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生物化学实验讲义
家庭是幼儿语言活动的重要环境，为了与家长配合做好幼儿阅读训练工作，孩子一入园就召开家长会，给家长提出早期抓好幼儿阅读的要求。
我把幼儿在园里的阅读活动及阅读情况及时传递给家长，要求孩子回家向家长朗诵儿歌，表演故事。
我和家长共同配合，一道训练，幼儿的阅读能力提高很快。
实验一蛋白质的性质实验——蛋白质及氨基酸的呈色反应及蛋白质的沉淀反应
其实,任何一门学科都离不开死记硬背,关键是记忆有技巧,“死记”之后会“活用”。
不记住那些基础知识,怎么会向高层次进军?
尤其是语文学科涉猎的范围很广,要真正提高学生的写作水平,单靠分析文章的写作技巧是远远不够的,必须从基础知识抓起,每天挤一点时间让学生“死记”名篇佳句、名言警句,以及丰富的词语、新颖的材料等。
这样,就会在有限的时间、空间里给学生的脑海里注入无限的内容。
日积月累,积少成多,从而收到水滴石穿,绳锯木断的功效。
实验目的
家庭是幼儿语言活动的重要环境，为了与家长配合做好幼儿阅读训练工作，孩子一入园就召开家长会，给家长提出早期抓好幼儿阅读的要求。
我把幼儿在园里的阅读活动及阅读情况及时传递给家长，要求孩子回家向家长朗诵儿歌，表演故事。
我和家长共同配合，一道训练，幼儿的阅读能力提高很快。
1．了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。
2．了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
4．加深对蛋白质溶液的胶体性质的认识，了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
，
一、茚三酮反应
1.实验原理
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。
尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。
因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。
在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。
该反应十分灵敏，1∶1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。
此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
2.材料、仪器与试剂
蛋白质溶液；新鲜鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；0.5%甘氨酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；0.1%茚三酮-乙醇溶液
3.实验操作
①取2支试管分别加入鸡蛋清溶液和0.5%甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。
②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
二、黄色反应
1.实验原理
含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
2.材料、仪器与试剂
鸡蛋清溶液；大豆提取液（将大豆浸泡充分吸胀后，研磨成浆状用纱布过滤）；头发；指甲；0.5%苯酚溶液；浓硝酸；0.3%色氨酸溶液；0.3%酪氨酸溶液；10%氢氧化钠溶液
3.实验操作
向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。
待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。
管号
1
2
3
4
5
6
7
材料
（滴）
鸡蛋清
溶液
4
指甲
少许
头发
少许
0.3%
色氨酸
4
0.3%
酪氨酸
4
浓硝酸/（滴）
2
4
40
40
4
4
4
现象
三、蛋白质沉淀反应
蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后，即自溶液中沉淀析出，此现象叫蛋白质的沉淀反应。
（一）蛋白质的盐析作用
1.实验原理
盐析现象是指—般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质即自溶液中沉淀析出。
盐析作用与两种因素有关：
①蛋白质分子被浓盐脱水；②分子所带电荷被中和。
蛋白质的盐析作用是可逆过程，用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水稀释时又可溶解。
盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及pH有关。
分子量大的蛋白质（如球蛋白）比分子量小的（如清蛋白）易于析出。
球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中即可析出，而清蛋白需在饱和硫酸铵溶液中才能析出。
2.材料、仪器与试剂
鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；固体硫酸铵；饱和硫酸铵溶（称取377g硫酸铵溶于20℃500ml的蒸馏水中。
硫酸铵在20℃水中的溶解度为754g/L水。
配制时需称取稍过量的硫酸铵使溶液中有少量固体存在，同时可加热助溶）。
3.实验操作
取鸡蛋清溶液约5ml于试管中，再加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静止数分钟则析出球蛋白沉淀。
将管内混合液过滤，向滤液中加入硫酸铵粉末，至硫酸铵饱和不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。
（二）重金属盐类沉淀蛋白质
1.实验原理
溶液pH在蛋白质等电点以上时，重金属盐类（如Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等）易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。
重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。
但应注意，在使用某些重金属盐（如硫酸铜或醋酸铅）沉淀蛋白质时，不可过量，否则将引起沉淀再溶解。
2.材料、仪器与试剂
鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；5％CuS04溶液；3％AgNO3溶液
3.实验操作
取试管2支各加蛋白质溶液1ml，向各管分别滴加2-3滴加5％CuS04溶液、3％AgNO3溶液，观察各管所生成的沉淀。
