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固定化酶技术

固定化酶在食品中的运用

摘要:

固定化酶有许多优点，尤其是稳定性和可重复使用性使其在许多领域得到广泛应用。

固定化酶技术是一门交叉学科技术，目前已得到长足的发展。

介绍了固定化酶制备的传统方法以及一些新方法，同时对酶在一些性能优良的载体上的固定进行了综述。

关键词：

固定化酶；制备；载体

酶是由活细胞产生的一类特殊的蛋白质催化剂（核酶除外），具有催化效率高、底物高度专一、反应条件温和、反应容易控制等特点。

酶的最大缺点是其不稳定性，在酸、碱、热及有机溶剂中易发生变性，活性降低或丧失；而且酶反应后，会在溶液中残留，造成酶反应难以连续化、自动化，同时也不利于终产品的分离提纯，这些都大大阻碍了酶工业的发展，所以有必要采取酶工程技术改善这些缺点。

酶工程技术措施较多，其中酶的固定化技术是重要举措之一。

酶的固定化是用人工方法把从生物体内提取出来的酶固定在特定的载体上或使酶与酶相交联，酶被限定在一定区域内，但仍保持原有高效、专一、条件温和的催化功能。

通常酶是游离的，而经过固定化以后，酶被束缚在一定区域内，因而这样的酶被称为固定化酶。

固定化酶在生物、医药、农业、食品、化工、能源开发、环境保护等方面得到了广泛应用。

本文介绍了固定化酶的制备方法和优缺点，对其在食品行业中的应用情况进行总结，最后对其应用前景进行展望。

1固定化酶的制定方法[1-5]

1.1吸附法

吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法。

吸附法较简便，酶活损失小，但酶与载体作用力小，易脱落。

物理吸附法是通过非特异性物理吸附作用，将酶固定到载体表面。

载体主要有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂白土、高岭土、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、陶瓷、金属氧化物、淀粉、白蛋白、大孔树脂、丁基或己基—葡聚糖凝胶、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。

离子吸附法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体通过静电作用相结合的一种固定化方法。

载体包含阴离子交换剂（如DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、纤维素-柠檬酸盐、TEAE-葡聚糖凝胶、AmberliteIRA-93、IRA-410、IRA-900等）和阳离子交换剂（如CM-纤维素、AmberliteCG-50、IRC-50、IR-45、IR-120、IR-200、XE-97、Dowex-50等）两大类。

1.2包埋法

包埋法可分为网格型包埋和微囊型包埋。

包埋法较简单，酶活回收率较高，但发生化学反应时，酶易失活，所以常采用惰性材料作载体；另外，包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶。

网格型包埋是将酶包埋在高分子凝胶细微网格中，载体材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂、淀粉、明胶、卡拉胶、火棉胶、胶原、大豆蛋白、壳聚糖、海藻酸钠和角叉菜胶等。

微囊型包埋是将酶包埋在高分子半透膜中，载体材料有硝酸纤维素、乙基纤维素、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙膜、聚酰胺、聚脲等。

1.3共价结合法

共价结合法包括载体共价结合和非载体共价结合。

共价结合法具有酶与载体结合牢固、不易脱落的优点，但反应条件苛刻、操作复杂、酶活回收率低，甚至酶的底物专一性有时也会发生变化。

载体共价结合又可分为两种：

一种是先将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生共价偶联反应，常用的载体有多糖类衍生物、氨基酸的共聚体、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、乙烯二马来酸共聚体，多孔玻璃、陶瓷、卤乙酰、二嗪基或卤异丁烯基衍生物等；另一种是先在载体上共价连接一个双功能试剂，然后将酶共价偶联到双功能试剂上去，常用的载体有氨基乙基纤维素、DEAE-纤维素、琼脂糖的氨基衍生物、壳聚糖、氨基乙基聚丙烯酰胺、多孔玻璃的氨基硅烷衍生物等。

