第一章 引物设计.docx

第一章 引物设计.docx

《第一章 引物设计.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第一章 引物设计.docx（33页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

第一章引物设计

第一章引物设计

1.1引言

随着生物技术与分子生物学学科的发展,PCR技术已成为应用最广泛的技术之一，在转基因食品的检测、转基因植株的鉴定、人类疾病检验与诊断、动物源性饲料成分的检验与疯牛病控制、禽流感及食源性致病菌的检测等动植物检验检疫方面得到广泛的应用。

在PCR技术中,引物设计是关键的一环。

一般在可能的条件下都需要进行引物设计，以获得最佳的扩增效率及扩增产物的特异性。

为此，PCR引物设计需要遵循一定的原则。

首先，引物要跟模板紧密结合；

其次，引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在

再次，引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。

围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primerlength）、产物长度（productlength）、序列Tm,值（meltingtemperature）、△G值（internalstability）、引物二聚体及发夹结构（duplexformationandhairpin）、错误引发位点（falseprimingsite）、引物及产物G＋C含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切位点、引进突变等。

各种模板的引物设计难度不一,有的模板本身条件较差，比如G+C含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；有时PCR的产物要作为克隆对象插入到载体中表达，致使PCR引物设计的可选择度很低，此时也只能退而求其次。

一般来说，引物要尽量满足以下要求:

1一般引物的长度为16~23bp，常用的长为16~21bp，过长或过短都不合适。

但在进行长片段PCR时，为避免非特性扩增的影响，往往需要增加引物的长度，一般要在3obp以上。

2由于进行PCR扩增时，在DNA聚合酶的作用下，将沿着引物3′端进行延伸，所以3′端的几个碱基对PCR反应的成功与否具有重要意义，它们应当与模板严格配对。

引物3′最末端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其他三种碱基的错误引发效率相对小一些；而且这一碱基最好不要落在密码子的第三位碱基上，因为这一碱基位点较其他位点具有更高的变异性。

3引物的GC含量一般为45%－55%,过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的CC含量不能相差太大。

4引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右，当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。

5∆G值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标。

一般情况下，最好不要超过9（△G值为负值，这里取绝对值），以利于正确引发反应。

尽量避免非特异性结合位点的存在，以避免非特异性扩增条带的出现。

6引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带,而且会降低引物浓度，从而导致PCR正常反应不能进行。

7对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物选用不同限制酶的识别序列，以利于后续操作。

1.2通用引物设计软件PrimerPremier5.00

随着计算机技术的发展，运用计算机进行引物设计具有高效，全面的特

点，显示出了巨大的优势，目前已开发出大量的引物设计软件，其中应用较广

的有PrimerPremier（最新版本5.0）和oligo（最新版本6.67）。

Oligo软件在引物分析评价方面具有优势，而PrimerPremier则具有很强的自动搜索功能，并且操作十分简单，深受分子生物学家的欢迎。

PrimerPremier由加拿大的Premier公司开发，它集成了引物设计（Primerdesign）,酶切分析（RestrictionSites）、基序分析（Motif）以及序列比对（Align）等多项功能，但后共项都己有功能强大的专业化软件，并不是PrimerPremier的强项。

因此，它最为常用的功能是进行PCR引物或测序引物以及杂交探针的

设计、分析等。

现仅将此功能作一简要介绍。

1.2.1PrimerPremie5.00的序列编辑窗口（GeneTank）

图1-1PrimerPremie5.00的序列编辑（GeneTank）窗口

打开程序首先进入序列编辑（GeneTank）窗口（图1-1），这一功能板块包括以下部分：

（1）GeneTank打开、浏览、编辑及翻译序列；

创建新序列：

该项功能可以让您手动键入一个新的序列。

您可以键入任何DNA或蛋白序列并存在您指定的文件夹内，并可以象其他如GenBank格式的文件一样进行操作。

打开已有序列:

使用菜单File>Open可以激活文件选择对话框,用来打开您希望处理的包含特定序列的文件。

如果序列文件是GenBank的标准格式PRIMERPREMIER会自动识别打开文件中的序列起始位置。

或是您曾经使用本软件菜单中File>Save命令以PRIMERPREMIER默认格式保存过，该文件序列将自动打开，如果打开其他格式的序列文件，将出现一个可卷动的ImportSequence窗口并显示全部序列，在序列第一行的起始处双击，则双击处以前的所有信息将被认为是文件。

