灵芝粗多糖对小鼠胚胎成纤维细胞的抗氧化生物活性研究.docx
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灵芝粗多糖对小鼠胚胎成纤维细胞的抗氧化生物活性研究
安徽大学江淮学院
本科毕业论文（设计）
题 目：
霍山灵芝粗多糖对小鼠胚胎成纤维细胞的抗氧
化生物活性研究
学生姓名：
刘巍 学号：
22124019
系别：
理工部 专业：
生物信息技术
入学时间：
2012 年 9 月
导师姓名：
吴庆喜 职称/学位：
讲师/博士
霍山灵芝粗多糖对小鼠胚胎成纤维细胞的抗氧化生物活性研究
摘要
目的：
探究霍山野生灵芝粗多糖对小鼠胚胎成纤维细胞（3T3细胞）抗氧化生物活性的影响，证明霍山野生灵芝多糖可以保护细胞氧化损伤。
方法：
实验以3T3细胞为研究对象，首先用MTT法检测不同浓度叔丁基过氧化氢（t-BHP）诱导作用下3T3细胞的相对存活率，接着用MTT法测定不同浓度的野生灵芝多糖对t-BHP诱导作用下3T3细胞的保护作用。
结果：
t-BHP诱导组的细胞存活率比较低,当t-BHP浓度为200μg/ml时，细胞存活率降至75.56%，并且随着t-BHP浓度的增加呈负相关，当t-BHP浓度为800μg/ml时，细胞存活率低至38.09%。
与t-BHP诱导组相比，当灵芝多糖浓度为200μg/ml，粗多糖处理组的细胞存活率从56.41%提升至61.98%，而且随着多糖浓度的增加呈正相关。
结论：
根据得到的结果可以说明霍山野生灵芝多糖可以在一定程度上提高细胞的存活率，保护细胞氧化损伤。
关键词：
霍山野生灵芝；抗氧化性；多糖
AntioxidantactivitystudiesofcrudepolysaccharidesfromHuoshanwildGanodermalucidumontheembryonicfibroblastsofmouse
Abstract
Objective:
ToexploretheantioxidantactivityofHuoshanwildGanodermalucidumpolysaccharidesontheembryonicfibroblasts（3T3cells）ofmouse,toproveHuoshanwildGanodermalucidumpolysaccharidescanprotectthecellsfromoxidativedamage.Methods:
The3T3cellswereusedasthemodel,firsttherelativesurvivalratesoft-butylhydroperoxide（t-BHP）inducedweremeasuredbyMTTassaywithdifferentconcentrations,andthenmeasuredfordifferentconcentrationsofwildGanodermalucidumpolysaccharidesontheMTTassayt-BHPundertheprotectiveeffectinduced3T3cells.Results:
Theresultsshowedthatt-BHPinducedcellviabilitygroupwasrelativelylow,andast-BHPwasnegativelycorrelatedwithincreasingconcentration.Andt-BHPinducedgroupcomparedwithcellviabilityHuoshanwildfunguspolysaccharidetreatmentgroupwashigher,andwiththeconcentration’sincreaseofthepolysaccharideitwaspositivelycorrelated.Conclusion:
Accordingtotheresults,HuoshanwildGanodermalucidumpolysaccharidescouldimprovethesurvivalrateofthecellstoacertainextent,protectingthecellsfromoxidativedamage.
