逆转录病毒介导的小鼠MLLAF9白血病模型的建立.docx

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逆转录病毒介导的小鼠MLLAF9白血病模型的建立

逆转录病毒介导的小鼠MLL-AF9白血病模型的建立

许思苗，杨漾，周密，赵雪娇1，秦宇1，张沛凌，原瑞凤，周剑峰，方勇1*

【摘要】摘要本研究旨在建立逆转录病毒介导的小鼠MLL-AF9白血病模型，为深入研究MLL白血病的发病机制和治疗策略奠定基础。

采用免疫磁珠分选法分离CD45.2小鼠骨髓c-Kit+细胞，用携带MSCV-MLL-AF9载体的逆转录病毒感染c-Kit+细胞，体外培养后经尾静脉注射入致死剂量照射的CD45.1受体小鼠体内，用PCR、流式细胞术、形态学等方法鉴定成模情况。

结果表明，MLL-AF9逆转录病毒可以成功感染c-Kit+细胞，感染后细胞克隆形成能力强，细胞呈髓系原始幼稚形态，高表达Gr-1、Mac-1等髓系标志，MLL相关基因Hoxa9、Meis1表达升高。

移植MLL-AF9细胞后的受体小鼠，于6至12周出现白血病样体征，外周血涂片、骨髓细胞甩片、肝脏和脾脏组织切片均显示有大量白血病细胞浸润，骨髓和脾脏细胞中CD45.2群细胞高表达Gr-1、Mac-1等髓系标志，小鼠在12周内死亡。

结论：

成功建立逆转录病毒介导的小鼠MLL-AF9白血病模型，可应用于后续实验研究。

【期刊名称】中国实验血液学杂志

【年（卷）,期】2013（021）005

【总页数】7

【关键词】关键词逆转录病毒；MLL-AF9融合基因；急性髓系白血病；小鼠模型

·论著·

混合谱系白血病（mixedlineageleukemia,MLL）是一类由于人类11q23染色体异常导致的造血系统恶性肿瘤，可见于10％的儿童和成人急性淋巴细胞白血病（ALL）、急性髓系白血病（AML）患者，以及50％以上的婴幼儿ALL患者。

MLL白血病具有恶性程度高，化疗效果差，缓解率低，预后不良的临床特点，近年来的研究显示，MLL白血病因其独特的基因表达谱，已成为区别于普通ALL和AML的一种特殊类型的白血病[1]。

位于11q23染色体上的MLL基因发生不同类型的重排是这类白血病的特征性遗传学改变，目前已发现有超过100种的重排形式以及60多个不同的伙伴基因，其中较为常见的MLL融合伴侣为AF4、AF9和ENL[2]，而MLL-AF9融合最为多见，占所有AML患者的2％-5％，在儿童初发AML患者中占25％[3]。

这种遗传学异常可能在MLL白血病的发病机制中起着重要的作用，因此建立具有相关融合基因的小鼠白血病模型，对研究这类白血病的发病机理、病程进展、药物疗效和靶向治疗方面具有十分重要的意义[4]。

应用逆转录病毒感染小鼠骨髓造血干细胞的小鼠骨髓移植模型，近年来仅见于国外的白血病实验研究，国内尚未报道，本文将建立利用含MLL-AF9的逆转录病毒感染小鼠骨髓c-Kit+细胞，形成MLL-AF9白血病细胞株并移植小鼠的MLL白血病模型，为后续MLL白血病的信号通路和治疗靶点的研究奠定基础。

材料和方法

材料

C57BL/6J（CD45.2）小鼠和B6.SJL（CD45.1）小鼠，6-8周龄，SPF级，购自北京华阜康生物公司或中国医学科学院血液学研究所；逆转录病毒质粒MSCV-neo-MLL-AF9由MichaelL.Cleary教授惠赠，包装质粒VSVG、pKat购自addgene；小鼠急性粒-单核白血病细胞株WEHI-3购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；M3231培养基购自加拿大StemCellTechnologies公司；DMEM、IMDM培养基，胎牛血清，β-巯基乙醇购自美国Gibco公司；重组小鼠干细胞生长因子（mSCF）、重组小鼠白介素-3（mIL-3）、重组小鼠白介素-6（mIL-6）、重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（mGM-CSF）均购自美国PeproTech公司；DNA、RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；PCR及Realtime-PCR试剂购自北京全式金生物技术公司；CD117磁珠抗体购自美天旎公司；流式抗体c-Kit、Gr-1、Mac-1、B220、CD3均购自美国eBioscience公司；吉姆萨染色试剂购自北京赛驰生物科技公司；G418购自美国Sigma公司，lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司。

