糖的滤纸层析实验报告doc.docx

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糖的滤纸层析实验报告doc

糖的滤纸层析实验报告

篇一：

纸层析法分离氨基酸实验报告

　　前言

　　纸层析法纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分离技术。

本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。

现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。

它是一种以纸为载体的色谱法。

固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。

将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。

当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。

将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。

根据组分移动距离（Rf值）与已知样比较，进行定性。

用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量（如光度法、比色法等）。

　　纸层析法（paperchromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。

纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。

　　在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。

但不如GC、HPLC应用普遍。

在

　　做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液（石油醚）混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。

由此观查出各种色素的相对含量和种类。

　　纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢；含量较多者色素带也较宽。

最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。

　　图1叶绿素的分离

　　氨基酸氨基酸是构成蛋白质的基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。

随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。

目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，而需求总量是800万吨。

我国自20世纪60年代起，氨基酸的应用在食品工业占61％，在饮料工业占30％，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。

　　氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用：

（1）在食品行业的应用

（2）在医药工业的应用

　　（3）在饲料添加剂行业的应用

　　（4）在化妆品行业的应用

　　（5）在农业上的应用

　　（6）在其他行业的应用

　　氨基酸工业还有着广阔的发展前景：

（1）传统的氨基酸生产方法

（2）运用基因工程手段生产氨基酸

　　（3）大力发展药用中间体,具体为：

　　①氨基酸及其衍生物逐渐成为药用中间体

　　②非天然氨基酸是合成活性药物的重要原料

　　③生产高附加值的非天然氨基酸

　　一、实验目的

（1）掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术（包括点样、平衡、展层、显色）。

（2）学习未知样品的氨基酸成分（水解、层析及鉴定）分析的方法。

　　二、实验原理

（1）纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。

滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。

当有机相流过固定相时，物质在两相间

不断分配而得到分离。

（2）溶质在滤纸上的移动速度用比移值Rf值表示。

　　（3）Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。

　　（4）在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。

Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

本实验利用纸层析法分离氨基酸。

材料与方法

　　三、实验装置与试剂

（1）氨基酸标准液（1mg/ml）

　　亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。

（2）80%甲醇

　　（3）0.1%茚三酮丙酮溶液

　　（4）氨基酸混合液（每种氨基酸500mg/mL）

　　（5）正丁醇

　　实验仪器

（1）新华滤纸×1

（2）培养皿×1

　　（3）电热鼓风干燥箱×1

　　（4）吹风机×1

　　（5）毛细管×4

　　（6）针、线、尺×1

　　（7）钟罩（高约430mm,直径约290mm，具磨口塞）×1

　　实验操作

（1）滤纸

　　选用国产新华1号滤纸，6cm×7cm。

在距滤纸2cm处划线，用

　　铅笔在线上标上四个点作为点样位子（留出缝线空间）。

（2）点样

　　点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清。

用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出。

点样的扩散直径控制在0.5cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用吹风机吹干，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，影响定量结果。

将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。

注意缝线处纸的两边不要接触。

避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。

　　（3）展层

　　将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内（注意滤纸不要碰皿壁），当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置。

　　酸溶剂系统：

　　正丁醇：

80%甲酸：

水=15:

3:

2（体积比），茚三酮2ml。

温度25℃，时间1h。

　　注意：

使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。

　　（4）显色

　　待展层基本结束后,置65℃鼓风箱中10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。

　　（5）Rf值的计算

篇二：

氨基酸的薄层层析实验报告

　　生物化学实验报告

　　姓名：

XXX

　　学号：

XXXXXX

　　专业年级：

临床八年制__

　　组别：

第二实验室

篇三：

生化实验报告实验5血红蛋白凝胶过滤

　　实验报告

　　课程名称：

生化实验B实验日期：

　　班级：

姓名学号：

　　血红蛋白凝胶过滤

　　一、背景及目的

　　血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。

存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。

人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。

每个亚基均成球状，内部有一个血红素。

血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。

当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。

　　凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。

层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。

一般是大分子先流出来，小分子后流出来。

凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。

对于高分子物质有很好的分离效果。

　　影响分离效果的因素主要有以下几点：

1.基质的颗粒大小、均匀度

　　2.筛孔直径和床体积的大小3.洗脱液的流速4.样品的种类等，5.缓冲液的pH

　　6.而最直接的影响是Kav值的差异性，Kav值差异性大，分离效果好；Kav值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。

