几种常用的固定剂.docx

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几种常用的固定剂

几种常用的固定剂

固定剂最先应用在光学显微技术中，但光学显微镜中使用的沉淀凝集蛋白性的固定剂对电镜并不特别适用。

于是人们引入四氧化锇和中性甲醛进行固定。

早期的电镜生物样品化学固定法都采用四氧化锇单一固定，但四氧化锇不能很好地保存糖原和其它碳水化合物，而且四氧化锇在组织中的渗透速度比较慢（约2mm/h）。

而早期使用的中性甲醛也令人很不满意，因为早期使用的甲醛很不纯，含有甲酸和甲醇的残留（一般有10-15％），甲醇的存在对样品的保存很不利，于是后来人们改进了甲醛的制备方法，使用多聚甲醛新鲜配制甲醛，提高了它的纯度。

1963年Sabatini、Bensch和Barrnett推荐使用醛类（特别是戊二醛）作为初级固定剂。

使用戊二醛或戊二醛-多聚甲醛初步固定后再使用四氧化锇后固定的双重化学固定对大多数动物和植物组织都十分有效，因而成为目前大多数实验室常规的固定方法。

电镜中使用的固定剂都有毒性，操作时都要很小心，尽可能在通风橱中完成操作。

如果实验室中发生固定剂泄漏，必须立即用大量奶粉覆盖泄漏出来的溶液，待反应充分后收集处理。

四氧化锇（Osmiumtetroxide）

四氧化锇是一种很强的氧化剂，呈浅黄色结晶，分子量254，饱和水溶液的浓度为7.24％，它的水溶液为中性，有极大毒性。

市售有密封的四氧化锇晶体和四氧化锇水溶液两种。

四氧化锇晶体溶于水的速度很慢，必要时可以使用超声波设备来加速溶解。

市面上也有已经配制好的2％四氧化锇水溶液出售，使用相当方便。

但要特别注意的是无论是四氧化锇晶体还是水溶液都会挥发出四氧化锇气体，因此应将四氧化锇置于密闭容器（玻璃容器）中保存。

四氧化锇气体对呼吸系统有刺激，对眼睛有严重的破坏作用，因此在使用时应特别小心，尽可能在通风橱中进行，并且严格控制用量。

废弃的四氧化锇溶液应加入酒精水溶液或硫酸亚铁溶液，使四氧化锇转化为黑色沉淀，以降低毒性方便收集处理。

四氧化锇作为固定剂有如下优点：

1,四氧化锇可以与脂类、糖类和蛋白质反应。

其对脂类的固定作用可以补充醛类固定剂对脂类固定不足的缺点。

其反应方程式如下：

2,能增加膜的反差，起到"电子染色"作用。

用四氧化锇固定的材料，往往细胞膜结构比较清晰。

这是由于被还原的锇沉积在细胞膜结构上，而锇是一种原子序数较高的元素，能加强它们的电子散射（质量密度大），所以四氧化锇作为固定剂的同时，又可作为电子染料，使被固定的样品图像有较好的反差。

3,四氧化锇会破坏大部分细胞膜的半透膜特性，配制四氧化锇固定液不用考虑渗透压。

四氧化锇虽然具有以上优点，但它也存在不少缺点：

四氧化锇渗透力弱，所以组织块要小。

否则，将从组织块表面到中间形成一个固定梯度，致使内部自溶过程继续进行引起组织块内部固定不好。

不能保存糖原也不能有效固定核酸，而且对微管固定效果也不理想。

固定的时间不宜太长。

时间过长，会使组织变脆，给切片带来困难。

此外四氧化锇与蛋白质、不饱和脂肪酸交联形成的复合体都是易溶于水的物质，特别是在长时间的固定后，更易溶解。

因此，使用四氧化锇固定样品，时间控制在12小时较为适宜。

四氧化锇能与乙醇或醛类起氧化－还原反应，生成沉淀。

所以，醛类处理过的样品转入四氧化锇固定之前或四氧化锇固定之后转入乙醇溶液脱水之前都必须用相应的缓冲液充分漂洗干净。

四氧化锇是酶的钝化剂，不能用于细胞化学的研究。

醛类固定剂

甲醛（formaldehyde）

甲醛分子中只有一个碳原子，含有一个醛基，分子式为$CH_2O$，分子量为30。

市面上虽然有多种形式的甲醛溶液出售，但它们含有少量的甲酸和甲醇，对被固定的样品产生不良影响，适合电镜固定使用的只有通过由多聚甲醛（paraformaldehyde）新鲜制备的甲醛溶液。

