微生物限度方法适应性试验方案汇总.docx

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微生物限度方法适应性试验方案汇总

XXXXXXXXXXX 有限公司

胶囊用明胶微生物限度检查方法适用性试验方案

文件编号：

YZF-QC-001-01

起草人：

（QC）年月日

审核人：

（QA）年月日

批准人：

（质量负责人）年月日

１.验证目的

２.验证原理

３.验证人员

４.相关文件

５.验证内容

６.验证周期

7.验证综合结论

职位

姓名

负责内容

QC 检验员

负责验证方案的起草和实施，并对所测数据准确性负责。

QC 负责人

负责验证方案的审核及按照规定的取样计划对标准检验操作

程序的准确执行，负责组织实施。

QA 负责人

审核人

负责验证方案及报告的审核和批准。

1. 验证目的

建立微生物限度检查方法适用性试验验证，通过验证确认检测所采用的方法

适合于本公司所用原料胶囊用明胶的微生物限度的测定。

2. 验证原理

通过试验数据结果，比较实验组中试验菌的恢复生长结果来评价整个验证方

法的准确性、有效性和重现性。

《中国药典》2015 版四部《通则 1105、通则 1106》

5. 验证内容

通过验证以确认所采用的方法适合于该产品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数

的测定；确认所采用的方法适合于该产品控制菌的检查。

根据样品特性制订检

验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证

标准。

若符合，就按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，

重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验

证标准。

5.1 微生物计数法验证

当建立产品的微生物限度检查时，应进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计

数的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总

数的测定。

验证试验可与供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数同时进

行。

5.1.1 验证用菌种

枯草芽孢杆菌 CMCC（B）63501（第一代）

金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26003（第一代）

铜绿假单胞菌 CMCC（B）44102（第一代）

白色念珠菌 CMCC（F）98001（第一代）

黑曲霉 CMCC（F）98003（第一代）

5.1.2 验证依据：

中国药典 2015 版四部

5.1.3 验证步骤

5.1.3.1 菌液制备

5.1.3.1.1 分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物

至胰酪大豆胨液体培养基中，经 30~35℃培养 18~24 小时后，分别取金黄

色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的肉汤培养物 0.9%无菌氯化钠溶

液 1ml+9ml 0.9%无菌氯化钠溶液，10 倍稀释至 10-6~10-7，细菌数为不大于

100cuf/ml，做活菌计数备用。

5.1.3.1.2 接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，经 20~25℃

培养 2 到 3 天后，取 1~2 环白色念珠菌斜面培养物加入 9ml 0.9%无菌氯化

钠溶液，10 倍稀释至 10-4~10-7，菌液为不大于 100 cfu/ml，做活菌计数备

用。

5.1.3.1.3 接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，经 20~25℃培养

5~7 天后，取黑曲霉斜面培养物，加 3~5ml 含 0.05%（ml/ml）聚山梨酯 80

的 0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，吸出孢子悬液 1ml+9ml0.9%无菌氯

化钠溶液，10 倍稀释至 10-4，菌液为不大于 100cuf/ml，做活菌计数备用。

5.1.3.2阴性对照

为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验。

5.1.3.3 计数方法适用性试验

5.1.3.3.1 供试液制备

取供试品 10g，加 45℃PH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100ml，振

摇，放置 45℃水浴保温使其完全溶解，摇匀，作为 1:

10 供试液，备用。

5.1.3.3.2 试验组：

取 1:

10 的供试液加入试验菌，使 1ml 供试液中含菌量不大于 100cfu。

注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，按平

皿法测定其菌数。

5.1.3.3.3 菌液组：

取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液同试验组操作。

测定

所加的试验菌数。

5.1.3.3.4 供试品对照组：

取制备好的供试液。

以稀释液替代菌液同试验组操作。

按菌落计数方

法测定供试品本底菌数。

5.1.3.3.4 阴性对照组：

取 0.9%无菌氯化钠溶液，空白对照。

技术方

法试验

菌株

菌浓度

（ml

）

试验次

数

菌液

组

供试

品

对照

组

实验

组

回收率

实际

回收率

理论

需氧菌

总数计

数

大肠埃

希菌

10-6

1

0.5～2

10-6

2

0.5～2

10-6

3

0.5～2

金黄色

葡萄球

菌

10-6

1

0.5～2

10-6

2

0.5～2

10-6

3

0.5～2

枯草芽

孢杆菌

10-6

1

0.5～2

10-6

2

0.5～2

10-6

3

0.5～2

白色念

珠菌

10-5

1

0.5～2

10-5

2

0.5～2

10-5

3

0.5～2

黑曲霉

10-5

1

0.5～2

10-5

2

0.5～2

10-5

3

0.5～2

霉菌和

酵母菌

总数计

数

白色念

珠菌

10-5

1

0.5～2

10-5

2

0.5～2

10-5

3

0.5～2

黑曲霉

10-5

1

0.5～2

验证试验结果（常规法）  单位（cuf/ml）

5.1.4 结果

至少应进行 3 次独立试验。

若试验组的菌回收率均 0.5～2，则照该供试液制备

方法和计数法测定供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数；若任一次试验中

试验组的菌回收率不在范围内，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀

集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活

性，并重新进行方法验证，使试验组菌回收率在规定范围内。

5.1.4.1 试验组的菌回收率=[（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌数

组平均菌落数]