Keywords：
Huoshanwildfungus；Anti-oxidation；Polysaccharides
目录
1.前言5
1.1灵芝的研究现状5
1.2灵芝多糖的研究现状5
1.2.1灵芝多糖分离纯化的研究现状5
1.2.2灵芝多糖的生物活性研究现状6
1.3细胞氧化损伤和细胞抗氧化研究进展7
1.3.1细胞氧化损伤的危害7
1.3.2细胞抗氧化的研究进展7
2.材料、试剂和仪器8
2.1实验材料8
2.2实验试剂8
2.3实验仪器8
3.实验方法8
3.1试剂的准备8
3.2灵芝粗多糖的提取9
3.2.1灵芝粗多糖的提取流程图9
3.2.2灵芝粗多糖的提取步骤9
3.3细胞培养与诱导10
3.4MTT法检测10
3.4.1MTT法原理10
3.4.2MTT法检测过程10
4.结果与分析11
4.1MTT法检测t-BHP对3T3细胞的毒性11
4.2霍山野生灵芝粗多糖对t-BHP作用下的3T3细胞的保护作用12
5.结论和展望13
参考文献14
致谢15
霍山灵芝粗多糖对小鼠胚胎成纤维细胞的抗氧化生物活性研究
1.前言
1.1灵芝的研究现状
我国的天然中药不仅药源丰富，且不良反应轻微，有安全低毒、价廉高效等优点，具有良好的研究开发前景。
灵芝多糖是目前临床应用较为广泛、研究比较深入的中药之一，其为灵芝中最重要的天然有效成分之一，因其具有抗氧化、清除自由基、抗炎、提高免疫功能等广泛的生物学活性，近年来越来越受到学者们的重视。
其中，灵芝多糖较好的抗氧化及抗肿瘤作用倍受人们的关注。
灵芝是担子菌纲,多孔菌科,是一种食药两用真菌。
我国应用灵芝作为药物历史悠久已有两千多年的历史了。
历代医学家都认为灵芝是扶正固本,滋补强壮的珍品,能治疗多种疾病，对全身五脏之气均有补益作用。
过去,天然灵芝产量较少,灵芝的研究和应用受到限制。
现在由于能广泛对灵芝子实体和深层发酵菌丝体进行人工培养,可大规模生产,极大地促进了灵芝的研究和应用。
对灵芝的研究表明,灵芝的组成成分复杂,具有多种有效成分和广泛的生物学作用,能治疗多种疾病。
研究证明,灵芝含有多糖、氨基酸、蛋白质、甾类、萜类、有机酸、生物碱、多种酶和无机离子等多种大小不一的化合物。
近年来研究发现，灵芝中除黄酮等小分子化合物具有较强的生物活性外，大分子化合物如灵芝多糖也同样具有多方面的活性。
灵芝多糖是灵芝中重要的天然有效成分一，随着近年对其研究的不断深入，灵芝中的各种化合物药理作用越来越清晰。
越来越多的研究表明，灵芝中的多种化合物具有强烈的抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、降血糖及免疫活性作用。
1.2灵芝多糖的研究现状
灵芝多糖是灵芝的主要活性成分，近年来以其独特的保健功能成为研究的热点。
本世纪50年代末期以来,由于人工栽培灵芝子实体获得成功,随后又发展了深层发酵培养灵芝菌丝体和发酵液的技术,灵芝的开发应用日益广泛。
对灵芝类真菌的化学成分、药理作用和作用机制以及临床应用进行了大量的研究,并取得了重大进展。
这些研究表明灵芝多糖是灵芝的主要有效成分之一,具有抗肿瘤、增强免疫力、抗疲劳、延缓衰老、抗氧化等多种生理功效。
1.2.1灵芝多糖分离纯化的研究现状
灵芝多糖是研究比较多而且透彻的多糖之一，在国际上，韩国、日本、美国等国家都掀起过研究灵芝多糖的热潮。
灵芝多糖的提取一般采用非热水以及稀碱溶液，零食多糖的提取应避免在强酸、强碱溶液中进行，否则极易造成灵芝多糖中糖苷键的断裂或者构想发生变化。
目前,常见的灵芝多糖主要可分为水溶及碱溶两种。
灵芝多糖的分离和纯化大致经过热水浸提、乙醇沉淀、透析及柱层析等步骤。
在分离纯化灵芝多糖时多通过法及酶结合法去除粗多糖中的蛋白成分。