甲醛溶液的毒性很大，即使是稀释液也要格外小心操作。

甲醛溶液对皮肤有硬化作用，长时间接触可能导致皮肤破裂、皮炎或是过敏症状；甲醛极易挥发，它对呼吸道也有影响，长时间暴露在甲醛气体中会使嗅觉敏感度降低；此外甲醛对眼睛也有影响，而且还被认为是致癌物质。

因此在操作甲醛粉末或溶液时都必须很小心，带上手套并在通风橱中进行。

少量废弃的醛类试剂（甲醛、戊二醛和丙稀醛等）可以直接在大量流水冲稀的情况下倒进水池内（但要注意有关部门的有关规定），当然少量的醛类试剂与过量的1M甘氨酸混合后，再在大量流水冲稀的情况下倒进水池，会更安全。

通常100ml的甲醛（1％）需要50ml的1M甘氨酸，100ml1％戊二醛则需要35ml，而丙稀醛需要40ml。

大量的醛类试剂必须集中回收处理。

甲醛作为固定剂有如下特点：

由于甲醛的分子量小，它的穿透能力比戊二醛强，反应温和，可用于细胞组织化学研究的前固定。

而且它不象戊二醛有两个醛基，引入较少的游离醛基到组织细胞中，因而在一些细胞组织化学研究中更有利。

但它的反应是部分可逆的，对细胞基质保存差，脱水后大部分基质丢失，所以不少实验室不单独使用甲醛来固定样品，而将它与戊二醛配制成混合固定液使用。

甲醛对生物样品的作用与戊二醛相似，主要引起蛋白质交联。

在水溶液中，单个的甲醛分子以HO−CH2−OH的形式存在。

反应如下：

与戊二醛不同，甲醛既与DNA又与核蛋白反应，但这些反应都是部分可逆的。

另外，甲醛固定脂类的能力不强，可以与脂类相连的蛋白质作用。

戊二醛（glutaraldehyde）

戊二醛是一种五碳醛，含有两个醛基。

分子式为$C_5H_8O_2$，分子量为100。

电镜固定通常用市售的25％的戊二醛水溶液稀释成需要的浓度。

其pH为4.0$\sim$5.0。

氧气、高温、中性或碱性pH均能使戊二醛发生聚合失去醛基，并降低交联效力，所以平时这种原液应保存在低温处。

此外戊二醛存放时间过长时，pH值会降低，颜色变黄，固定效力也大大降低，若戊二醛pH值降至3.5以下或含有其它杂质时，必须纯化后才能使用。

戊二醛对皮肤有硬化作用，但它的挥发性较甲醛弱，最好能在通风橱中操作。

戊二醛作为固定剂有如下特点：

它的反应速度快，是优良的前固定剂。

但它的渗透速度较慢，必要时配合甲醛使用效果更佳。

它是蛋白质的强固定剂。

它能快速而不可逆地与氨基反应，和甲醛相似，戊二醛的一个醛基与氨基反应，脱水后生成不稳定的Schiff键化合物。

其反应的可能途径如下：

由于戊二醛有两个醛基，它可以通过与相邻的另一氨基反应，而产生交联作用。

戊二醛的两个醛基也可能与同一氨基作用，形成环状结构，如下

这种环状结构可以进一步与另一戊二醛反应，生成丁间醇醛冷凝物（Aldolcondensate）。

这种化合物与氧分子共同作用，生成稳定的嘧啶类衍生物（Pyridinederivatives），并在此过程中发生交联。

与甲醛不同，戊二醛的这一步反应是不可逆的，而且需要氧气的参与。

由于大块的样品内部氧气供应不足，戊二醛在大块样品的内部无法形成稳定的生成物，会导致样品内部的固定效果不佳。

因而在使用戊二醛固定时，小块的样品固定效果较为理想。

戊二醛通过交联作用固定蛋白质的过程会伴随氢离子的释放，使样品pH值降低。

为了维持pH值稳定在最佳水平，在戊二醛的固定剂中要加入足量的缓冲液。

戊二醛能通过固定核蛋白来固定组织和细胞中的DNA和RNA，能保存糖原，也可以固定和蛋白质有关联的或含有氨基和亚氨基的脂类。

但是只使用戊二醛固定的样品无法阻止后面的脱水、渗透和包埋过程对样品脂类的抽提，因而对细胞膜的固定效果不理想。

戊二醛在固定过程中并不完全破坏细胞膜的半透膜特性，因而需要选择合适的固定液渗透压，以免造成固定假象。

但合适的固定液渗透压随被固定细胞和缓冲液的种类改变，很难找到一个通用的渗透压。

在实际操作中，$1.0\%-2.5\%$戊二醛（使用0.1M磷酸盐缓冲液或0.1M二甲胂酸盐缓冲液）在一般情况下，已经能提供理想的固定效果。

