即取出试管并冷却。

3、比色测定：

待试管内溶液冷却后，在3000转离心15分钟，取上清液并量其体积。

以0.5%硫代巴比妥酸为空白测定534nm和600nm处的吸光值。

4、结果计算：

C=（OD534-OD600）*V/0.155d/W

C：

丙二醛含量（μmol/g）d：

比色杯光径

W：

样品重量V：

上清液总体积

0.155：

丙二醛的μmol吸光系数

丙二醛的测定方法

1．取叶0.5000g加少量（2mg）10%的TCA研磨匀浆，转入离心管，并用TCA6mg清洗研钵（TCA共用8mg），然后摇匀，离心10min（3000rpm）,取上清液待测.

2．显色反应:

取上清液3ml+TBA3ml（对照管TCA3ml+TBA3ml）,分别置于试管中，用塑料膜封口,沸水浴20min显色,冷却.

3．比色:

分别在A532和A600处比色.

4．计算:

MDA（nmd•g-1•FW）=[（A532-A600）*L*V/v]/1.55*10-1*W

=（A532-A600）/W*103.226

式中:

L为反应液总量（ml）

V为提取液总量（ml）

v为测定时提取液用量（ml）

TCA（三氯乙酸）:

称25.000g三氯乙酸溶解,定容至250ml.

TBA:

称0.6000g硫代巴比妥酸,用10%的TCA定容至100ml.

游离脯氨酸的测定

1．称取0.5000g剪碎烟叶加入试管，加5ml3%磺基水杨酸，封口，沸水浴10min；过滤后备用。

2．吸取2ml提取液加入试管（对照管用2ml水代替），各加入2ml冰醋酸，4ml茚三酮，摇匀，煮沸30min，冷却比色（OD520）

试剂配制：

1．3%磺基水杨酸：

称3.000g磺基水杨酸溶解，定容至100ml。

2．茚三酮：

称2.50g茚三酮，加60ml冰醋酸和40ml6M磷酸，在热水（70°C）溶解，一般现用现配（24小时）

6M磷酸：

吸取86ml磷酸，定容至250ml.

计算：

脯氨酸（µg•g-1•FW）=（C*V/a）/W*100

=C*250/W

C:

浓度a:

2ml

V：

5mlW：

0.5000g

标准曲线：

称取10mg脯氨酸容于少量乙醇中，用蒸馏水定容至100ml，成10µg•ml-1的母液.

取母液0.0、0.5、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0ml分别放入7个25ml容量瓶中，再分别加入蒸馏水定容，配制成0、2.0、5.0、10、20、30、40µg•ml-1的系列溶液。

分别取上述各溶液2ml，加入已编号7个试管中，再分别加入2ml冰醋酸，4ml酸性茚三酮试剂，摇匀后，在沸水浴中加热显色60min，冷却后于520nm处比色.

总酚类和类黄铜含量的测定

取0.5000g新鲜烟叶剪成1-2mm小块后,加5ml含1%HCL的甲醇溶液,提取24小时（4°C）,取0.5ml提取液，用蒸馏水稀释至25ml.在280nm、325nm处比色。

类黄铜含量以OD325/g鲜重表示，总酚含量以没食子酸标准曲线加以计算，即：

总酚含量（mg/g）=C*5*50/鲜重（g）

类黄铜含量（OD325/g鲜重）=OD325/鲜重（g）

试剂配制：

1．没食子酸标准曲线

原液（0.05mg/ml）：

称取0.00250g没食子酸，定容至500ml。

分取0.5、10、15、20、25ml原液定容至25ml作标准曲线。

2．1%HCL甲醇：

取13.5ml浓HCL+482.5ml甲醇配制成500ml）。

丙酮提取分光光度法测定色素

仪器：

分光光度计、50ml容量瓶、漏斗、滤纸、分析天平、移液管、乳钵

试剂：

80%丙酮（水20+丙酮（GR）80，v/v）

试验步骤：

待测液制备：

样品0.5—2g放入乳钵，加入适量80%丙酮，研磨至残渣变白，静置片刻，过滤于50ml容量瓶中，将残渣与滤纸反复冲洗（至滤纸变白），洗液过滤，定容至刻度

吸光度测定：

色素提取液倒入比色杯，分别于662、644、和440nm下比色，记录OD值

叶绿素a：

Ca（mg/l）=9.784OD662-0.990OD644

叶绿素b：

Cb（mg/l）=21.426OD644-4.650OD663

叶绿素：

Ct（mg/l）=Ca+Cb=5.134OD662+20.436OD644

类胡罗卜素Cc（mg/l）=4.695OD440-0.268（Ca+Cb）

色素含量（mg/l）=浓度（mg/l）*提取液总量（l）/样重（g）

叶绿素的测定方法

[方法]

称取0.1000g剪碎的新鲜的烟叶放入10ml的容量瓶中,用80%的丙酮定容至10ml.放在黑暗处浸提24小时.然后在663nm、646nm处比色。

[计算]

Ca=12.21*D663-2.81*D646

Cb=20.13*D646-5.03*D663

蒽酮比色法测总糖：

实验步骤：

1、可溶性糖的提取：

准确称取烟叶样品0.100克，置于离心管中，加入8毫升80%乙醇，于80℃水浴浸提30分钟，冷却后于4000转离心5分钟，收集上清液，残渣再加入8毫升80%乙醇，再次浸提，重复两次，将三次提取的上清液合并于100毫升容量瓶中并定容至100毫升。

2、总糖的