非载体共价结合又叫交联法，是通过双功能或多功能试剂，使酶与酶之间相交联的一种方法。

此法不使用载体，作为交联剂的双功能或多功能试剂有戊二醛、甲苯-2，4-二异氰酸酯、双重氮联苯胺、N，N’-乙烯双马来亚胺、Tris等，其中最常用的是戊二醛。

1.4结晶法

结晶法是利用酶结晶而实现酶的固定化的方法。

对于晶体来说，载体就是酶蛋白本身。

结晶法提供了非常高的酶浓度，因此提高了单位体积的酶活力，对于活力较低的酶更具优越性；但在循环使用过程中，酶会有损耗，从而使得固定化酶浓度逐渐降低。

1.5分散法

分散法是使酶分散于水不溶相中，从而实现酶的固定化。

对于在水不溶的有机相中进行的反应，最简单的固定化方法是将酶干粉悬浮于溶剂中；但如果酶分布得不好的话，会引起传质现象，导致酶活力降低。

1.6热处理法

热处理法是将含酶的细胞在一定的温度下加热一段时间，使酶固定在菌体内的固定化方法。

热处理法只适合热稳定性较好的酶。

在加热处理时，要掌握好温度和时间，以免引起酶的变性失活。

1.7其它方法

1.7.1纳米技术处理　

即将酶与纳米材料相结合，制备成纳米固定化酶。

由于纳米材料的特殊理化效应，纳米固定化酶可以提高酶活性、优化酶的理化性质、加快酶反应速度、提高酶稳定性等，进而可提高酶的利用率和生产效率。

1.7.2超声波处理　

利用超声波使高分子主链均裂，产生自由引发功能性单体，再聚合成嵌段共聚物载体来固定酶。

1.7.3磁处理　

磁性体Fe3O4与聚苯乙烯、含醛基聚合物等载体一起溶解混合后，再除去溶剂，可获得磁性载体。

磁性高分子微球是指内部含有磁性金属或金属氧化物（如铁、钴、镍及其氧化物），而具有磁响应性的超细粉末，也可作为磁性载体。

磁性载体固定化酶具有磁响应性，可借助外部磁场简便地进行酶回收。

1.7.4电处理　

电聚合物作为酶固定化载体时，特别有利于酶电极类生物传感器的制备，这方面的应用目标主要是生物医学检测。

1.7.5辐射处理　

γ射线引发丙烯醛与聚乙烯膜接枝聚合后，活性醛基可共价固定化葡萄糖氧化酶。

CO60辐照冰冻态水溶性单体与酶的水溶液混合体时，将使单体聚合与酶固定化同步完成，其回到常温时，因冰融化而形成的多孔结构非常有利于底物与产物的扩散，并可提高酶的活性。

1.7.6等离子体处理　

用等离子体活化处理聚丙烯膜接枝丙烯酸后，可用于固定化胰蛋白酶，等离子体引发的丙烯酰胺聚合可包埋固定葡萄糖氧化酶。

此外，还有制备光敏载体、温敏载体、阵列式微囊载体等固定化酶的方法。

上述各种方法各有其优缺点，实际应用时，常将两种或多种方法结合使用，例如吸附-交联法、包埋-交联法等。

2固定化酶的优缺点[1-2]

2.1固定化酶的优点

与游离酶相比，固定化酶具有以下优点：

酶的稳定性提高，对温度和pH的适应范围增大，对抑制剂和蛋白酶的敏感性降低；酶反应条件容易控制，反应完成后，酶回收较简单，可重复使用，同时便于产品的分离和纯化，提高产物质量；可实现批量或连续操作，适于产业化、连续化、自动化生产。