查看序列：

查看文件题头：

文件题头是指存在于序列文件中，位于序列信息上游的文字内容，点击按钮（或从View>ShowHeaderCtrl+H）菜单,可以查看文件题头（如图1-2所示）。

图1-2PrimerPremie5.00的序列编辑（GeneTank）题头窗口

改变5′末端序列起始位置：

改变5′末端序列起始位置，默认为1，序列将从您指定的5′位置开始显示序列。

选择3碱基或10碱基一组的显示方式：

单击按钮（View>Grouping3Ctrl+3）或（View>Grouping3Ctrl+0），序列将以3个碱基或10个碱基一组显示。

保存序列：

使用本软件保存的序列可以被软件自动识别而无需让您指出序列起始位置。

建议您在诸如以下情况保存序列，您需要经常使用同样的序列、您已经编辑完一段序列并希望保存结果、您已经输入一段新序列。

编辑序列：

只需在GeneTank窗口内您就可以方便的编辑DNA或蛋白质序列。

而编辑翻译或原始序列十分方便，在任一序列上的改变将会正确的反应到与之相关的其他序列。

例如：

如果你在一段蛋白序列上，无论该序列是被翻译的，或是用来反推DNA的原始序列，删除一个氨基酸残基，在相应DNA上的对应三位密码子将同时被删除。

但如果您改变一段翻译出的序列，这一改变将仅仅在另一段由此翻译出的序列而不会出现在原始序列上，编辑序列可以使用直接键入或利用剪贴板

通常的剪切、拷贝、粘贴同样可以方便的在此使用。

其快捷键分别是CTRL-X,CTRL-C和CTRL-V。

软件提供三碱基一组的显示方式以利于蛋白相关的工作。

在键入DNA序列时可以使用A、C、G、T或者附录B所列出的多义碱基。

在键入蛋白序列时可以使用附录C中所列出的氨基酸单字母记号。

可以从任何文本编辑器如记事本中的剪贴板中拷贝一段序列并将其粘贴进来，当您完成编辑后请注意保存序列。

查找序列：

利用GeneTank窗口上的按钮（或从Edit>Find），您可以从指针起始位置开始查找序列中一段特定字符。

查找到第一个后，您也可以使用按钮（或从Edit>FindNext）在余下的序列中继续查找。

使用Search菜单,选择GoToPosition（或从Edit>GoToPosition）,可以将指针移到您指定的位点。

查看不同链：

要查看该序列的互补链，您只需要点击GeneTank窗口上的按钮（或从View>Anti-senseStrand），就会显示该序列的互补链，（此时互补）而点击（或从View>SenseStrand）按钮，就能恢复成原来的序列。

您亦可点击（或从View>dsDNA）按钮以双链形式显示。

语音校读：

序列编辑器提供了一个较为有用的功能为语音校正，完整的序列编辑功能，在输入序列的时候，程序自动将碱基读出，以便用户进行校正，保证输入的正确和快速。

在GeneTank打开一段序列后，您可以按下语言按钮（或Function>Speaker>SequenceCtrl+U）启用语音校读功能，序列将从指针所在的位置开始被依次朗读序列，再次按下语音按钮将停止朗读，按下键入朗读键（或Function>Speaker>KeyboardCtrl+K）将在键入的同时朗读输入的序列，再次按下该按钮可以停止键入朗读。

粘贴序列窗口：

这一窗口使得一段核酸序列通过选择以四种不同的方式粘贴上去（见图1-3），分别为正向（Asis）、反向（reversed）、互补（complemented）、以及反向互补（reversecomplemented），这样便于从其他程序中粘贴序列而无需考虑其序列保存的方向。

见图1-3粘贴序列窗口

参数设置（Preferences）窗口:

参数设置（Preferences）窗口可以改变本软件所使用的多种默认参数,也可以允许您查看及更改引物评分参数,设定二级结构在引物评分中所占的权重系数。

默认引物长度

默认值为25，默认引物长度在PrimerPremier窗口使用即点即选功能时得到的引物长度，该项参数也是PrimerPremier窗口启动时的初始默认值这项数值可以设定为1到70个碱基。

引物搜索最大对数值

默认值为100，在自动搜索引物时，得到的结果数量可以很多，由于该软件按照引物评分来衡量引物效率，有些引物虽然合乎标准但评分较低，可能没有全部列出的必要尽管我们设置了100对引物这一较大的数值，您仍然可以改变该项参数为10到1000之间的任意值。

核酸浓度：

默认值为250pM，根据文献（7Freier等）提供的计算公式，这是没有自身配对时退火的寡聚核苷酸的总浓度。

它即不是引物浓度也不是起始模板浓度，而是PCR产物的浓度，由于在PCR过程模板的浓度变化很大，很难确定具体数值根据文献11的建议（Rychlik等），一般经验公式在普通PCR反应中将其当作250pM，这项数值被用来计算引物的退火温度。

单价离子浓度：

默认值为50mM，这项数值是指反应混合液中所有单价离子的总浓度。

游离Mg2+离子浓度：

默认值为1.5mM，这项数值是指反应混合液中充当辅基的Mg2+离子浓度

总Na+当量:

这项数值是根据单价离子浓度和游离Mg2+离子浓度计算得来,计算公式如下（Sprt即取平方根:

总Na+当量=单价离子浓度+4×Sqrt（游离Mg2+离子浓度×1000）,这项数值用来计算引物的退火温度

自由能计算设置温度:

默认值为25℃,这项数值用来计算自由能∆G,自由能计算公式:

∆G=∆H-T×∆S。

评分参数（Ratingparameters）：

评分参数窗口是用来设定二级结构在引物评分中的权重系数，二级结构越稳定，引物评分就会越低，相对于在引物中间形成的二级结构来说，3′末端的二级结构对PCR扩增的影响会更大为了将这一效应计算在内，软件将3′末端的二级结构的自由能数值∆G减去1，这一修正会使3′末端的二级结构显得更加稳定。

这一修正值是根据未公开实验结果制定的，您可以根据自己的需要来更改。

软件只标注是引物二级结构中最稳定的一个自由能数值∆G，如果没有检测到二级结构，则该数值为0。

序列比较：

这一部分仅在PrimerPremier的Windows版本中使用，对于Macintosh系统，序列比较是提交到网上完成并下载比较结果，在Primer的教程中有关于这方面的完整信息。

Align（序列比较）窗口让您将已经打开的序列进行比较，序列选择框显示所有将要比较的序列，使用Add和Delete按钮可以增加一个