在硫酸铜产生蛋白质沉淀的试管中，倒掉大部分沉淀，留少量沉淀，继续加入5％CuS04溶液，观察沉淀的溶解。
（三）有机酸沉淀蛋白质
1.实验原理
生物碱是植物中具有显著生理作用的—类含氮的碱性物质。
凡能使生物碱沉淀，或能与生物碱作用产生颜色反应的物质，称为生物碱试剂。
如鞣酸、苦味酸和磷钨酸等。
当蛋白质溶液pH值低于其等电点时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合成中性盐而沉淀。
溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最为灵敏而且特异，因此广泛的被用于沉淀蛋白质。
2.材料、仪器与试剂
鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；10％三氯醋酸溶液；
3.实验操作
取蛋白质溶液1ml于试管中，加数滴三氯醋酸溶液，观察现象。
思考题
1．茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调？
并说明原因。
2．能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在？
3．哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中的）可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结果？
实验二考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
【实验目的】
蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。
蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。
根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。
通过本实验学习考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
【实验原理】
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收
在595nm。
在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。
蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。
【实验试剂和器材】
1.仪器
电子天平、试管、试管架、移液管、容量瓶、721型分光光度剂
2.试剂
（1）标准蛋白质溶液：
称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，制成100μg/mL牛血清白蛋白溶液
（2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：
称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90%乙醇中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
（3）鸡蛋清1ml定容至50mL
【实验步骤】
1、标准曲线绘制
取6支试管，按下表加入各试剂。
管号
试剂
0
1
2
3
4
5
100μg/mL牛血清白蛋白溶液／mL
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水／mL
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
考马斯亮蓝液／mL
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
蛋白质含量/µg
0
20
40
60
80
100
加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595。
以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。
2、样品测定
试管中加自制蛋白质样品1.0mL，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。
根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。
【实验结果】
根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（µg），按下式计算：
查得的蛋白质含量（µg）×提取液总体积（mL）
样品蛋白质含量（µg/g鲜重）=
样品鲜重（g）×测定时取用的提取液体积（mL）
【注意事项】
（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
比色反应需在1h内完成。
（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。
测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
实验三氨基酸的分离鉴定－纸层析法
【实验目的】
通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
【实验原理】
层析法又称色谱法。
1903年，发现用挥发油冲洗菊粉柱时，可将叶子的色素分成许多颜色的层圈。
此后，把这种利用有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离的方法称为色谱法（Chromatography）。
虽然后来将色谱法应用于无色物质分离，但是这个名字一直沿用下来。
层析法除了吸附层析以外，还有离子交换层析和分配层析。
一般认为纸层析是分配层析中的一种，但也并存着吸附和离子交换作用。
分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。
通常用α表示分配系数。
α=
一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定的温度下是一个常数。
纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的OH基具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。
有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而上流动，称为上行层析。