2.2固定化酶的缺点

固定化酶也存在以下局限性：

酶活力有所损失；较适合于小分子底物，大分子底物基本无法进行反应；不适于多酶反应体系。

3固定化酶在食品工业中的应用

3.1固定化酶在果汁中的应用

柑橘类产品加工中出现苦味是柑橘加工中的重要问题。

造成苦味的物质有两类：

一类为柠檬苦素的二萜烯二内酯化合物（A环和B环）;另一类为果实中的黄酮苷。

脱苦的方法主要有吸附法和固定化酶法。

吸附法是一次去除苦味物质，而固定化酶法主要是利用不同酶分别作用于柠檬苦素和柚皮苷，生成不含苦味的物质。

工业上采用固定化柚皮苷酶减少柑橘类果汁中的柚皮苷含量，Tsen等[6]在1989年使用甲壳素固定柚皮苷酶，并研究了固定化的动力学因子。

Manjon等[7]使用空心玻璃床作为载体，分别在1977年使用DEAE-Sephadex，1978年使用单宁-2-氨基乙基纤维作为载体。

1996年Puri等使用海藻糖，1998年Soures等[8]使用醋酸纤维和三醋酸纤维制成膜固定酶。

3.2固定化酶在食品添加剂和配料中的应用

固定化酶技术广泛应用于生产食品添加剂和配料的行业中。

如：

低聚果糖、天门冬氨酸、L-苹果酸、阿斯巴甜、酪蛋白磷酸肽（CPP）等，举例如下：

低聚果糖作为一种保健食品受到人们越来越多的重视，Jong等[9]等用固定化酶生产低聚果糖，30天后酶活性仅损失了8%，产率达到1174g/L·h，所用蔗糖浓度为600g/L，进料速率2.7h-1，反应温度50℃。

Chantal等[10]进一步优化了固定化酶法生产低聚果糖的工艺：

pH5.5，温度55℃，蔗糖浓度750g/L，酶浓度5U/g蔗糖，产物浓度达到588g/L。

以富马酸为原料，天门冬氨酸和L-苹果酸都可以采用固定化酶生产。

有文献报道，使用由大肠杆菌得到的天门冬氨酸酶催化富马酸与氨作用，可以得到L-天门冬氨酸，固定化富马酸酶将富马酸转化为苹果酸。

一个10m3的固定化细胞柱每月可生产数吨L-天门冬氨酸和L-苹果酸。

L-天门冬氨酸可以进一步生产阿斯巴甜，阿斯巴甜是二肽甜味剂，在工业上用化学合成。

现在，已开始酶法合成，用固定化酶进行藕合反应，得到阿斯巴甜。

吴思方等[11]通过正交试验确定了固定化酶酶解酪蛋白生成活性肽CPP的最佳工艺条件，并生产得到了粗制CPP产品。

作者使用自制的固定化胰蛋白酶，在酪蛋白浓度2%、pH7.5、温度50℃、时间2.5h条件下取得了最佳的水解效果。

产品经过调整pH，离心等操作进行粗制，最终检测：

α-CPP分子量为5000，含量11%，β-CPP分子量为3300，含量4%，总磷为3.64%，总氮为6.97%，氮磷比（N/P）4.23。

王筱兰等[12]固定了来源米曲酶的β-半乳糖苷酶，在纤维床反应器中连续生产半乳糖寡糖。

并确定了连续生产半乳糖寡糖的最佳工艺条件为底物浓度400g/L，反应温度50℃，pH6.0，停留时间40min。

在连续反应36h时，加入1.5%D-半乳糖，半乳糖寡糖的得率由39.6%提高到66.2%，固定化酶反应器能基本稳定地操作96h。

吴定等[13]将壳聚糖溶解于20%的盐酸，配成25%的壳聚糖溶液，然后用注射器注射到含15%氢氧化钠和30%甲醇混合溶液中凝结成2mm左右的中空球形壳聚糖。

经4%的戊二醛活化的中空球形壳聚糖分别与α-葡萄糖转苷酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、切枝普鲁兰酶在室温反应2h，4℃静置过夜，制备固定化酶。

固定化酶的最适pH值约降低1单位，最适温度提高约10℃。

固定化α-淀粉酶和β-淀粉酶的相对酶活力分别为7.2%和22.3%。

四种不同的固定化酶重组构成酶催化反应器，生产低聚异麦芽糖含量达38.9%。

采用生物酶法，还可以从D，L-氨基酸中生产L-氨基酸。

D，L-氨基酸首先被转化为酰基-D，L-氨基酸，然后用固定化氨基酰化酶进行拆分得到光活性的L-氨基酸和完整的酰基-D-氨基酸。

D-氨基酸再消旋化、重新拆分处理即可得到L-氨基酸。

日本的TanabeSeiyaku公司有使用10m3的固定化氨基酰化酶柱，进行氨基酸拆分操作，每月可以生产520吨L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸。