除非观察到明显的渗透压造成的假象，一般不对固定液专门进行渗透压调节。

用戊二醛前固定的样品不易变脆，可以进行长时间固定（但最好不要超过一个星期），因而适用于远离实验室或野外现场取材。

但戊二醛在稀释溶液中会自行发生一系列反应，因而固定液应尽可能新鲜配制中。

其它固定剂

醋酸铀（uranylacetate）既是一种固定剂又是一种染色剂。

它可以与磷酸基团反应，从而固定DNA和RNA，以及含有磷酸基团的磷脂，从而对膜结构的保存有帮助。

另外，它可以与蛋白中的酸性基团（如天冬氨酸残基、谷氨酸残基）和碱性基团（如赖氨酸残基）反应，从而起固定蛋白的作用。

但醋酸铀不能很好得保存糖原。

通常在使用了醛类固定剂和四氧化锇固定剂后，再使用$0.5-1.0\%$的醋酸铀水溶液，进行第三重固定。

操作醋酸铀时要特别注意，尽管市售的醋酸铀放射性不强，但它仍是一种潜在的致癌物。

醋酸铀应密封于棕色瓶阴凉处保存。

丙烯醛（acrolein）是一种三碳醛，含有一个醛基和一个双键。

它比甲醛和戊二醛活泼，渗透组织的速度也比甲醛和戊二醛快。

它可以很好地保存蛋白和磷脂，最好作为甲醛或戊二醛固定液的添加剂使用。

通常使用市售密封的100%丙烯醛液体，固定时使用的浓度小于1%。

它溶于水的速度慢，毒性很大，着火点低，储存和使用它都比上述另外两种醛类危险，非必要时不推荐使用。

丙烯醛非常活泼且挥发性很强，即使是操作稀释后的溶液也要格外小心，所有与丙烯醛相关的操作绝不能离开通风橱进行，并且最好有经验丰富的操作者在场指导。

丙烯醛适合于固定大块的样品，植物组织或有厚细胞壁的微生物样品，以及表面覆盖有几丁质或蜡质的样品。

但丙烯醛不适用于整个动物的灌注固定。

丹宁酸（Tannicacid）是一种从植物中提取的物质，泛指五倍子酸（gallicacid）糖苷或多聚糖苷。

大分子很难渗透到组织中，因此电镜中使用低分子量的丹宁酸。

丹宁酸既是一种强的固定剂，能固定许多蛋白以及糖类衍生物，又是一种媒染剂，能增强对重金属（如铀、铅）的吸收，从而增强样品反差，特别是细胞外膜、弹性纤维、细胞连接、肌肉纤维等。

由于丹宁酸渗透速度慢，通常只用作渗透速度快的固定剂的添加剂使用。

丹宁酸没有固定的用法，0.5-2.0%丹宁酸和0.5mg/ml皂角苷（saponin，增加丹宁酸的渗透速度）与2.5-4.0\%戊二醛一起使用可以得到良好的效果。

但固定时间要延长到3-4小时以上，并且推荐使用醋酸铀作第三重固定。

丹宁酸适用于灌注固定。

重铬酸钾（potassiumdichromate）在固定中有两种作用，一是缓冲作用，二是固定作用，帮助保存脂类和糖类。

在处理神经组织样品时，因为重铬酸钾能很好地保存髓磷脂，可与四氧化锇配合使用，作为第二重固定剂。

但需要注意的是，重铬酸钾是一种致癌物质，应小心操作。

高锰酸钾（potassiumpermanganate）可以与脂类反应，增强膜结构的反差。

可以保存DNA和糖原，但有一定的抽提作用，几乎无法固定细胞内的颗粒性或纤维状结构，可能会引入一些假象。

穿透性强，适用于有厚细胞壁或蜡质层包被的植物及昆虫样品。

使用时可以不加缓冲液，固定时间不宜太长，,0.5-1.0%高锰酸钾溶液固定30分钟到2小时。

附录二固定与染色

一、固 定

    细胞学实验的第一步应对观察之机体的组织先行固定，然后再作进一步的处理和研究（应用冰冻切片法事先可不经固定）。

（一）固定的目的

    1、尽量保持组织、细胞、内部结构及其成分的原来状态，并能较长时间的保存备用。

    2、固定后材料硬化，便于切削。

    3、固定是使细胞内含物发生必要的物理及化学变化，有利于进一步的染色处理，获得良好的制片效果。

    据此，固定剂应具备下述三点基本要求：

    ⑴能够迅速渗入组织内杀死细胞，并兼有保存作用。

    ⑵对于细胞内含物，特别是要研究部分要尽可能少产生变化，对于细胞和组织不发生或尽可能少发生膨胀和收缩作用，使其保持与生活时期相似的面貌。

    ⑶能够