1摘要核桃系胡桃科核桃属植物.docx

1摘要核桃系胡桃科核桃属植物.docx

《1摘要核桃系胡桃科核桃属植物.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《1摘要核桃系胡桃科核桃属植物.docx（157页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

1摘要核桃系胡桃科核桃属植物

克隆平末端的目的片段时，为最大量地获得“正确”的连接产物，载体和目的DNA在连接反应中的比例必须适当。

载体与目的DNA的摩尔比过高，会造成大量的环化空质粒，既可能是单一质粒的环化，也可能是多个质粒聚集而形成的环化。

摩尔比如果过低，则会产生过量的在大小、方向和组成上各不相同的线状和环状的均质或异质性多聚体。

为此，每一重组体中外源DNA的连接方向和插入数量都必须用限制酶酶切图谱分析或其他方法加以鉴定。

本实验以载体与目的片段的摩尔比为1:

10进行连接，同时应用三种不同的限制性内切酶进行多重鉴定，取得了满意的实验结果。

   连接体系中高浓度的平端，也是获得平端连接的必要条件。

在载体和目的片段的摩尔比适当的条件下，尽量加大各自的摩尔浓度，以缩小载体片段末端与目的片段末端在空间上的距离，从而加大二者的碰撞几率，减小载体片段的自身环化连接。

本实验主要从以下几点来加大连接体系中载体片段和目的片段的平端浓度：

1）提取质粒DNA时尽量做到高浓度、高质量；2）酶切时，在不影响酶切效果的情况下，加大酶切体系中质粒DNA的浓度；3）凝胶电泳分离目的DNA时，加入大量酶切产物，胶回收时尽量少带胶，切下的胶中目的片段的浓度尽量高，从而使回收的溶液中DNA片段的浓度尽量高；4）连接体系尽可能小（一般5~10μl），体系中除T4噬菌体DNA连接酶和相应的缓冲液外，全部由两种胶回收溶液按特定比例填充。

   低浓度（0.5mmol/L）的ATP和极高浓度的连接酶也是平端连接的必要条件。

在反应混合物中，ATP作为10×连接缓冲液的组分，给载体和外源DNA片段提供了更为广阔的空间。

本实验中厂家提供的连接缓冲液含有ATP，因而没有另外加入ATP。

此外，平端连接是低效反应，连接反应的时间相对较长，所以应加入极高浓度的连接酶。

   去除载体5’端的磷酸基可防止质粒DNA的自身环化，这一点在不少书籍中提到。

但对于去磷酸化处理是否有利，各家的观点不尽相同，有很多研究者对去磷酸化的作用持有疑问。

毫无疑问，去除5’端的磷酸基可抑制质粒DNA的自身环化，因而降低带有“空”质粒的细菌克隆所产生的背景。

因而，也会经常发生同时使带有重组质粒的克隆减少的情况。

此外，去磷酸后，必须对碱性磷酸酶进行充分灭活，以保证下一步的连接反应顺利进行，但灭活过程中进行抽提时，大大降低了质粒DNA的浓度，不容易操作。

本实验初期尝试应用碱性磷酸酶去除载体5’端的磷酸基，效果并不理想。

鉴于这些原因，本实验不推荐使用这一方法。

   在连接反应混合物加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成聚集体的物质，如聚乙二醇或氯化六合高钴，可以使如何取得适当浓度的平端DNA问题迎刃而解。

但考虑到这些物质的加入也增强了连接产物的硬度，大大降低了连接产物转化大肠杆菌的效率，所以本实验并没有应用这类物质。

1摘要核桃系胡桃科核桃属植物，在我国分布范围广阔。

本文首先以普通核桃的不同部分为研究对象，确定各部分多酚类物质的组成及含量的分布；再以普通核桃、不老屯核桃、美国黑核桃为试验材料，重点研究不同品种核桃青皮中多酚类物质的成分、含量及抗氧化活性。

试验结果表明：

核桃中对人体有益的多酚类物质主要集中在青皮、种皮部分，且青皮中多酚类物质的绝对含量相对较高；在不同品种核桃青皮的多酚类物质中，从总酚含量、单宁含量及胡桃醌含量看，美国黑核桃青皮均最高，其次为普通核桃青皮，不老屯核桃青皮均最少。