3.3固定化酶在乳制品生产中的应用

牛奶中含有一定量的乳糖，有些人体内缺乏乳糖酶，在饮用牛奶后常出现腹泻、腹胀等症状；另外，由于乳糖难溶于水，常在炼乳、冰淇淋中呈沙样结晶析出，影响风味。

乳糖酶可将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖，如将牛奶用乳糖酶处理则可解决上述问题。

Fernandes等[14]研究用琼脂糖作载体，固定来源于南极的冷适应菌的β-半乳糖苷酶，并应用于牛奶中乳糖的降解，生产低乳糖牛奶；Caterina等[15]运用固定化技术，研究牛奶中碱性磷酸酶的耐热性；Mona等[16]研究用离子吸附法固定来源于Bacilluslicheniformis5A1的牛奶凝结酶，并用于干酪生产。

3.4固定化酶在啤酒澄清中的应用

啤酒以其清晰度高、泡沫适中、营养丰富和口感好成为人们的最佳选择。

但是，由于啤酒中含有一定量的蛋白质，它与游离于啤酒中的多酚、单宁等结合产生不溶性胶体或沉淀，造成啤酒混浊，从而严重影响了啤酒的质量。

温燕梅等[17]采用吸附—交联法，使胰蛋白酶先吸附于磁性胶体粒子表面，后用戊二醛双功能试剂交联，形成“酶网”裹着载体形成固定化酶，该磁性酶对啤酒澄清防止冷浑浊有明显效果。

赵炳超等[18]在戊二醛做交联剂的条件下，以介孔分子筛MCM248作载体固定化木瓜蛋白酶，所得固定化酶的热稳定性有了显著提高，固定化酶的pH值稳定性和储藏稳定性也有了明显改善。

3.5固定化酶在茶叶加工中的应用

茶饮料质量的提高一方面是通过去除异味，提高适口性；另一方面是提高营养价值，提高人体对有益成分的吸收率。

目前，固定化酶法已经开始应用于茶饮料中，并从上述两方面均取得了良好的效果。

比如：

固定化的单宁酶和果胶酶。

单宁酶是一种水解酶，可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚酸键。

将单宁酶应用于茶叶饮料可以改善茶饮料的品质。

Lauren等[19]报道用固定化的单宁酶处理红茶，提高茶汤中可溶性铁和钙的含量。

若在绿茶加工中使用单宁酶，可以部分消除夏秋茶苦涩味道，提高茶饮料品质。

果胶酶是作用于果胶质的D-半乳糖醛酸残基之间的糖苷键，使高分子的聚半乳糖醛酸降解为小分子物质。

茶叶中的水溶性果胶，与茶叶的品质密切相关。

伊军峰[20]采用果胶酶对茶汁降解作用进行研究，找出果胶酶的最佳工艺，得到果胶酶提高茶汁膜分离性能的结论。

刘新民[21]等用海藻酸钠、二醋酸纤维、明胶分别作为固定化果胶酶的载体，比较载体的用量、交联剂的浓度、酶量、pH等，结果表明：

选择15%浓度的明胶为载体，5%浓度的戊二醛为交联剂，酶量5%，在pH3.5下制备固定化果胶酶，其活力回收率可以达到67.74%，重复回收使用10次后，酶活力还可以保留80%以上。

张应玖等[22]研究重氮化的对氨基苯磺酰乙基纤维素为载体制备固定化果胶酶的最佳条件。

研究发现：

在pH4.6，0.15M磷酸盐缓冲液中，按照每克载体加入2163活力单位的酶的比例进行偶联反应12h，PH4.6转移至pH4.2，最适温度变宽，酶热稳定性增强，半衰期为32.5天。

3.6固定化酶在生物传感器中的应用

生物传感器被认为是一种由受体、抗体或酶构成的生物感应层于换能器紧密连接而能提供环境组成信息的感应器。

如：

测量电流以及电位的酶电极，酶热敏电阻装置，以场效应管为基础的生物传感器，及以生物发光及化学发光为基础的纤维-光学传感器，它们都应用不同类型的固定化酶。

固定化葡萄糖氧化酶传感器是其中应用的为广泛的一种。

1967年，Clark[23]采用固定化酶技术，把葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上再和氧电极结合，组装成第一个酶电极—葡萄糖电极。

