免疫化学技术.docx

免疫化学技术.docx

《免疫化学技术.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《免疫化学技术.docx（19页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

免疫化学技术

8免疫化学技术

8.1免疫化学技术简介

现代免疫化学是研究抗原与抗体的组成、结构以及抗原和抗体反响的机制。

此外，还研究体内其他免疫活性物质，如补体分子的组成、结构及其功能。

目前，免疫化学已应用于免疫性疾病发病机制的根底研究和临床检测等。

随着免疫化学、细胞生物学及分子生物学的进展，免疫学实验技术也迅猛开展，并已成为当今生命科学研究的重要手段，尤其是在医学根底研究和临床实践中得到广泛应用。

免疫学检测方法可分为体液免疫测定及细胞免疫测定。

前者主要是根据抗原与相应抗体能在体外发生特异性结合，并在一些辅助因子的参与下出现沉淀、凝集及溶化等反响，从而采纳抗原检测未知抗体，或用抗体检测未知抗原。

此外，尚包含检测体液中各种可溶性免疫分子，诸如补体、各类免疫球蛋白、循环免疫复合物、溶菌酶、各种细胞因子等。

细胞免疫测定则是根据各种免疫细胞〔T细胞、B细胞、K细胞、NK细胞及巨噬细胞等〕外表所具有的独特标志及其各自的特别功能，在体外〔有时亦可在体内〕测定上述各种细胞及其亚群的数量和功能，以援助了解机体的细胞免疫水平。

本章节仅限于介绍几种主要的免疫化学实验技术的根本原理及实验操作方法。

8.2抗原的免疫原性和专一性

抗原与免疫原：

抗原〔antigen,Ag〕是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物即抗体和致敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性结合的物质，也称为免疫原〔immunogen〕。

前一种性能称为免疫原性〔immunogenicity〕或抗原性〔antigenicity〕，后一种性能称为反响原性〔reactogenicity〕或免疫反响性〔immunoreactivity〕。

抗原的分类：

根据抗原物质所具备的性能可分为完全抗原〔completeantigen〕和半抗原〔hapten〕两类。

同时具有免疫原性和免疫反响性的抗原称为完全抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。

仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反响性，而无免疫原性的物质称为半抗原，如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，这种与半抗原结合并给予它免疫原性的蛋白质大分子称为载体〔carrier〕。

根据抗原的来源不同可分为外源性抗原与内源性抗原。

外源性抗原是从外界引入体内而刺激机体发生免疫应答的。

内源性抗原是指体内的自身成分，如机体的组织或细胞因理化因素作用或病毒感染使这些成分发生改变或修饰，成为一种自身抗原或称新生抗原，使机体发生免疫反响。

而根据抗原的化学组成可分成蛋白质、糖类、脂类与核酸等抗原。

构成免疫原的条件：

异物性是抗原物质的首要性质。

免疫活性细胞在正常情况下具有高度精确的识别能力，能识别“自己〞和“非己〞，将非己物质加以排斥。

免疫应答就其本质来说，就是识别异物和排斥异物的应答，故激发免疫应答的抗原一般需要是异物，具有异物性的物质可分为以下几种：

1〕异种物质：

马血清、异种蛋白质、各种微生物及其代谢产物，对人来说是异种物质，均为良好抗原。

2〕同种异体物质：

高等动物同种不同个体之间，由于遗传基因不同，其组织成分的化学结构也有差异。

因此，同种异体物质也可以是抗原物质。

例如人类红细胞A、B、O血型物质和人类白细胞抗原〔humanleukocyteantigen,HLA〕即属此类。

3〕自身抗原：

自身组织成分通常无抗原性，但在某些异常情况下，自身成分也可成为抗原物质。

抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。

在肯定范围内，分子量越大，其抗原性越强。

分子量在5kD以下的肽类，一般无抗原性，分子量为5－10kD的肽类为弱抗原。

抗原须是大分子物质的原因为：

1〕分子量越大，外表的抗原决定簇越多，而淋巴细胞要求有肯定数量的抗原决定簇的刺激才能活化。

2〕大分子胶体物质的化学结构稳定，不易被破坏和去除，在体内停留时间较长，能延续刺激淋巴细胞。

大分子物质并不肯定都有抗原性。

例如明胶是蛋白质，分子量达100kD以上，但其免疫原性很弱。

因明胶所含成分为直链氨基酸，不稳定，易在体内水解成低分子化合物。

如在明胶分子中参加少量酪氨酸则能增强其抗原性。

因此，抗原物质除应为大分子外，其外表必须有肯定的化学组成和结构。

此外，抗原分子的构象〔conformation〕即抗原分子中一些特别化学基因的三维结构，它决定该抗原分子是否能与相应淋巴细胞外表的抗原受体互相吻合，从而启动免疫应答。