流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。
显然两个物质的分配系数差得越大，则越易分开。
纸层析的实际操作是在滤纸的一端（通常距纸边缘2厘米），点上样品，干后，在密闭的容器内，待纸饱和了适当的溶剂蒸气后，令溶剂从有样品的一端经过毛细管的作用，流向另一端，使样品中的混合物得到分离。
这种操作常称单向层析。
为了得到更好的分离，还可以作双向操作或称双向层析。
即在滤纸的一角上点样品，先用一种溶系统展层后，使滤纸干燥，将纸调转90°，再用另一个溶剂系统展层
物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上的移动速率，用Rf表示。
Rf=
每一物质的Rf值决定于该物质在两相间的分配系数（α）和两相的体积比（AS/AL）。
这两种相即是水（固定相）和有机溶剂（流动相）。
两相体积比在同一实验情况下是不变的，所以Rf值的主要决定因素是分配系数（α）。
对于某一物质在一条件下的α值是固定的。
因此Rf值为其特征常数。
现将影响Rf值的因素概括如下：
1、物质结构的影响：
极性物质是易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质是易溶于非极性溶剂（有机溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。
例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配较多，因此Rf低于后者。
—CH2—基是疏水性基团，如果分子中极性基数目不变，则—CH2—基增加，整个分子的极性就降低，因此易溶于有机溶剂（流动相）中，Rf值亦随之增加，例如氨基酸的Rf值：
甘氨酸＜丙氨酸＜亮氨酸，二羧基氨基酸中，天冬氨基酸＜谷氨酸。
极性基团的位置不同也会引起Rf变化，例如在正丁醇-甲酸-水系统中层析时，α-丙氨酸的Rf值大于β-丙氨酸。
2、溶剂的影响：
同一物质在不同溶剂中Rf值不同，选择溶剂系统时应使被分离物质在适当Rf值范围内（0.005到0.85之间），并且不同物质的Rf至少差别为0.05才能彼此分开。
溶剂的极性大小也影响物质的Rf值。
在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的Rf值随着溶剂碳原子数目增加而降低。
3、pH的影响：
溶剂系统的pH会影响物质极性基团的解离形式，例如氨基酸在酸性或碱性溶剂中变化如下：
对于酸性氨基酸则在酸性时所带净电荷比碱性时少。
带电荷越少亲水性越小，因此在酸性溶剂中Rf值较碱性中大。
而碱性氨基酸则与此相反。
借此性质用酸相和碱相溶剂进行双向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。
溶剂的pH还可影响有机溶剂（流动相）含水量，溶剂酸碱度大，则含水量多。
对于极性物质如（氨基酸）来说Rf值增加，非极性物质则减少。
若pH不适合，使同种物质有不同解离形式，其Rf也略有不同，则此物质层析呈带状图谱。
因此溶剂中的酸或碱的含量必须足够，并且层析缸（或箱）中用酸或碱的气体饱和才可以防止上述现象，使物质得到圆点状图谱。
4、滤纸的影响：
层析滤纸必须质地均匀、紧密，有一定机械强度，并且杂质较少，如纸中含有Ca2+、Mg2+、Cu2+等金属离子杂质，可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴影，可用稀酸（0.01mol·L—1或0.4mol·L—1HCl）洗涤滤纸除去之。
5、温度的影响：
温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤维素的水合作用。
温度变化对Rf值影响很大，所以层析最好在恒温室中进行，控制温度相差不超过±0.5℃。
除上述因素影响Rf值外。
样品中含有盐份和其他杂质以及点样过多均会影响样品的有效分离。
无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定，氨基酸层析图谱常用茚三酮或吲哚醌作显色剂。
茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复，必须严格控制上述条件。
样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色，如含有大量盐时显色点上会出现白斑，此外空气中的杂质如氨、硫化氢或酚等都会影响显色结果。
铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定。
用硫酸酮乙醇溶液洗脱层析后的显色斑点，借比色法可定量测定氨基酸含量。
【实验器材及试剂】
1．器材：
①层析缸②毛细管③喷雾器④培养皿⑤层析滤纸
2．试剂：
①扩展剂：
4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。
将20毫升正丁醇和5毫升冰醋酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。
取漏斗内的扩展剂约5毫升置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
②氨基酸溶液：
0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0.5%）。
③显色剂：
0.1%水合茚三酮丙酮溶液。
【操作步骤】
1．将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。
2．取层析滤纸（长18—20厘米，宽14厘米）一张。
在垂直于纸的纹路一端距边缘2—3厘米处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2厘米作一记号，作为点样位置，并用铅笔在点样点下端写出所点氨基酸的名称。
3．点样：
用毛细管将各氨基酸样品分别点在这五个位置上。
电吹风吹干后再点一次，共点三次。
每点在纸上扩散的直径最大不超过3毫米。
4．扩展：
用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。
将盛有约20毫升扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中，点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1厘米。
待溶剂上升15厘米左右时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。
5．显色：
用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮丙酮溶液；然后置烘箱中烘烤5分钟（100℃）或用热风吹干即可显出各层析斑点。
【结果与讨论】