利用活蚕液状丝素蛋白的变性作用制备的葡萄糖氧化酶传感器，具有酶活性损失小，稳定性高，响应速率快及使用寿命长等优点。

唐芳琼等[24]将纳米颗粒引入到葡萄糖电极研究中，并用易成膜的PVB作辅助膜基质，进行GOD的固定化研究。

实验结果表明，利用纳米颗粒的表面效应可以显著提高GOD酶电极响应灵敏度。

目前，制药厂将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和一种显色剂一起固定在试纸上，制成检验妇女是否妊娠的试纸，断定该妇女是有血糖、尿糖还是妊娠。

这种检测技术十分简单，操作十分方便，应用极为广泛。

用聚丙烯酰胺包埋葡萄糖氧化酶与氧电极组装成酶电极也可用来进行临床的血糖检测，并且可连续测定1000次血糖样品，低温存放180天保持90%的酶活力。

酶传感器的问世不仅使食品成分的快速、低成本、高选择性分析测定成为可能，而且生物传感器技术的持续发展将很快实现食品生产的在线质量控制，降低食品生产成本，给人们带来安全可靠及高质量的食品。

有文献报道使用单胺氧化膜和氧电极组成的酶传感器测定猪肉的新鲜程度，反应时间4min，单胺测定线性范围为（25）×10-5mol/L。

日本农林水产省研制出一种滋味传感器，可以品尝肉汤的风味，用于肉汤生产过程质量的控制。

还可以采用电导型生物传感器检测食品中有机农药的污染。

另外，有报道显示用聚丙烯酰胺凝胶包埋细菌电极可快速测定污水中的BOD。

3.7固定化酶在油脂改性中的应用

脂酶可以催化酯交换、酯转移和水解等反应，在油脂工业中被广泛应用。

Meron等[25]研究用尼龙和纤维素酯固定来源Candidacylindracea的脂酶，对一种巴西棕搁油进行酶解改性制备代可可脂；Rao等[26]研究用固定化Rhizomucormiehei的脂酶LipozymeIM60催化酸解鳕鱼肝油，制备富含ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸的结构脂；赵海珍等[27]从五种脂酶中筛选出来自T·languginosa的固定化脂肪酶LiopzymeTLIM，此固定化酶催化改造猪油制备功能性脂的效果最好。

3.8固定化酶在食品分析与检测中的应用

传感器是一种能将被测量的信号转换成为可输出信号的装置，固定化酶生物传感器是将固定化酶作配基组装的生物传感器，可用于食品分析与检测。

Adanyi等[28]研究了三组固定化酶多酶生物传感器，可用于乳制品中乳糖以及添加的葡萄糖、淀粉等的检测；Anjan等[29]研究共固定化L-谷氨酸盐氧化酶和L-谷氨酸盐脱氢酶生物传感器，用于食品中L-谷氨酸单钠的检测；Meera[30]研究流动注射分析系统固定化柠檬酸裂解酶和草酰乙酸脱羧酶生物传感器，用于检测果汁中的柠檬酸盐含量；Michael等[31]研究用溶胶固定乙酰胆碱酶和细胞色素P450BM-3突变株，制备双酶传感器，用于食品中磷硫盐杀虫剂的检测。

4固定化酶的发展方向

随着生物技术的迅速发展，固定化酶在工业中的应用日益广泛，从前述数例可见，固定化酶在上述的食品生产中起着举足轻重的作用，它简化了工艺、降低了成本、减少了污染，特别是用化学工艺很难进行的操作，用固定化酶较容易解决了。