抗原分子的构象变化，可导致其抗原性的改变。

抗原的物理性状与免疫原性的强弱有关。

一般具有环状结构的蛋白质其抗原性比直链分子强；聚合状态的蛋白质较其单体抗原性为强；颗粒性抗原较可溶性抗原为强。

具备上述性状的物质须经非消化道途径进入机体〔包含注射、吸入、混入伤口等〕，并接触免疫活性细胞，才能成为良好抗原。

抗原特异性的物质根底：

抗原决定簇〔antigenicdeterminant,AD〕是存在于抗原外表的特别基团，又称表位〔epitope〕。

抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞外表抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。

因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反响具有特异性的物质根底。

一个抗原分子可具有一种或多种不同的抗原决定簇，每种决定簇只有一种抗原特异性。

抗原决定簇的大小相当于相应抗体的抗原结合部位。

一般蛋白质的决定簇由5－6个氨基酸残基组成，一个多糖决定簇由5－7个葡萄糖残基组成，一个核酸半抗原的决定簇包含6－8个核苷酸。

抗原结合价〔antigenicvalence〕指能与抗体分子结合的决定簇的总数，包含抗原外表功能价及其内部非功能价。

8.3抗体的结构和功能

抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白〔Immunoglobulin〕。

在免疫应答过程中，抗体主要由分化的B淋巴细胞产生，但有时也需要其他类型的细胞，如T淋巴细胞和巨噬细胞的协同作用。

抗体主要分布在体内血清中或外分泌液中，对体液免疫应答起主要作用。

目前已发觉的人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。

免疫球蛋白最显著的特点是与抗原特异性结合以及其分子的不均一性。

各种不同类别的免疫球蛋白分子都含有四条多肽链组成的根本结构单位，即由两条重链〔heavychain,H链〕和两条轻链〔lightchain,L链〕通过不同数目的二硫键结成Y形〔见图8-1〕。

在抗体分子的N端，不同抗体分子的氨基酸组成和顺序都是不同的，此区为“多变区〞〔variableregion,V区〕，它是抗体分子与抗原决定簇的结合部位。

由于抗体多变区这一结构特点，决定了它对抗原分子“识别功能〞的多样性；不同抗体分子的C端结构根本恒定，称为“稳定区〞〔constantregion,C区〕。

当抗原与抗体结合时，抗体分子发生变构效应和集聚作用，使稳定区的某些部位暴露出来，并马上发生一系列免疫生理效应，如固定补体，促进对抗原分子的吞噬、溶化和去除作用。

图8-1IgG1的根本结构

Fig8-1.TheN-terminalendofIgG1ischaracterizedbysequencevariability（V）inboththeheavyandlightchains,referredtoastheVHandVLregionsrespectively.Therestofthemoleculehasarelativelyconstant（C）structure.TheconstantportionofthelightchainistermedtheCLregion.Theconstantportionoftheheavychainisfurtherdividedintothreestructurallydiscreteregions:

CH1,CH2andCH3.Theseglobularregions,whicharestabilizedbyintrachaindisulphidebonds,arereferredtoas‘domains’.Thesitesatwhichtheantibodybindsantigenarelocatedinthevariabledomains.ThehingeregionisasegmentofheavychainbetweentheCH1andCH2domains.Flexibilityinthisareapermitsthetwoantigen-bindingsitestooperateindependently.ThereisclosepairingofthedomainsexceptintheCH2region.CarbohydratemoietiesareattachedtotheCH2domains.

