武汉工程大学电气信息学院自动控制原理考研仿真模拟五套题.pptx

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,5,超分辨显微成像技术,定义：

远场条件下基于荧光的，“突破”衍射极限的光学显微成像技术。

1.衍射极限阿贝光学衍射极限：

可见光波段（400-700nm）,水的折射率为1.33，而sin最大为1，则其分辨率极限为150nm.实际上NA（数字孔径）为约为1.也就是说在两个点光源相距200nm以内时，Airydisk有很大重叠而无法分开。

2.“突破”光学光学显微成像的衍射极限衍射极限为远场效应，在近场下无效。

通过应用一系列物理原理、化学机制和算法“突破”了光学衍射极限,把光学显微镜的分辨率提高了几十倍，使我们能以前所未有的视角观察生物微观世界。

d:

分辨率；:

光波波长：

聚焦光锥的半角n:

介质的折射率,分类,1.通过调制照明光斑缩小系统的点扩散函数来实现超分辨成像；基本思想是：

在激发光斑点扩散函数周围套上一个环形点扩散函数，以“擦除”激发光斑的外围，从而使得激发光斑“变,小”。

包括受激发损耗显微技术（STEM）;可逆饱和线性荧光跃（RESOLFT）；饱和结构光照明显微技术（SSIM）2.基于单个荧光分子的定位；虽然Abbe衍射极限指出无法区分相距约200nm的两个荧光分子，但是通过提取单个荧光分子的爱里斑信息却可以实现对这个荧光分子的精确定位。

包括光激活定位显微技术（PALM）;随机光学重构显微技术（STORM）,1.饱和结构照明显微技术（SSIM）,5.光激活定位显微技术（PALM）,缩小系统的点扩散函数,可逆饱和线性荧光跃迁（RESOLFT）受激发损耗显微技术（STED）随机光学重构显微技术（STORM）单个荧光,分子定位,基于缩小PSF的超分辨成像技术,第一篇,SSIM的特点,1.无论是线性还是非线性结构光照明所获取的显微图像都比常规显微图像具有更清晰、更丰富的细节结构。

利用常规显微镜、常规滤波、线性结构光照明以及采用2级谐波的非线性结构光照明对细胞微管所成图像。

比例尺500nm,2.观察生物样品的动态特性,要观察生物样品的动态特性就要有较高的成像速度，结构光照明荧光显微镜只需要获得几幅初始图像即可重构超分辨图像的特点使其能满足这种成像速度要求。

如3D-SIM分析了不同细胞周期状态下人体细胞中心体的中心粒与中心粒周围基质之间的空间关系.,3.相比于其他超分辨荧光显微技术而言，结构光照明荧光显微镜提升分辨率的能力偏低。

可逆饱和线性荧光跃迁（RESOLFT）,图1RESOLFT过程的原理图AB的转移过程可以由入射光来驱动。

而反转移过程BA可以由任意形式的能量来驱动，如光、化学反应、热能，甚至是自发辐射等。

I决定荧光分子的状态；定义饱和光强（Isat=kBA/BA）,则当IIsat时，荧光分子将总处于B状态。

原理：

可逆光饱和转移过程。

转移截面大小,半峰全宽,RESOLFT过程的原理图-2入射光强度I=I（X）在xi点必须等于0;实际中当位于xi点的激光光强小于峰值光强Imax的1即可。

I（X）作用A状态荧光分子群时，ImaxIsat,则除了xi点及其周围区域外，其他区域荧光分子都倾向转化成B状态。

受激发射损耗显微技术（STED）,原理：

通过受激发射损耗的方式来改变荧光基团发射荧光的区域，借助受激辐射过程中的非线性效应，压缩PSF，突破衍射极限对分辨率的限制实现超分辨成像。

受激发能级图,STED显微镜的结构,xy平面STED显微镜压缩PSF的示意图,L1,L0,A.S1最低能级的荧光分子遇到波长与基态和激发态能级差相匹配的光子就会发生受激辐射回到基态，失去发荧光的能力。

B.STED显微镜借助波长相对于激发光红移的STED光来压缩PSF。

C.STED光产生的圆环光斑是中心强度为零而中心以外区域强度不为零的圆环光斑。

受激发射损耗显微技术（STED）-优缺点,优点：

1.可以快速地观察活细胞内实时变化的过程。

如神经元突触小泡运动的实时成像视频记录.,应用STED技术已经可以以视频的速度（每秒28帧）来采集记录神经细胞内突触小泡的高分辨率图像（50nm）。

缺点：

可能发生荧光漂白,这个过程是不可逆的,影响到荧光的发光效果,会削弱系统的分辨率。

光路复杂，设备昂贵，对系统的稳定性要求很高,基于单分子成像的超分辨技术,第二篇,1.随机光学重构显微技术（STORM）,随机光学重构显微技术即stochasticopticalreconstructionmicroscopy（简称STORM），是一种基于单分子成像的超分辨率显微成像方法。

2006年底，美国霍华德-休斯研究所的华裔科学家庄小威实验组开发出来这种类似于PALM的方法，可以用来研究细胞内源蛋白、DNA等的超分辨率定位。

STORM基本原理,是利用高精度荧光分子定位技术和荧光分子开关技术来实现超分辨成像。

关键：

荧光染色对Cy5-Cy3,STORM成像过程,激发态Cy5,532nm激光633nm激光,基态Cy5,STORM的优点,1.分辨率高：

相较于普通荧光显微技术，STORM突破了衍射极限，分辨率大幅提高。

2.彩色成像。

用不同颜色的荧光分子对标记研究对象，选取恰当的激发光，就能区分细胞内的不同结构，分析结构间的相互作用。

3.3D成像：

借助像散成像技术获得观测对象的Z轴信息，可获得生物大分子的STORM3D图像。

STORM的缺点,由于需要反复激活-猝灭荧光分子，所以使得实验大多数在固定的细胞上完成。

即使是在活细胞上进行的实验，也不易获得足够高的时间分辨率。

2.光激活定位显微技术（PALM）,PA-GFP标记蛋白低能量405nm激光照射细胞表面488nm激光照射,用488nm激光照射来漂白这些已经定位正确地荧光分子，使其失去发射荧光能力,原理：

利用单分子荧光成像，突破光学显微镜的定位精度的一种光敏定位技术。

PALM的缺点,PALM的成像方法只能用来观察外源表达的蛋白质，而对于分辨细胞内源蛋白质的定位无能为力。

PALM成像方法的点扩散函数成像仍与传统显微成像一致，时间分辨率低。

活细胞上快速成像的分辨率远低于固定样本成像。

需要很强的激发光来照射样品，在这种情况下，荧光蛋白/分子很快就被漂白，产生大量的自由基损伤细胞样品。

因此，在本质上PALM不适合活细胞长时间成像。