　　影响凝胶过滤的因素主要有：

　　1、层析柱的选择：

长的层析柱分辨率要比短的高，但层析柱长度不能过长。

　　2、加样量：

加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。

　　3、凝胶柱的鉴定：

凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。

　　4、洗脱速度：

洗脱速度应保持适中。

　　目前凝胶过滤技术的应用主要是以下几点：

　　1、脱盐2、用于分离提纯3、测定高分子物质的分子量4、高分子溶液的浓缩5、蛋白质的复性

　　二、实验原理

　　层析法是基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。

当流动相（液体或气体）流经固定相（多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体）时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。

能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。

按操作形式可以划分为：

柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。

按流动相与固定相的不同划分：

气相层析、液相层析。

按层析的机理可以划分为：

吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。

2

　　凝胶过滤是一种按分子量大小分离物质的层析方法。

该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱，大分子不能进入凝胶颗粒的静止相中，只能在凝胶颗粒间随流动相移动，因而可以被较快洗出，而小分子则能够自由进出凝胶颗粒，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此需要花费较长时间流经柱床，从而使不同大小的分子得到分离。

　　本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。

由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即被还原为紫红色的亚铁血红蛋白。

亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。

铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。

这样，就可以形1

　　21XX百科凝胶过滤层析XX百科层析

　　象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。

　　本实验操作简便，直观性强，趣味性浓，通过肉眼就可以检验分离效果。

　　三、仪器与试剂、实验材料

　　1、仪器

　　⑴层析柱⑵恒流泵（HL-2恒流泵，上海沪西分析仪器厂）⑶胶头滴管

　　⑷50ml烧杯3个⑸玻璃棒

　　2、试剂

　　⑴磷酸缓冲液（老师已配好）

　　⑵还原层试剂（1:

1的40nMFeSO4和80mMNa2H2EDTA,0.2MNaHPO4,,老师提供）

　　⑶SephadexG-25

　　3、实验材料

　　血红蛋白样品（1ml抗凝血加10mlpH7的20mM磷酸缓冲液，再加入固体铁氰化钾，浓度达5mg/ml，老师提供）

　　四、实验步骤

　　1、凝胶溶胀：

老师已准备好

　　2、检验：

旋上层析柱下端柱帽，加少量去离子水，看水是否顺利流出，如果流速过缓，用洗耳球自上端吹气，使其畅通。

上下端倒置，按上述步骤检验。

　　3、装柱及平衡：

取下上端柱帽，装入5cm左右的洗脱液，溶胀好的凝胶边搅拌边倒入柱中，同时开始洗脱，使柱中的凝胶一直处在溶液中，装柱长15cm左右。

溶液液面应该高于凝胶面3-5cm，防止凝胶因脱水而毁柱。

实验中沉降完成后，液面高于凝胶面4cm左右。

此时观察柱面，上下均一，无界面，裂隙。

旋上上端柱帽，细管管接上磷酸盐缓冲液，下端柱帽的细管接恒流泵，开始平衡洗脱。

过程中调节好流速，6滴/分。

平衡过程20分钟。

　　4、上样：

事先剪好略小于层析柱内径的滤纸片，打开上柱帽，将滤纸片放入层析柱中，使其自然飘落覆盖在凝胶面上，防止上样时液滴对床面的冲击。

确定流速后准备上样。

利用恒流泵排气键加速洗脱，直至洗脱液面与胶床液面相切，停止洗脱。

用滴管加0.7ml还原试剂，小心注入胶床液面中央。

开始洗脱，待液面与凝胶床面相齐时，关泵。

上1ml磷酸缓冲液,开启泵,至液面与胶面相齐。

关泵。

上0.7ml血红蛋白样，开泵，至液面与胶面相齐，关泵。

上1ml磷酸缓冲液,开启泵,至液面与胶面相齐。

关泵。

上5ml的磷酸缓冲液。

接上上端柱帽与磷酸缓冲液，连续洗脱，观察现象，并用烧杯分别收集血红蛋白样品与铁氰化钾。

　　5、待黄色液体全部流出，开排气键，加速洗脱10分钟

　　五、结果

　　1、实验现象

　　还原层上样时，溶液呈黄色，当还原液面与凝胶床面相切时，床面以下两厘米左右呈现黄色。

　　加上褐色的血红蛋白样品时，开启泵。

此时褐色下渗，在未加入缓冲液之前，褐色带下端已经开始变为暗红色。

层析柱上的色带由上至下依次为黄色，褐色，暗红色。

　　当上5ml缓冲液并开始洗脱时候，褐色全部变为暗红色，红色带下端颜色变浅。

此时即为两个色带，上端黄色下端暗红。

　　开始洗脱七分钟时，暗红带下端开始变鲜红色，随时间推移，暗红带全部转变为鲜红色。

　　过程中，红色带在下，黄色带在上。

两色带一直下移。

色带边界不是很清晰，而且与其他组的同学相比，鲜红色较浅。

　　随色带的下移，两色带间距变大。

　　当开始流出红色液体时，用小烧杯接收，待红色全部流出用了30分钟。

　　当开始有黄色液滴流出时，用小烧杯接收，黄色液体全部流出用了7分钟。

　　2、现象解释

　　血红蛋白样品中的铁离子最初为三价，显褐色。

当经过还原带时，三价铁被还原成二价，生成暗红色的还原型血红蛋白。

还原型血红蛋白继续下移，与缓冲液中的氧气结合生成鲜红色的氧合血红蛋白。

　　血红蛋白分子量很大，分子直径大，不能进入凝胶孔穴内部，只能在凝胶颗粒间移动，所以洗脱速度较快。

而铁氰化钾分子量小，分子直径小，能够进入凝胶颗粒孔穴内部，故洗脱速度较慢。

　　3、凝胶过滤效果

　　相比于其他组的实验现象，我们组的效果不是太好。

刚开始的时候，两个色带分离效果不好，没有形成比较清晰的界限，但在最后终于是分开了，而且随着时间的推移，两色带间距拉大。

理论上讲，两色带的间距应该保持不变，间距变大的原因，可能是胶床面上的滤纸片没有放平，而且床柱的内部有裂隙，在外部无法观察到。

　　最后变成的鲜红色带相对颜色较浅，分析原因，是因为在加血红蛋白样品时没有震动试管，而血红蛋白分子又容易沉降，导致加入的血红蛋白样品较少。

　　六、思考题

　　总结分析柱层析技术操作的关键步骤和操作要领和技巧。

　　1、装柱。

如果装柱不均匀（没有填严实），使得柱子出现太多气泡，导致分离效果不好。

湿法装柱比干

　　法装柱效果要好。

　　这就要求在湿装时，要边搅拌边加入填柱料（硅胶或凝胶）。

而干法装柱时则要注意密实程度。

填完后应该从侧面敲打，使床柱更密实。

　　要求柱面上下均一，无界面，裂隙。

　　装柱后加滤纸片的时候应使其自然飘落在凝胶液面上。

　　2、恒流泵流速。

根据实验要求的不同要选择不同的流速。

像本次试验要求流速6滴/分，如果过快的话，

　　分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。

如果过慢，则耗

　　时太长。

　　3、上样。

上样的时候每次加样之前一定要停止洗脱。

否则很可能造成液面到达胶面以下而毁柱。

另外加

　　样的时候要用滴管把液体送到接近滤纸的地方再轻轻滴加，防止液体冲击对胶面造成影响。

　　七、参考文献

　　1、XX百科凝胶过滤层析

　　2、XX百科层析

　　3、赵武玲主编，《基础生物化学》，中国农业大学出版社，XX年9月第一版

　　4、有参考胡老师课件

　　八、实验小结

　　这次实验差点就失败了，应该是装柱的时候出了点问题，而在取血红蛋白样品的时候也没有提前摇匀。

实验前应该多考虑，多思考，并在实验中注意团队合作。

　　老师在实验前讲了好多道理，给了我们很大的启发。

我喜欢这样不单单教授理论知识的老师。

　　在实验之前老师提出了一个问题，血红蛋白中的亚铁离子为什么不会被氧气氧化。

查了好多资料，可惜看不太懂，无法理解，还是自己的基础知识没有学充分啊。