免疫球蛋白在血清自由电泳图谱中主要分布在г－球蛋白地域，因此以前有人把г－球蛋白误认为就是抗体。

其实г－球蛋白不全是抗体，而抗体也不全在г－球蛋白地域内〔见图8-2〕。

图8-2人血清免疫球蛋白的分布

Fig8-2Electrophoresisofhumanserumshowingthedistributionofthefourmajorimmunoglobulinclasses.Serumproteinsareseparatedaccordingtotheirchargesinanelectricfield,andclassifiedasα1,α2,βandγ,dependingontheirmobility.（IgEclasshasasimilarmobilitytoIgDbutcannotberepresentedquantitativelybecauseofitslowlevelinserum）.IgGexhibitsmostchargeheterogeneity,theotherclasseshavingamorerestrictedmobilityintheβandfa8

8.4抗原抗体的结合

体外抗原抗体反响又称血清学反响〔serologicreaction〕，因抗体主要存在于血清中，试验时一般都采纳血清标本，故名。

但抗原抗体反响亦常用于细胞免疫测定，如对淋巴细胞外表分化抗原的鉴定。

因此，血清学一词已被广义的抗原抗体反响所取代。

抗原与抗体在体外结合时，可因抗原的物理性状不同或参与反响的成分不同而出现各种反响，例如凝集、沉淀、补体结合及中和反响等。

在此根底上进行改良，又衍生出许多快速而灵敏的抗原抗体反响，例如从凝集反响衍生出间接凝集、反向间接凝集、凝集抑制试验、协同凝集试验等；从沉淀反响结合电泳，衍生出免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳等。

此外，还有各种免疫标记技术，如免疫荧光、酶免疫测定、放射免疫、免疫电镜及发光免疫测定等。

抗原抗体结合具有高度特异性，即一种抗原分子只能与由它刺激所产生的抗体结合而发生反响。

抗原的特异性取决于抗原决定簇的数目、性质和空间构型，而抗体的特异性则取决于抗体IgFab段的可变区与相应抗原决定簇的结合能力。

抗原与抗体不是通过共价键，而是通过很弱的短矩引力而结合，如范德华引力〔Vanderwaal’sattractionforce〕、静电引力〔electrostaticforce〕、氢键〔hydrogenbond〕及疏水性作用〔hydrophobiceffect〕等。

范德华引力与两种相互作用的分子或原子间的距离七次方成反比〔F2＝1/d7），即两者越靠近，此引力越大。

这种引力能否最大限度地发挥作用，关键在于分子的空间构型。

抗原与抗体分子的互补空间关系有助于该引力发挥作用，它可增加两种分子结合在一起的倾向，形成特异性抗原抗体复合物。

假设一个分子在形态上有一个凹陷，它能精确地与另一分子突出的基因互补，如同抗原―抗体、酶―底物系统的活性部位的相互作用，这种相互作用可产生最强的VanderWaal接触。

静电引力又称库仑引力〔Coulumbicattractionforce〕发生在带有相反电荷的基团之间，例如NH3＋与COO－之间。

这种结合力的强度与两个相互作用基团间的距离平方成反比〔F2＝1/d2）。

假设两个分子间有可能发生电荷转移的部位，该部位也可能产生静电引力。

氢键可在共价键结合的氢原子间产生。

氢原子可与一个带负电荷的原子共价结合，再与另一个带负电荷原子的非共价电子相互作用，就形成了氢键。

例如：

－O…H－O－

－O…H－N－

－N…H－N－

氢键较弱，键能的大小取决于方向，即氢键具有方向性。

在抗原抗体反响中氨基或羧基是主要的供氢体，H＋必须直接对着或靠近带负电荷的受体原子，才能产生强的氢键能，假设间接对着，键能则非常小。

氢键比VanderWaal引力更特异，因为它需要分子上存在互补的供氢体和受体基团。

疏水性结合或疏水作用在各种抗原抗体相互反响中十分重要。

抗原和抗体分子上的疏水决定簇在水中不形成氢键，因此倾向于彼此间相互吸引，而不与水发生作用，故称之为疏水性作用。

疏水性作用虽不是引力，但它有助于抗原与抗体结合。

例如含有苯基的抗原决定簇倾向于被其他非极性基团围绕，因此该抗原决定簇从水环境中移动进入抗体分子的Fab段的裂缝中，与抗体结合。

这说明结合的高能量归因于苯基的疏水性作用。

上述这些引力当pH和离子强度在生理条件下，通常是最大的。

pH值低于3～4或高于10.5，这些引力非常弱，以致抗原抗体复合物易解离。

抗原与抗体结合有高度特异性，这种结合虽具有相当稳定性，但为可逆反响。

因抗原与抗体两者为非共价键结合，犹如酶和底物的结合一样，两种分子间不形成稳定的共价键，因此在肯定条件下可以解离。

图8-3沉淀反响

Fig8-3Theclassicalillustrationoftheantigen-antibodyreactioninvitroistheprecipitinreaction.Asincreasingconcentrationsofantigenareaddedtoaconstantamountofantibody,theamountofimmunecomplexprecipitatedrisesandthenfalls.Theprecipitincurvegeneratedinthiswayhasthreezones:

Antibodyexcesszone:

theamountofantigenisinsufficienttoreactwithandprecipitatealltheantibodypresent;thusfreeantibodycanbedetectedinthesupernatant.