从所拥有的多酚类物质种类数看，普通核桃青皮的最多，其次为美国黑核桃青皮，不老屯核桃青皮最少。

在三个品种的酚酸类物质中，没食子酸含量均是最高的，且从其含量看，不老屯核桃青皮最高，其次为美国黑核桃青皮，普通核桃青皮最少。

在三个品种的黄酮类物质中，芦丁的含量均是最高的，且从其含量上看，美国黑核桃青皮最高，其次为普通核桃青皮，不老屯核桃青皮最少。

从抗氧化性看，利用DPPH自由基的反应体系进行清除自由基实验，美国黑核桃青皮清除自由基的能力最强，其次为不老屯核桃青皮，普通核桃青皮最弱。

关键词：

核桃青皮；多酚类物质；抗氧化性

2DeterminationofthePolyphenolsandtheAntioxidantActivityintheWalnutGreenRindAbstractWidespreadinChina,walnut（JulansregiaL）isamemberplantofwalnutgenerainthewalnutfamily.Thepaperfirstmadeastudyondifferentpartsofwalnuttodeterminethetypesandcontentofpolyphenolsineachpart.Thenthreetypesofwalnuts（i.e.walnut,BulaotunwalnutandEasternBlackwalnut）wereselectedasexperimentalmaterialsandresearchwasmainlyfocusedonthetypes,contentandantioxidantactivityofpolyphenolswithinthegreenrindsofthethreetypesofwalnuts.Itshowsthatpolyphenolsgoodformanaremainlyreservedingreenrindandkernelpellicleofwalnutsandmosthighlyinthegreenrind.Andamongthethreetypesofwalnuts,EasternBlackhasthehighestamountofTotalPhenolics,PPPaswellasJugloneinitsgreenrind.WalnutrankssecondandBulaotunhasthelowest.Intermsofnumberofpolyphenolvarieties,thegreenrindofwalnuthasthemost.EasternBlackrankssecondandBulaotunhastheleast.Foreachofthethreetypesofwalnuts,gallicacidisalwaysofahigheramountcomparedwithotherPhenolicAcidmaterials.Andintermsofcontent,greenrindofBulaotunpossessesthehighestamount.EasternBlackrankssecondandwalnuthastheleast.Andforeachofthethreetypesofwalnuts,RutinisalwaysofahigheramountcomparedwithotherFlavonoidmaterials.Andintermsofcontent,greenrindofEasternBlackpossessesthehighestamount.WalnutrankssecondandBulaotunhastheleast.Withregardtoantioxidantactivity,thegreenrindofEasternBlackismostablewhentestingantioxidantpowerbytheDPPHmethod.BulaotunrankssecondandWalnuttheweakest.Keywords:

WalnutGreenRind,Polyphenols,AntioxidantActivity.Directedby:

Prof.ZHAOLiqinApplicantforMasterdegree:

WANZhengmin（AgriculturalProcessingandStorage）（FoodScienceandEngineeringDepartment,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Huhhot010018,china）

3目录1引言...............................................................................................................11.1核桃的概况...........................................................................................11.1.1核桃的种类及分布...........................................................................11.1.2核桃的生产现状及保健功能.............................................................11.2多酚类物质的结构、性质....................................................................21.2.1多酚类物质的结构.............................................................................21.2.2多酚类物质的性质.............................................................................21.3多酚类物质的分离、提纯、鉴定.........................................................31.4核桃青皮的研究情况............................................................................61.4.1核桃青皮中的主要化学成分.............................................................61.4.2核桃青皮生物活性作用及其研究进展..............................................71.5核桃多酚类物质的研究现状.................................................................81.6研究目的与意义...................................................................................102材料和仪器...................................................................................................112.1试验材料..............................................................................................112.1.1核桃果实不同部位的多酚类物质分析的原料.................................112.1.2不老屯核桃、美国黑核桃青皮中多酚类物质分析的原料.............112.2试验仪器和设备...................................................................................112.3试验药品...............................................................................................123试验方法.......................................................................................................123.1多酚类物质的提取...............................................................................123.1.1核桃果实不同部位的多酚类物质的提取.........................................123.1.2不同核桃青皮中多酚类物质的提取.................................................123.2核桃多酚类物质的显色反应................................................................123.3核桃总酚的测定—普鲁士蓝法............................................................123.3.1标准曲线的制作................................................................................123.3.2样品的测定........................................................................................133.4核桃单宁的测定:

蛋白质沉淀法..........................................................133.5核桃PPC的测定..................................................................................143.5.1标准曲线的制备................................................................................14

43.5.2PPC（沉淀蛋白质的量/样品重量）的测定....................................143.6核桃青皮中多酚类物质的组成的HPLC色谱测定...........................153.6.1酚酸类...............................................................................................153.6.2黄酮类...............................................................................................153.7核桃青皮中总黄酮的测定...................................................................153.7.1定性实验－紫外吸收光谱...............................................................153.7.2颜色反应...........................................................................................163.7.3标准曲线的制作...............................................................................163.7.4样品的测定.......................................................................................163.8不同核桃青皮叶绿素含量的测定......................................................173.9不同核桃青皮胡桃醌的测定...............................................................173.10不同核桃青皮抗氧化活性的测定......................................................174结果与分析..................................................................................................184.1核桃果实不同部位的多酚类物质分析比较......................................184.1.1核桃果实不同部位的多酚类物质的显色反应结果........................184.1.2核桃果实不同部位的多酚类物质的组成及HPLC分析比较.........194.2不同核桃青皮中多酚类物质分析比较...............................................234.2.1不同核桃青皮中多酚类物质的显色反应结果................................234.2.2不同核桃青皮中有关指标的分析比较............................................234.2.3不同核桃青皮的多酚类物质的组成比较及HPLC分析比较.........244.2.4不同核桃青皮的黄酮类物质的显色反应结果...............................254.2.5不同核桃青皮中总黄酮的测定.....................................................254.2.6不同核桃青皮中胡桃醌的测定.......................................................264.3不同核桃青皮酚类物质的抗氧化活性研究.......................................295讨论.............................................................................................................306结论.............................................................................................................316.1核桃果实不同部位的多酚类物质分析比较.......................................316.2不同核桃青皮的多酚类物质分析比较...............................................316.3不同核桃青皮的酚类物质的抗氧化活性比较...................................31

