最新生化分离技术总结.docx

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最新生化分离技术总结

生化分离技术总结

生化分离技术总结

A.蛋白质相关

氨基酸混合物的分析分离：

为了测定蛋白质的氨基酸组成或从蛋白质水解液中支取氨基酸，需要对氨基酸混合物进行分离分析工作。

（考点不是很多）

层析即色层分析也即色谱。

主要是基于氨基酸的酸碱性质和极性大小。

1.分配柱层析：

层析柱中的填充物或称支持剂都是一些具有亲水性的不溶物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。

其实质就是流动相把各成分从固定相中连续提取出来，并向下移动，结果分配系数大的成分移动速度大，分配系数小的成分移动速度小，因而彼此分离。

2.纸层析：

以滤纸为载体用来代替层析柱，利用纸上吸附的水为固定相，与水不想混合的有机溶剂为流动相从纸上流过，达到液-液连续萃取的目的，使物质得到纯化或分离。

3.离子交换层析：

以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

4.薄层层析：

快速分离和定性分析少量物质的一种重要实验技术，属固-液吸附色谱，兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品的分离，另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，因此，可用来精制样品，适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。

5.气液层析

6.高效液相层析：

高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。

蛋白质相关研究方法

1.蛋白质相对分子量的测定

（1）渗透压法测定相对分子质量

（2）沉降分析法测定相对分子质量

（3）凝胶过滤法测定相对分子质量

（4）SDS-PAGE法测定相对分子质量

2.蛋白质的分离纯化

蛋白质混合物纯化方法

3.蛋白质的沉淀:

主要是通过引起水化层和电势的变化,使蛋白质发生沉淀.

（1）盐析法（首推，不易引起蛋白质变性）:

向蛋白质溶液中加入大量的中性盐,使其脱去水化层而聚集沉淀.一般不引起蛋白质变性,出去盐后,可复溶.

（2）有机溶剂沉淀法:

加入一定量的极性有机溶剂,使其脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用,致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀.

（3）重金属沉淀法:

当溶液pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，易于与重金属结合成不溶性盐而沉淀。

（4）生物碱试剂和某些酸类沉淀法：

如鞣酸（单宁酸）、苦味酸、钨酸等。

（5）加热变性沉淀法：

几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。

4.常考：

（整理资料上）

等电点沉淀

凝胶过滤层析

B.糖类相关

糖链的结构分析

1.步骤

单糖组成的测定

聚糖的纯度鉴定和相对分子质量测定

聚糖的分离纯化

从糖蛋白释放完整的聚糖

糖蛋白的分离纯化

完整聚糖链的序列测定

2.方法

a.化学方法：

（1）高碘酸氧化

（2）甲基化分析（3）寡糖顺序降解

b.酶学方法：

糖苷酶

c.仪器测定方法：

红外光谱IR、激光拉曼光谱、质谱MS、核磁共振NMR

FAB-MS，FAB快速原子轰击，是一项测定寡糖乃至复杂糖一级结构的有用方法。

C.脂类相关

A．脂质的有机溶剂提取：

非极性脂质（三酰甘油、蜡、色素）用乙醚、氯仿或苯等从组织中提取；膜脂（磷脂、糖脂、固醇）用极性有机溶剂如乙醇或甲醇提取。

B．脂质的色谱分离：

高效液相色谱（HPLC）和薄层层析（TLC），二者分辨率较高。

C.分析：

专一性水解及其产物的气液色谱（GLC）或薄层层析（TLC）相结合的技术常用来测定一个脂的结构。

用质谱分析来确定烃链长度和双键的位置。

D.核酸相关

重要名词解释

1.PCR：

聚合酶链式反应，DNA的体外扩增技术，包括高温变性、低温裂解、适温延伸三个步骤（利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互补链。

基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

）

2.SDS-PAGE：

聚丙烯酰胺凝胶电泳，用于分离蛋白质和寡核苷酸。

聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。

电泳过程中，依据蛋白质的分子量将其分离开来。

3.Western-blot：

免疫印迹，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，用抗体作为探针检测蛋白质的技术。

4.Southernblot：

进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。

一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。

5.Northernblot:

是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northernblot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。

探针

检测对象

Northernblot

DNA

RNA

Western-blot

蛋白质

蛋白质

Southernblot

DNA

DNA