逆转录病毒上清的制备

将MSCV-neo、MSCV-neo-MLL-AF9质粒和包装质粒VSVG、pKat在lipofectamine2000的介导下转染293T细胞，48h后收集第一批病毒上清，72h后收集第2批病毒上清，离心过滤，-80℃保存备用。

小鼠骨髓细胞的制备和CD117+细胞的分选

颈椎脱臼法处死小鼠，取其股骨胫骨，用含2％FBS的PBS反复冲洗骨髓腔，1×108细胞和20μlCD117磁珠抗体冰上孵育15min，用500μl2％FBS的PBS重悬，入MACS磁柱，经重力作用流尽，洗脱3次，取下磁柱，冲出吸附于柱子上的细胞，即为CD117+细胞。

逆转录病毒感染细胞和阳性细胞的筛选培养

分选出的CD117+细胞在I20/20培养液里（IMDM、20％FBS、20ng/mlIL-3、20ng/mlIL-6、50ng/mlSCF、20％WEHI-3细胞上清、双抗、50μmol/Lβ-巯基乙醇）中培养过夜，加入病毒上清，32℃，650×g离心2h，继续在I20/20培养液培养过夜，第2天重复感染1次。

经感染后的细胞在含20ng/mlSCF,10ng/mlIL-3,IL-6、GM-CSF和1mg/mlG418的M3231培养液中筛选培养7-10d，将筛选出的抗G418的阳性克隆传至撤掉G418的含细胞因子的M3231培养液中进行第2轮至第4轮培养，每轮5-7d。

4轮结束之后，将细胞传至I20/20培养液中培养。

基因组DNA的抽提、PCR扩增、realtime-PCR

细胞基因组DNA使用QIAampDNAMiniKit提取，按全式金PCR试剂盒进行PCR扩增，PCR引物序列：

MLL-AF9，上游5′-AACCACCTCCGGTCAATAAGC-3′，下游5′-TTCACGATCTGCTGCAGAATG-3′；GAPDH，上游5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-T-3′，下游5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。

细胞基因组RNA使用RNeasyMicroKit提取，按全式金RT-PCR试剂盒进行逆转录，所得cDNA作为模板进行realtimePCR，引物序列：

Hoxa9，上游5′-GGAATAGGAGGAAAAAACAGAAGAGG-3′，下游5′-TGTATGAACCGCTCTGGTATCCTT-3′；Meis1，上游5′-TCACCACGTTGACAACCTCG-3′，下游5′-GCTTT-CTGCCACTCCAGCTG-3′。

细胞表面标志的流式细胞术检测

取5×105细胞，与c-Kit-PE、Gr-1-PE-CY7、Mac-1-APC、B220-APC、CD3-PE-CY7抗体，4℃避光孵育30min，PBS洗涤2遍，应用LSRⅡ流式细胞仪分析样品。

Giemsa染色

取PBS重悬的细胞，将细胞密度调整至5×105/mL，取20μl于载玻片上，600×g离心3min，制成细胞涂片。

滴3-5滴染色液和8-10滴磷酸盐缓冲液于细胞涂片或外周血涂片上，放置室温15min，流水冲尽，镜检。

小鼠移植实验

B6.SJL小鼠经2次4.5Gy照射，2次间隔时间4h，第2次照射后4h，进行移植实验。

移植前分离正常B6.SJL小鼠全骨髓细胞作为保护细胞，每只受照射的小鼠通过尾静脉注射1×106目的细胞和5×105保护细胞。

清洁级饲养，给予含抗生素的饮用水以防照射后感染的发生。

统计学处理

所有数据均采用均数±标准差表示，采用SigmaPlot10.0软件处理。

组间数据比较采用配对t检验，以P﹤0.05为差异有统计学意义。

结果

MLL-AF9融合基因的鉴定

用包装携带MSCV-neo-MLL-AF9载体的逆转录病毒感染小鼠骨髓c-Kit+细胞，以携带MSCV-neo病毒感染的c-Kit+细胞为对照，在含有G418和髓系细胞因子的甲基纤维素半固体培养基中筛选培养7d（round1）后，撤除G418继续培养2至4轮（round2-round4），最后传至液体扩增体系继续培养，以形成细胞系。