11引言1.1核桃的概况1.1.1核桃的种类及分布核桃（JuglansregiaL）系被子植物门双子叶植物纲胡桃科（Juglandanceae）核桃属植物，原产于欧洲东南部、东亚及北美地区，是人类种植最古老的树生坚果之一[1,3]。

核桃属（JuglansL）植物分为三个组，核桃组（Sect.Julans）、核桃楸组（Sect.cardiocaryonDode）、黑核桃组（Sect.Nigra）总共有21个种，分布于亚洲、欧洲、美洲地区。

我国有4个种，分别为核桃楸（JuglansmandshuricaMaxim）、野核桃（JulanscathayensisDode）、铁核桃（JulanssigillataDode）、河北核桃（JulanshopeiensisHu）和1个变种[2,5]。

核桃又名胡桃、羌桃，与扁桃、腰果、榛子并列为世界四大干果，分布在世界上许多国家。

亚洲主要有中国、土耳其、印度、伊朗、日本、朝鲜等；欧洲主要有俄罗斯、英国、法国、德国、意大利、希腊、保加利亚、罗马尼亚；美洲主要有美国、智利。

我国核桃分布范围较广，以秦岭巴山山区、吕梁太行山区及燕山山区最为集中[2]。

1.1.2核桃的生产现状及保健功能在全球范围内，核桃在油脂类干果中产量较高，全世界常年产量达130万吨，居干果类的第一位。

世界上有三十多个国家发展核桃生产，目前栽培较广、较集中的国家有美国、土耳其、中国、意大利、前苏联、南斯拉夫、法国等二十多个国家。

美国是引进核桃树种栽培历史最短的国家，只有一百多年的时间，但其生产发展快、效益高。

其原因是他们注重核桃良种选育研究工作，经过30年的努力，培育出了适合美国发展的优良品种，建立品种园、采穗园、优良品种繁殖园等。

在全国范围内推广优良品种的种植，形成良种化栽培，采取嫁接繁殖、区域化发展和机械化生产，产量猛增，一跃成为世界核桃生产大国。

七十年代，美国从核桃进口国变为出口大国，占领世界市场，夺走了中国长期占领国际市场的席位。

美国南钻石公司生产的“钻石”核桃就是国际市场走俏的商品核桃，以其味美、核桃外观好、颗粒规范化而受到消费者的欢迎。

我国是核桃原产地之一，已有2000多年的栽培历史。

随着果树生产形势的发展和技术管理的加强，核桃生产正从过去的粗放、半放任的经营状态向科学管理、集约经营方向转变，通过普及推广核桃实用增产技术和优良品种，核桃的产量和品质都有了明显的提高，商品性状也有了较大的改善［63］。

2000年我国核桃产量约30万吨，是世界上核桃产量最大的国家，居世界首位［64］。

我国核桃种质资源丰富，在众多经济树种中,核桃以其用途多样、核仁营养丰富著称,在内销外贸中均占有重要地位[5]。

我国核桃大体分为两类，即南方核桃和北方

2核桃，南方核桃口感比较清香，北方核桃口感则比较涩。

唐代名医孟诜说，核桃“通经脉、润血脉、常服骨肉细腻光润”；明代大医学家李时珍把核桃的医药价值的概括为“补气养血、润燥化痰、益命门、利三焦、温肺润肠等”[2,4]。

1.2多酚类物质的结构、性质1.2.1多酚类物质的结构多酚是一组植物中化学元素的统称，因具有多个酚基团而得名，通常存在于植物性食物中，在一些植物中能起到呈现颜色的作用，具有潜在的促进健康作用，当前被称为“第七类营养素”。

酚类物质在植物中通常呈现为多种环状物的集合，即许多酚类物质在一起出现，因此被称为“多酚”。

多酚包括酚酸、类黄酮、异黄酮、花青素、单宁、花色苷等。

植物中多酚的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素[9]，是果树果实中含量较多的次生产物之一，是苯酚的衍生物，在植物中有着多方面的生理功能，几乎贯穿植物生长发育的每一个过程，是影响其生长发育的重要因素