1．计算出各种氨基酸的Rf值，并根据Rf值鉴定出混合氨基酸中的各组分，在层析图谱上标出各氨基酸名称。
2．对氨基酸移动快慢的原因给予简要分析。
实验四SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量
一、目的和要求
了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量。
二、原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）可以用圆盘电泳，也可以用垂直平板电泳，本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率表现在三个方面：
1、浓缩效应：
样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前被浓缩成一样品薄层。
这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，Cl－、甘氨酸阴离子以及蛋白质，在浓缩胶的pH值下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而Cl－的电泳迁移率最大。
在电场的作用下，Cl－最初的迁移速度最快，这样在Cl－后面形成低离子浓度区域，即低电导区，而低电导区会产生较高的电场强度，因此Cl－后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。
达到稳定状态后，Cl－和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。
蛋白质由聚集在甘氨酸和Cl－的界面附近而被浓缩成很窄的区带，所以在浓缩胶中Cl－是快离子（前导离子），甘氨酸是慢离子（尾随离子）。
2、电荷效应：
当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的pH值（通常pH=8.9）较大，甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度变大，赶上了Cl－，电位梯度消失，这时蛋白质在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向正极移动。
电荷多少决定泳动速度。
3、凝胶的分子筛效应：
由于蛋白质进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。
由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）有圆盘和垂直板型之分，但两者的原理完全相同。
三、操作步骤
1.将垂直平板电泳槽装好，不同的电泳槽安装的方法不同，按说明书进行。
2.分离胶的选择和配置方法
∙按照蛋白质不同的相对分子量选用不同浓度的分离胶。
蛋白质的相对分子量的范围
分离胶的浓度
〈104
20%～30%
1×104～4×104
15%～20%
4×104～1×105
10%～15%
1×105～5×105
5%～10%
〉5×105
2%～5%
（2）不同分离胶的配制方法
分离胶的浓度
20%
15%
12%
10%
7.5%
重蒸水/ml
1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）/ml
质量浓度为10%SDS/ml
凝胶贮备液（Acr/Bis）/ml
质量浓度为10%过硫酸铵/μl
TEMED/μl
总体积/ml
0.75
2.5
0.1
6.6
50
5
10
2.35
2.5
0.1
5.0
50
5
10
3.35
2.5
0.1
4.0
50
5
10
4.05
2.5
0.1
3.3
50
5
10
4.85
2.5
0.1
2.5
50
5
10
3.分离胶的灌制
根据待测蛋白质样品的相对分子量选择合适的分离胶浓度，本实验选用小牛血清为待测相对分子质量的样品，用12%的分离胶。
在15ml试管中依次加入重蒸水3.35ml、1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）缓冲液2.5ml10%SDS0.1ml、凝胶贮备液4.0ml、10%过硫酸铵50μl和TEMED5μl，由于加入TEMED后凝胶就开始聚合，所以应立即混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，留出梳齿的齿高加1cm的空间以便灌注浓缩胶。
用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约30～60min，分离胶则聚合，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的重蒸水，尽可能去干净。
4.浓缩胶的配制和灌制
一般采用5%的浓缩胶，配制方法：
重蒸水2.92ml、0.5mol/LTris-HCl缓冲液（pH6.8）1.25ml、10%SDS0.05ml、凝胶贮备液（Acr/Bis）10%过硫酸铵25μl、TENED5μl，在试管中混匀，灌注在分离胶上。
小心插入梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直静置于室温下至浓缩胶完全聚合（约30min）。
5.样品的制备
标准蛋白样品的制备
取出一管预先分装好的20 μl低相对分子质量标准蛋白质，放入沸水浴中加热3～5min，取出冷至室温。
待测样品的制备
a.10μl小牛血清加10μl2倍还原缓冲液。
b.10μl小牛血清加10μl2倍非还原缓冲液。
以上a、b两管均同标准蛋白质样品一样，在沸水浴中加热3～5min，取出冷至室温。
6.电泳
待浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳齿，用电极缓冲液洗涤加样孔（梳孔）数次，然后将电泳槽注满电极缓冲液。
用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样
接上电泳仪，上电极接电源的负极，下电极接电源的正极。
打开电泳仪电源开关，调节电流至20～30mA并保持电流强度恒定。
待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1cm时，停止电泳。
7染色与脱色
小心将胶取出，置于一大培养皿中，加染色液染色1h，倾出染色液，加入脱色液，数小时更换一次脱色掖，直至背景清晰。
四、试剂和器材
试剂
1.凝胶贮备液：
丙烯酰胺（Acr）29.2g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加重蒸水至100ml.外包锡纸，4
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