Equivalencezone:

theaddedantigenissufficienttocombinewithandprecipitatealltheantibodypresentandneitherfreeantigennorantibodycanbedetectedinthesupernatant.

Antigenexcesszone:

theamountofantigenexceedsthatrequiredtobindalltheantibody,andthisleadstoareductionintheamountofantibodyprecipitated.Thisfallisduetothesolubilizationoftheantigen-antibodycomplexesbytheexcessantigen.Theextenttowhichthisphenomenonoccursvarieswithdifferentantibodiesandwiththespeciesfromwhichtheantibodyisderived.

抗原与抗体的结合，在肯定浓度范围内，只有当两者分子比例适宜时，才出现可见反响。

以沉淀反响为例，分子比例适宜，沉淀物产生既快又多，体积大。

分子比例不适宜时，沉淀物产生少，体积小，或不产生沉淀物。

对参与沉淀反响的抗原―抗体系统可进行定量测定，马上抗体置于一系列的试管中，参加不同量的相应纯抗原，混合后，观察所发生的反响，对沉淀物可作精确定量。

假设抗体量固定不变，抗原量逐渐增加，可观察沉淀反响中抗原、抗体分子的比例关系。

由图8-3可见有三个抗原抗体相互作用的区带，1〕抗体过剩区〔antibodyexcesszone〕：

参加抗原量少，则沉淀物少，上清液中有游离的抗体〔freeantibody〕。

2〕平衡区〔equivalencezone〕：

抗原量逐渐增加，沉淀物也逐渐增多，直到抗原、抗体比例最正确时，则出现连续而稳定的抗原―抗体晶格〔lattice〕沉淀，此时沉淀物中抗原抗体复合物量最多，上清中测不到游离的抗原〔freeantigen〕或抗体，此为平衡区或等价带。