根据来源不同,灵芝多糖可分为四种,即子实体多糖、孢子多糖、菌丝体多糖及发酵液多糖。
虽然它们在具体的提取方法上不尽相同,但都是利用多糖易溶于热水而不溶于有机溶剂的性质进行提取的。
提取子实体、孢子粉或菌丝体中多糖,需要加水或碱液浸提,浓缩后用乙醇沉淀出多糖，发酵液中多糖只需将发酵液浓缩后,直接加入数倍体积高浓度乙醇即可析出。
1.2.2灵芝多糖的生物活性研究现状
多糖具有多种生物学功能，目前对多糖的生物学活性研究主要集中在其免疫调节作用、抗肿瘤活性、抗病毒和降血糖降血脂以及抗氧化方面。
（1）免疫调节作用
免疫是机体抵御外界刺激保护机体的一种自身防御作用。
灵芝多糖对免疫系统的调节作用是当前研究的一大热点。
实验证明，多糖可以通过提高白细胞数量、刺激白细胞分化成熟和繁殖、增强巨噬细胞吞噬能力和分泌能力、调节细胞因子的表达等来增强机体的免疫力。
（2）抗肿瘤作用
研究表明很多植物多糖和真菌多糖具有抗肿瘤的作用。
灵芝多糖作为抗肿瘤药物，具有来源广，毒副作用少，安全性高等优点，近年来已得到广泛的研究应用。
多糖抗肿瘤的主要作用机理为:
①激活机体的免疫受体，提高机体免疫功能;②改变细胞膜的结构提高膜上唾液酸含量，降低膜磷脂含量，抑制肿瘤增殖;③灵芝多糖通过减少或防止羟基自由基产生，使细胞分裂发生抑制以致肿瘤生长受到抑制。
（3）降血糖作用
近年来发现大多数灵芝属真菌多糖具有很好的降血糖功效，并可通过不同的途径发挥降血糖作用，包括通过促进胰岛素的分泌、改善胰岛素抵抗、加速肝葡萄糖代谢及外周组织对葡萄糖的利用、减少对葡萄糖的吸收等途径发挥降血糖作用。
（4）抗菌抗病毒作用
抗菌抗病毒作用主要为一系列硫酸酷多糖所具有，近年来硫酸酷多糖的这一作用引起人们的广泛关注。
其主要抗病毒机理可能有以下两个方面:
一是直接杀伤病毒;二是吸附在细胞表面，阻止病毒进入细胞。
（5）抗氧化作用
细胞的氧化损伤主要是由线粒体在电子传递的过程中产生的自由基所引起的，机体在生命过程中无时无刻不在产生自由基。
正常情况下，体内存在抗氧化系统对氧自由基生成具有清除和平衡作用，这样对于机体来说是有利的，适量氧自由基对细胞的分裂，生长，消炎，解毒等起积极作用。
但当体内蓄积过量自由基时，损害细胞膜上的脂类和蛋白质等，就会导致细胞衰老继而影响到机体的衰老，甚至还会引起许多病症。
紫外线及其他辐射、疾病等都可能导致自由基大量产生，这时就需要外源抗氧化物质的摄入，而某些具有抗氧化作用的中药因其低毒性正被广泛研究。
这些多糖类物质可直接清除体内过剩自由基，或通过增强体内抗氧化酶活力起增强抗氧化作用，有效地防止或减轻由于体内自由基过剩所导致的氧化损伤，增强机体免疫能力，延缓衰老。
因此研究多糖制剂对预防疾病有重要意义，可以延长动物最长寿命和平均寿命，降低中老年人心血管疾病的风险。
1.3细胞氧化损伤和细胞抗氧化研究进展
1.3.1细胞氧化损伤的危害
人类是由细胞组成的。
人体内产生的活性氧和自由基会使细胞受到氧化损伤，结果导致机体产生心血管疾病、肿瘤和衰老。
正常情况下，机体内存在活性氧和自由基的清除系统，能够保证活性氧和自由基能够在一个极低的水平上保持平衡，一旦超过了这个平衡，机体就会受到严重的氧化损伤，损害人体的健康寿命。
人和其他高等生物一样，不间断地进行有氧代谢。
人通过呼吸作用从周围环境中摄取氧气经过血液输送至全身各处，最后进入细胞，参与了细胞的生化反应。
在一系列生化反应过程中，产生了各种活性氧。
一个成年人在一昼夜大约需要消耗600g氧气，其中5-10%会导致产生各种活性氧。
活性氧是一种强氧化剂，在一般情况下，活性氧一旦出现，立即会被蛋白酶系中和反应掉，从而得到有效的控制。
这些活性氧如果得不到有效的控制，对细胞将产生很大的伤害作用。