提取2种细胞基因组DNA进行PCR检测，结果显示：

对照细胞不表达MLL-AF9基因，携带MSCV-neo-MLL-AF9病毒感染后细胞可以成功表达MLL-AF9基因（图1）。

MLL-AF9白血病细胞的形态以及免疫表型

取对照细胞和MLL-AF9细胞，甩片固定并经Giemsa染色，在显微镜下观察可见对照细胞分化成熟，核成杆状或分叶（图2A）；MLL-AF9细胞多呈原始幼稚形态，核大，胞浆少（图2B）。

流式细胞术检测2种细胞表面抗原，结果显示MLL-AF9细胞低表达造血祖细胞标志c-Kit（即CD117），高表达髓系标志Gr-1（即Ly-6G）和Mac-1（即CD11b），不表达B系标志B220和T系标志CD3，而对照细胞高表达祖细胞标志c-Kit，不表达髓系和淋系标志Gr-1、Mac-1、B220和CD3（图3）。

MLL-AF9融合基因对c-Kit+细胞集落形成能力的影响

经逆转录病毒感染后的c-Kit+细胞，培养第2至4轮（round2-round4）时，细胞集落形成实验结果显示，MLL-AF9细胞集落形成能力明显高于对照细胞（P<0.001，图4）。

MLL白血病相关基因的表达

实时定量RT-PCR的方法检测对照细胞与MLL-AF9细胞Hoxa9和Meis1的mRNA表达结果显示，MLL-AF9细胞的Hoxa9和Meis1的mRNA表达量分别是对照细胞的2.92±0.21倍和4.71±0.33倍，具有显著的统计学差异（P<0.001）（图5）。

这与文献报道MLL-AF9白血病细胞中Hoxa9和Meis1表达增加[5,6]一致。

MLL-AF9小鼠的白血病表现

将对照细胞、MLL-AF9细胞分别经尾静脉注射植入致死剂量照射的B6.SJL（CD45.1）小鼠体内，以MLL-AF9小鼠外周血CD45.2细胞达30％以上为发病标准，观察发病小鼠外观和脾脏大小。

结果显示，对照细胞组小鼠体态正常，毛发光亮（图6A），MLL-AF9细胞组小鼠行动迟缓，弓背，竖毛，厌食（图6B）。

解剖可见，MLL-AF9组小鼠脾脏较对照组小鼠脾脏明显增大（图6C）。

外周血白细胞计数结果显示，MLL-AF9组小鼠外周血白细胞明显升高，与对照组小鼠差异明显，P<0.01（图6D）

取发病小鼠外周血、骨髓、肝脏、脾脏，经姬姆萨染色或组织化学染色后，显微镜下观察。

外周血涂片和骨髓细胞甩片结果显示，对照组小鼠外周血和骨髓中可见各阶段粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，MLL-AF9组小鼠外周血和骨髓中以原始幼稚细胞为主。

肝脏组织切片结果显示，对照组小鼠肝小叶和汇管区结构清晰，肝细胞形态正常，MLL-AF9组小鼠肝汇管区可见大量原始幼稚细胞浸润。

脾脏组织切片结果显示，对照组小鼠脾脏淋巴小结结构完整，淋巴细胞形态正常，MLL-AF9组小鼠脾脏中见大量原始幼稚细胞浸润，淋巴小结、脾索等结构被破坏（图7）。

取发病小鼠骨髓和脾脏细胞，检测细胞表面抗原结果显示，MLL-AF9小鼠骨髓CD45.2细胞占70％以上，脾脏CD45.2细胞占40％以上，且CD45.2群细胞高表达Gr-1、Mac-1，部分表达c-Kit，提示MLL-AF9小鼠发生髓系白血病（图8），而在同时期的对照小鼠骨髓和脾脏细胞中，均检测不到CD45.2细胞。

MLL-AF9小鼠的生存期

移植对照细胞和MLL-AF9细胞后小鼠的生存期的观察结果显示，移植MLL-AF9细胞组在移植后100d内陆续发病死亡，而对照组生存状态良好直至观察期结束（120d）（图9）。

讨论

目前，国际上建立的MLL白血病动物模型主要有以下3种：

①将人的MLL白血病细胞移植入免疫缺陷小鼠（NOD-SCID鼠）体内的模型，此类模型的优点是细胞来源于人，能更好的模拟人类白血病的发生发展，缺点是不能完全重现人类白血病的临床表型，并且移植细胞的多样性会导致模型的变异和不稳定；另外，NOD-SCID小鼠寿命较短也是这类模型的缺陷之一。