3〕抗原过剩区〔antigenexcesszone〕：

抗原量继续增加，全部抗体均与抗原结合，此时上清液中可测出游离的抗原，在此区带中，由于抗原过剩，则形成可溶性抗原抗体复合物，因而沉淀反响局部或完全被抑制。

抗体与抗原的结合是否出现可见反响，则与抗原抗体的胶体特性及极性基吸附作用有关。

抗体球蛋白和抗原〔大多为蛋白质、也有为多糖、类脂或其它化合物〕在溶液中均属于胶体物质，带有电荷。

胶体粒子又有许多强极性基〔如蛋白质的羧基、氨基及肽链等〕，它们与水有很强的亲和力，以致在粒子外周构成水层，称为亲水胶体。

胶体粒子不带水层者，称为疏水胶体。

胶体粒子的稳定性即依赖于所带的水层及电荷，其中亲水胶体的稳定性较高。

抗体和大多数抗原均属于亲水胶体。

抗体球蛋白中的氨基酸在水溶液中发生电离，放出负电荷和正电荷。

在肯定的pH中，胶体粒子所带的负电荷与正电荷相等，此称为等电点〔isoelectricpoint,pI〕。

当溶液的pH大于其等电点，则羧基电离，胶体粒子带负电荷。

反之，当溶液pH小于其等电点时，则氨基电离，胶体粒子带正电荷。

特异性抗体与相应抗原间有相应的极性基，它们互相吸引而结合。

抗原抗体反响一般分为两个阶段，第一阶段为抗原和抗体的特异性结合，此阶段需时很短，仅几秒到几分钟，但无可见现象出现。

接着为第二阶段，即可见反响阶段，表现为凝集、沉淀、细胞溶化等。

此阶段较长，历时数分钟、数小时以致数天。

此阶段反响现象的出现可受多种因素的影响。

抗原与抗体一般为蛋白质，它们在溶液中都具有胶体性质，当溶液的pH大于它们的等电点时，例如，在中性和弱碱性的水溶液中，它们大多表现为亲水性，且带有肯定量的负电荷。

特异性抗原和抗体有相对应的极性基，抗原和抗体的特异性结合，也就是这些极性基的相互吸附。

抗原和抗体结合后就由亲水性变为疏水性，此时易受电解质影响。

如有适当浓度的电解质存在，就会使它们失去一局部负电荷而相互凝聚，于是出现明显的凝聚或沉淀现象。

假设无电解质存在，则不发生可见反响。

抗原抗体反响，特别是第二阶段受温度的影响很大。

在较高的温度中，由于抗原抗体复合物碰撞时机增多，复合物体积继续增大的时机也多，故反响现象加速出现。

但温度过高〔56℃以上〕，则抗原或抗体将变性或破坏。

一般常置于37℃的恒温水浴中，使反响讯速出现。

适宜的pH是抗原抗体反响必要的条件之一。

pH过高或过低可直接影响抗原和抗体的理化性质。

8.5动物的常规免疫

由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同的动物或同种不同品系动物，甚至不同个体，产生特异免疫应答的强弱是不同的。

因此进行动物免疫时，必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康动物。

常用的实验动物有：

马、羊、兔、豚鼠和鼠等。

当抗原初次进入具有免疫应答能力的动物体内后，经过一段较长的埋伏期才出现抗体，又经过一段顶峰期后，抗体量逐渐下降至消逝。

这段时期总的抗体量是较低的，主要的抗体成分是IgM，此为抗体对抗原的“初次应答“。

当抗原再次进入该机体时，血清中抗体很快出现，含量和亲和力也高于初次应答，其抗体的主要成分是IgG，此为“再次应答〞。

某些物质假设先于抗原或与抗原一起注入人体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂〔immunoadjuvant〕，简称〔adjuvant〕。

佐剂一般分为：

1〕无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；2〕有机佐剂，包含微生物及其代谢产物，如分枝杆菌〔结核杆菌、卡介苗〕、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰氏阴性杆菌的内毒素等；3〕合成佐剂，包含人工合成的双链多聚核苷酸，如双链多聚肌苷酸、胞苷酸〔polyI:

C〕、双链多聚腺苷酸、尿苷酸〔polyA:

U〕等；4〕油剂，如弗氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。

弗氏佐剂是目前在动物实验中最常用的佐剂，可分为弗氏不完全佐剂〔incompleteFreund’sadjuvant,IFA〕和弗氏完全佐剂〔completeFreund’sadjuvant,CFA〕两种。

前者是将抗原和油剂〔石蜡油或花生油〕混合，再参加乳化剂〔羊毛脂或吐温－80〕，使成为油包水乳剂，即为IFA。

在IFA中参加死的分枝杆菌〔如灭活结核杆菌〕就成为CFA。

CFA作用较弱，但易在注射部位形成肉芽肿和持久性溃疡，因而不适于人体使用。

佐剂的生物学作用为：

1〕增强免疫原性，使无或微弱免疫原性的物质变成有效的免疫原；2〕可提高初次应答和再次应答的抗体滴度；3〕改变抗体类型，使由产生IgM转变为产生IgG；4〕引起或增强迟发型超敏反响。

动物个体的不同组织部位对抗原刺激的敏感性也是不同的。

淋巴结、脾脏、足掌、眼睫膜等是反响的敏感部位，也是免疫动物的常用部位。

异体蛋白在佐剂参与下，可诱发机体产生免疫应答，获得相应的抗体。

如果抗原的免疫原性很强，在根底免疫〔第一次免疫〕之后，加强免疫3～4次，便可获得较高效价的抗血清〔antiserum〕。

8.6双向免疫扩散及免疫电泳

将可溶性抗原〔如小牛血清〕与相应抗体〔如兔抗小牛血清的抗体〕混合，当两者比例适宜并有电解质〔如氯化钠、磷酸盐等〕存在时，即有抗原―抗体复合物的沉淀出现，此为沉淀反响〔precipitinreaction〕。

如以琼脂凝胶为支持介质，则在凝胶中出现可见的沉淀线、沉淀弧或沉淀峰。

根据沉淀出现与否及沉淀量的多寡，可定性、定量地检测出样品中抗原或抗体的存在及含量。

免疫学的一些测定方法即基于此特性。

双向扩散法〔doublediffusion〕，最早由Ouchterlony创立，故又称Ouchterlony法。

此法是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反响。

琼脂凝胶是多孔的网状结构，大分子物质可以自由通过，这种分子的扩散作用使分别两处的抗原和相应抗体相遇，形成抗原―抗体复合物，比例适宜时出现沉淀。

由于凝胶透明度高，可直接观察到复合物的沉淀线〔弧〕。

沉淀线〔弧〕的特征与位置取决于抗原相对分