活性氧可以将含硫氨基酸上的硫氧化成二氧化硫，从而使酶及蛋白质变形失活，产生的二氧化硫还造成神经损害；活性氧侵袭到胆固醇上，会形成胆固醇和过氧化物；当侵袭到脂肪酸上，会形成环氧化物和内源性的过氧化物。
脂肪酸上双键受到侵袭产生的化学基就会与分子氧起反应而形成一个过氧化氢基，这个过氧化氢基又能以连锁的形式与其他不饱和双键起反应。
脂肪过氧化的后果是很严重的后果。
如果被氧化的脂肪在细胞质膜表面可能会导致机体产生炎症并且迅速繁殖，进而引发关节炎等炎症疾病；如果被氧化脂肪在低密度脂蛋白上导致心血管疾病。
活性氧还会导致核苷酸分子进行突变，这对生物个体将是非常严重的后果。
前者导致增殖，后者导致突变，两者一起可能导致癌变。
日益增多的证据也表明，人体的衰老可能与细胞受活性氧和自由基侵袭有关，使细胞上多处位点氧化损伤积累的结果。
人到中老年，皮肤上出现的深红色斑点就是细胞上脂肪被氧化的结果。
中老年人的集体器官的功能逐渐降低，活性氧的出现而又不能有效而及时的被排除，细胞的氧化损伤加剧，从而导致机体出现心血管疾病，肿瘤和衰老。
1.3.2细胞抗氧化的研究进展
氧化应激产生多余自由基,导致氧化相关疾病发病。
各种内源性与外源性抗氧化物作用于机体细胞,发挥抗氧化作用。
抗氧化在细胞水平发挥作用的机制主要有:
清除细胞内多余自由基,防止自由基直接对细胞造成损害。
上调抗氧化酶活性,减少有毒过氧化产物的生成,可提高细胞氧化防御体系,增强细胞抗氧化能力。
保护重要细胞器,主要有内质网与线粒体,预防由线粒体和内质网诱导的细胞凋亡。
调节凋亡基因与细胞信号转导途径,从而减少细胞凋亡、增加细胞活力,起到抗氧化作用。
近年来针对细胞的抗氧化研究的得到很大的进展，氧化损伤与多种疾病的发生有密切关系，研究发现很多的植物多糖、真菌多糖都可以增强细胞的抗氧化能力，延缓机体衰老。
本实验就灵芝多糖为原料，进行试验，验证灵芝多糖是否可以增强细胞的抗氧化能力。
2.材料、试剂和仪器
2.1实验材料
霍山野生灵芝：
于2016年在中国安徽省六安市霍山地区，经在安徽大学生命科学学院粉碎后，提取实验所需灵芝多糖。
3T3小鼠胚胎成纤维细胞：
购自医药公司。
2.2实验试剂
DMEM培养基、青/链霉素双抗溶液（购自美国Thermo公司）；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、二甲亚砜（DMSO）、胰蛋白酶（购自美国Sigma公司）；pH=7.2~7.4磷酸缓冲液（PBS）、叔丁基过氧化氢（t-BHP）、Sevag试剂、无水乙醇（购自国药集团）。
2.3实验仪器
CKX41倒置显微镜
日本Olympas公司
旋转蒸发仪
巩义市予华仪器有限责任公司
电子天平
上海越平科学仪器有限公司
DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器
巩义市科瑞仪器有限公司
DK-S24型电热恒温水浴锅
上海精宏实验设备有限公司
台式离心机
德国Heraeus公司
冰箱
荣事达
烘箱
上海精宏实验设备有限公司
TD5A-WS台式低速离心机
长沙湘仪离心机仪器有限公司
3.实验方法
3.1试剂的准备
（1）磷酸盐缓冲液（PBS）：
8.0gNaCl，0.2gKCl,1.44gNa2HPO4,完全溶解于800ml蒸馏水中，接着用浓度5.6%的NaHCO3溶液调节后定容到1000ml，高压蒸汽灭菌后4℃冰箱保存备用；
（2）0.25%胰蛋白酶溶液：
精确称取25mg胰蛋白酶粉末溶于1000ml的PBS中，并用磁力搅拌器助溶，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后，-20℃冰箱保存备用；
（3）MTT溶液（5mg/mL）：