随着生物技术以及材料、化工等各相关学科的发展，相信固定化酶的工作会有新的突破，它的应用前景也将会更加美好。

但是，并不是说一切可以使用酶的地方，都可以使用固定化酶来代替。

即使可以使用固定化酶，也需要在经济方面进行核算，选择最佳的方案。

鉴于目前已经取得的研究成果，下一步的研究可以从如下几个方面继续进行：

4.1建立多酶固定化系统

固定化酶有许多粗酶液没有的特点，但制备固定化酶首先要经过大量复杂的分离、纯化工作，而且一种固定化酶只能用于特定的单步反应。

应这种要求，工业生产中越来越多地应用了固定化细胞技术。

这样就省去了酶分离纯化的时间和费用;并可同时进行多酶反应;而且可以保持酶在细胞中的原始形态，增加了酶的稳定性。

4.2探索新型载体

进一步对天然高分子载体的不断挖掘和探究，对其进行改性，或利用超临界技术、纳米技术、膜技术等来固定化酶，解决固定化酶的稳定性和高效性。

4.3开发新型、高效固定化酶反应器

一方面反应器还应该包括酶辅因子再生系统，保证需要辅酶的酶正常发挥作用；另一方面直接将使用遗传工程技术培养的优良菌株、固定化技术和连续反应器巧妙结合，简化生产过程。

参考文献

[1]彭志英.食品酶学导论[M].北京:

中国轻工业出版社,2002.

[2]罗贵民,曹淑桂,张今.酶工程[M].北京:

化学工业出版社,2002.

[3]李彦峰,李军荣,伏莲娣等.固定化酶的制备及应用[J].高分子通报,2001

（2）:

13~17.

[4]钱军民,张兴,吕飞等.酶固定化载体材料研究新进展[J].化工新型材料,2002,30（10）:

21~24.

[5]曾晓雄.纳米技术在食品工业中的应用研究进展[J].湖南农业大学学报,2007,33

（1）:

90~95.

[6]TsenHY,TsaiSY,YuGK.FiberentrapmentofnaringinasefromPenicilliumsp.andapplicationtofruitjuicedebittering[J].JournalofFermentation&Bioengineering.1989,67,（3）:

186189.

[7]ManjonA,IborraJL,RomeroC,CanovasM.Propertiesofpectinesteraseandendo-D-polygalacturonasecoin-mobilizedinaporousglasssupport[J].AppliedBiochemistry&Biotechnology.1992,37,

（1）:

1931.

[8]PuriM,MarwahaSS,KothariRM.Studiesontheapplicabilityofalginate-entrappednaringinaseforthedebitteringofknowjuice[J].Enzyme&MicrobialTechnology.1996,18,（4）:

281-285.

[9]JongSooLee,YoungJunCho,iIlHanKim,ByongH.Lee.Purificationandcharacterizationofbeta-galactosidasefromal-kalophilicandthermophilicBacillussp.TA-11[J].Biotechnology&AppliedBiochemistry.1995,22,

（2）:

191201.

[10]ChantalC,ParkYS,ShiZP,ShibaS,IijimaS,KobayashiT.Applicationoffuzzyreasoningtocontrolofglucoseandethanolconcentrationsinbakers'yeastculture[J].AppliedMicrobiology&Biotechnology.1992,38,（5）:

649655.

[11]吴思方,汤亚杰,方尚玲.固定化酶生产活性肽CPP研究[J].食品科学,1999,12:

1518.

[12]王筱兰,王白杨,蔡友良.固定化酶连续生产半乳糖寡糖[J].南昌大学学报（工科版）,2001,23（4）:

8790.

[13]吴定,邹耀洪,王云,陈爱英,姚明兰.固定化酶生产低聚异麦芽糖工艺研究[J].食品科学,2005,26（3）:

125-127.

[14]FernandesS,GeuekeB,DelgadoO,etal.β-Galactosidasefromacold-adaptedbacterium:

purification,characterizationandapplicationforlactosehydrolysis[J]·AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2002,58（3）:

313~321.

[15]CaterinaD,ErminioM,MariaFF,etal.Theuseofenzymesforthermalprocessmonitoring:

modificationofmilkalkalinephosphataseheatresistancebymeansofanimmobilizationtechnique[J].FoodControl2004,15:

427~433.

[16]MonaAE,YannickCB·ImmobilizationofBacilluslicheniformis5A1milk-clottingenzymeandcharacterizationofitsenzymeproperties[J]WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology,2006,22（3）:

197~200.

[17]温燕梅，邱彩虹.吸附—交联法固定胰蛋白酶及在澄清啤酒中的应用[J]