②含MLL融合基因的逆转录病毒感染小鼠骨髓祖细胞，使其转化为白血病细胞后移植入致死剂量照射小鼠的模型，这类模型的优点是白血病细胞可以大量获得，转化移植技术操作简单灵活，而融合基因表达的不可调控性和易产生的插入突变是该模型的致命缺点。

③MLL白血病转基因小鼠的模型，此类模型的优点是基因表达可以通过内源性的启动子进行调控，缺点是耗时长、花费高、技术难度大，此外，敲入基因的整合位点对基因表达的影响也是该模型需要考虑的问题[7,8]。

结合国内外研究现状，本课题组构建了逆转录病毒介导的小鼠MLL-AF9白血病模型。

国外文献报道中建立MLL-AF9模型有以下两种逆转录病毒载体，一种是带绿色荧光蛋白的MLL-AF9-GFP载体，包装出的逆转录病毒感染小鼠骨髓祖细胞后，细胞带有GFP荧光，可以直接移植入小鼠体内，或是经流式分选出感染成功的细胞后进行移植[9,10]。

另一种是带有新霉素筛选标记的MLL-AF9-neo载体，包装出的逆转录病毒感染小鼠骨髓细胞后，在体外含细胞因子的条件培养液中筛选培养3至4轮，得到纯白血病细胞后移植入小鼠体内[11,12]。

考虑到逆转录病毒感染效率低，流式分选污染几率高且效果有限，因此含GFP载体的逆转录病毒感染过的细胞在体内是否能形成稳定增殖的白血病细胞无法预估。

综合考虑，本课题组采用含新霉筛选标记的载体包装逆转录病毒，在体外经过筛选培养形成稳定的细胞株后移植入小鼠体内，建模成功几率更大；并且经培养得到的白血病细胞株在MLL白血病的体外研究中也能起到重要的作用。

由于采用了不带GFP荧光的逆转录病毒模型，建立成功的MLL-AF9白血病细胞株移植入小鼠后，受体小鼠内的供体来源细胞不易监测，判断是否建模成功，只能依靠处死小鼠后检测骨髓中融合基因的表达。

因此，本课题组采用两种不同表型的小鼠分别作为供体鼠（CD45.2）和受体鼠（CD45.1），在建模过程中，可以检测受体鼠外周血中CD45.2细胞的比例，以此掌握受体鼠内白血病的进展情况[13,14]。

此外，国外文献报道，应用化疗药物5-Fu预处理供体小鼠，可以杀伤骨髓中分裂期细胞，从而增加造血干细胞的比例以及感染效率，提高建模成功率[14,15]。

但在本研究中发现，由于5-Fu毒性作用大，预处理后的小鼠分离出的骨髓细胞数量很少，达不到后续实验的要求。

因此，我们采用不进行5-Fu处理的方案[16]，分离出的小鼠全骨髓细胞，经CD117磁珠筛选，得到较为纯净的c-Kit+细胞，建模成功率反而大大提高。

通过对实验条件的优化、选择，我们成功建立了小鼠MLL-AF9白血病细胞株和小鼠MLL-AF9白血病模型。

经过逆转录病毒感染、筛选和培养后的MLL-AF9细胞能在体外形成大量集落，细胞高表达髓系表面标志，瑞士染色多呈分化障碍的髓系幼稚细胞，提示为髓系白血病细胞株。

将建成的细胞株移植入致死剂量照射的小鼠体内，60d左右MLL-AF9组小鼠陆续出现弓背、竖毛、活动减弱等疾病状态，检测骨髓和脾脏中CD45.2细胞比例分别达70％-90％和40％-50％，且CD45.2细胞群高表达髓系表面标志，外周血白细胞计数显著高于对照组，解剖可见，肝脾肿大，组织化学染色均能见到大量原始幼稚细胞浸润，提示小鼠发生髓系白血病。

小鼠MLL-AF9白血病细胞株的建立可以为此类白血病的体外研究提供大量的细胞来源，用以研究白血病细胞的信号转导通路以及筛选靶向药物。

小鼠MLL-AF9白血病模型的建立则可用以研究白血病干细胞的生物学特点、白血病的体内微环境以及寻找靶向分子，为探讨白血病的病理生理机制，评价药物疗效提供基础平台。

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doi:

10.7534/j.issn.1009-2137.2013.05.008

基金项目：

本研究由国家973科学基金资助（编号2009CB521806）；国家自然科学基金（编号81001049）

*通讯作者：

方勇，主治医师.电话：

13986098973.E-mail：

tongjify@

2013-07-12收稿；2013-07-24接受