准确称取250mgMTT溶于50mLPBS中，完全溶解后，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后，4℃冰箱保存备用；
（4）t-BHP溶液：
将t-BHP原液加入去离子水，配置成1000mmol/L的母液，使用前用DMEM培养液稀释至所需浓度。
（5）Sevag试剂：
三氯甲烷40ml，正丁醇10ml混合（三氯甲烷和正丁醇体积比为4∶1即可）
3.2灵芝粗多糖的提取
3.2.1灵芝粗多糖的提取流程图
3.2.2灵芝粗多糖的提取步骤
取灵芝成品，切成小块，放入粉碎机中进行粉碎，得到灵芝粉末，收集灵芝粉末20g，按照1:
40的料液比加入800ml的无水乙醇，在90℃的水浴锅中水浴加热2小时，进行脱脂和脱色处理，并且在加热的过程中不断搅拌，2小时后取出来，加入等量的蒸馏水重复上步操作，水浴加热完成后取出混合物进行抽滤，收集滤液。
将抽滤后的滤渣加水重复上步操作，重复2-3次，将多次抽滤后收集的滤液混合，在离心机中以5500r/min的转速离心10min，取上清液，在旋转蒸发器进行浓缩，加入无水乙醇进行醇沉，在离心机中以5500r/min的转速离心10min，收集沉淀加水复溶，溶液体积不得超过50ml，此时得到的是灵芝多糖和蛋白质的混合物质，离心剩下的上清液可以回收。
用sevage法可以除去混合液中的蛋白质，取提取出来的灵芝多糖和蛋白质的混合液分别加入40ml三氯甲烷和10ml正丁醇（三氯甲烷和正丁醇的体积比为4∶1），放到磁力搅拌器上搅拌1h，然后在离心机中以5500r/min的转速离心10min，吸取上清液，注意不要吸出下层的蛋白质。
上清液重复操作加入sevage试剂、搅拌、离心、取上清液，两到三次。
装入透析袋中在流水中透析24h，在蒸馏水中透析48h，取出即为灵芝粗多糖，装好待用。
3.3细胞培养与诱导
（1）培养：
3T3细胞悬浮于含10%胎牛血清、100U/mL链霉素及100U/mL青霉素的DMEM培养液中，于37℃、5%CO2、100%湿度的培养箱中培养，2-3天传代一次。
（2）细胞建模
模型组：
将生长状况良好的3T3细胞暴露在含t-BHP100μmol//L的DMEM培养液中，2h后,PBS洗涤，加入新鲜培养液继续培养，长满后传代，如此重复4次；
实验组：
细胞同模型组处理期间，加入不同浓度的灵芝粗多糖溶液进行干预；
正常对照组：
细胞正常培养，不做任何处理。
3.4MTT法检测
3.4.1MTT法原理
MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
3.4.2MTT法检测过程
将处于对数生长期的3T3细胞用0.25%的胰酶消化约2min，加入培养液终止消化，以每孔100uL1×104/mL的密度接种于96孔板中，生长24h后弃去培养液，分别加入不同浓度的t-BHP溶液（空白对照组不加），每个浓度设8个复孔，96孔板置于37℃、5%CO2、100%湿度的培养箱中培养，。
孵育4h后，加入10uL的MTT溶液继续培养4h，弃上清，终止培养，每孔加入150uLDMSO，摇床低速振荡10min左右，使结晶充分溶解，然后使用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度A570。
按照上述方法培养细胞，先用400umol/L的t-BHP溶液（空白对照组不加）孵育1h，然后弃去溶液，PBS洗一次，分别加入浓度0.0-800μg/mL（0.00μg/mL即正常对照组）的灵芝多糖溶液孵育24h，然后进行MTT法检测。
细胞相对存活率=（各浓度组吸光度/正常对照组吸光值）×100%。
4.结果与分析
4.1MTT法检测t-BHP对3T3细胞的毒性
为了研究t-BHP对细胞凋亡的诱导效果，首先对其细胞毒性进行了分析。
表1不同浓度t-BHP对3T3细胞的毒性
Table1Thecytotoxicityoft-BHPon3T3cells
t-BHP浓度（μM）
吸光值A570
相对存活率（%）
0
1.084
100
25
1.028
94.83
50
0.984
90.77
100
0.911
84.04
200
0.819
75.56
400
0.731
67.43
600
0.574
52.95
800
0.413
38.09
结果显示（表1），与正常组比较，细胞存活率随着t-BHP浓度增加而逐渐降低，当t-BHP浓度大于200μM时，与0μM相比，*P<0.05,差异显著，t-BHP会显著降低细胞存活率。
当t-BHP浓度达到800μM时，细胞数目大大降低，说明t-BHP诱导细胞凋亡或坏死。
根据表1所得数据，以t-BHP浓度为横坐标，细胞相对存活率为纵坐标可得到以下图1
图1:
不同浓度t-BHP对3T3细胞相对存活率的影响
Figure1:
Relativesurvivalrateofdifferentconcentrationsoft-BHPin3T3cells
4.2霍山野生灵芝多糖对t-BHP作用下的3T3细胞的保护作用
为了研究灵芝多糖对t-BHP作用下的3T3细胞的保护作用，用t-BHP诱导建立细胞衰老模型，不同浓度的灵芝多糖进行干预。
表2不同浓度的灵芝多糖对t-BHP诱导的的3T3细胞存活率的影响
Table2Theeffectsofganodermalucidumpolysaccharidesontheviabilityof3T3cellstreatedwitht-BHP
吸光值A570
相对存活率（%）
正常对照组
0.903
100
t-BHP诱导组
0.509
56.41
GLP50μg/mL
0.499
55.30
GLP100μg/mL
0.508
56.35
GLP200μg/mL
0.559
61.98
GLP400μg/mL
0.584
64.71
GLP600μg/mL
0.617
68.29
GLP800μg/mL
0.636
70.45
由表2可以得出，与t-BHP诱导组相比，灵芝多糖处理组细胞存活率较高，当灵芝多糖浓度为200ug/mL时，*P<0.05，差异显著，灵芝多糖细胞组存活率呈现差异显著性，而且随着灵芝多糖浓度的增加，细胞存活率升高。
当灵芝多糖浓度为800ug/mL时，细胞存活率从56.41%提升至70.45%。
说明GLP对t-BHP有道的3T3细胞凋亡有一定的保护作用。
根据表2所得数据，以GLP浓度为横坐标，细胞的相对存活率为纵坐标可得到以下图2
图2：
不同浓度的灵芝多糖对t-BHP诱导的的3T3细胞存活率的影响
Figure2:
EffectsofdifferentconcentrationsofGLPont-BHP-inducedsurvivalof3T3cells
5.结论和展望
本实验以3T3细胞为研究对象，首先用t-BHP诱导细胞凋亡，采用MTT法检测不同浓度灵芝多糖GLP对t-BHP诱导凋亡和坏死细胞现象，提高细胞存活率，并且与多糖剂量呈正相关，说明GLP能够有效改善t-BHP诱导的3T3细胞凋亡，保护细胞抵抗过氧化损伤，对细胞具有一定的保护作用。
基于实验结果，可以看出GLP可以保护3T3细胞的氧化损伤，那么可以设计实验证明GLP对其他细胞的抗氧化活性的影响。
GLP可以帮助细胞抵抗氧化损伤，那么我们可以利用GLP研究药剂，制剂帮助人类抵抗细胞氧化，抗衰老以延长人类寿命。
近年来,市场上的灵芝产品种类繁多,包括以灵芝子实体、灵芝菌丝体、灵芝抱子粉为主要成分或
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