5.1.4.2 连续 3 批验证的菌落计数结果

5.1.4.2.1 规格：

0#蓝白 批号：

201412001

技术方

法试验

菌株

菌浓度

（ml

）

试验次

数

菌液

组

供试

品

对照

组

实验

组

回收率

实际

回收率

理论

需氧菌

总数计

数

大肠埃

希菌

10-6

1

0.5～2

10-6

2

0.5～2

10-6

3

0.5～2

金黄色

葡萄球

菌

10-6

1

0.5～2

10-6

2

0.5～2

10-6

3

0.5～2

枯草芽

孢杆菌

10-6

1

0.5～2

10-6

2

0.5～2

10-6

3

0.5～2

白色念

珠菌

10-5

1

0.5～2

10-5

2

0.5～2

10-5

3

0.5～2

黑曲霉

10-5

1

0.5～2

10-5

2

0.5～2

10-5

3

0.5～2

霉菌和

酵母菌

总数计

数

白色念

珠菌

10-5

1

0.5～2

10-5

2

0.5～2

10-5

3

0.5～2

黑曲霉

10-5

1

0.5～2

10-5

2

0.5～2

10-5

3

0.5～2

10-5

2

0.5～2

10-5

3

0.5～2

日

5.1.4.2.2 规格：

0#蓝白 批号：

201412001

日

技术方

法试验

菌株

菌浓度

（ml

）

试验次

数

菌液

组

供试

品

对照

组

实验

组

回收率

实际

回收率

理论

需氧菌

总数计

数

大肠埃

希菌

10-6

1

0.5～2

10-6

2

0.5～2

10-6

3

0.5～2

金黄色

葡萄球

菌

10-6

1

0.5～2

10-6

2

0.5～2

10-6

3

0.5～2

枯草芽

孢杆菌

10-6

1

0.5～2

10-6

2

0.5～2

10-6

3

0.5～2

白色念

珠菌

10-5

1

0.5～2

10-5

2

0.5～2

10-5

3

0.5～2

黑曲霉

10-5

1

0.5～2

10-5

2

0.5～2

10-5

3

0.5～2

霉菌和

酵母菌

总数计

数

白色念

珠菌

10-5

1

0.5～2

10-5

2

0.5～2

10-5

3

0.5～2

黑曲霉

10-5

1

0.5～2

10-5

2

0.5～2

10-5

3

0.5～2

5.1.4.2.3 规格：

0#蓝白 批号：

201412001

日

5.1.5 结论

5.2 控制菌检查法的验证

当建立产品的微生物限度检查时，应进行控制菌检查法的验证，以确认所采

用的方法适合于该产品的的控制菌检查方法测定。

若产品的组分或原检验条件

发生改变可能影响检验结果时，检验方法应进行重新验证。

验证试验也可与供

试品的控制菌检查同时进行。

5.2.1 验证用菌种

大肠埃希菌 CMCC（B）44102（第一代）

乙型付伤寒沙门菌 CMCC（B）50094（第一代）

5.2.2 验证依据：

中国药典 2015 年版四部

5.2.3 大肠埃希菌、沙门菌检查法

5.2.3.1 菌液制备

分别接种大肠埃希菌、乙型付伤寒沙门菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液

体培养基中，经 30~35℃培养 18~24 小时后，分别取大肠埃希菌、乙型付伤

寒沙门菌的肉汤培养物 1ml+9ml 0.9%无菌氯化钠溶液，10 倍稀释至 10-

6~10-7，细菌数为 10~100cuf/ml，做活菌计数备用。

5.2.3.2 阴性对照

为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验。

5.2.3.3 控制菌检查方法适用性试验

5.2.3.3.1 供试液制备：

同需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法验证。

5.2.3.2.2 大肠埃希菌

5.2.3.2.2.1 试验组

取供试品 10ml 及不大于 100cuf/ml 大肠埃希菌接种至 100ml 的增菌培

养基中，依相应大肠埃希菌检查法进行检查。

5.2.3.2.2.2 阴性对照组

取 PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液 10ml 加至 100ml 的增菌培养基中，依

相应大肠埃希菌检查法进行检查。

5.2.3.2.2.3 阳性对照组

取不大于 100cuf/ml 大肠埃希菌 1ml 接种至 100ml 的增菌培养基中，依

相应大肠埃希菌检查法进行检查。

5.2.3.2.3 沙门氏菌

5.2.3.2.3.1 试验组

取供试品 10g 及不大于 100cuf/ml 乙型副伤寒沙门菌接种至 200ml 的增

菌培养基中，依相应沙门菌检查法进行检查。

5.2.3.2.3.3 阴性对照组

取 PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液 10ml 加至 200ml 的增菌培养基中，依

供试品规格批号

项目

试验组

阴性对照组

阳性对照组

麦康凯琼脂培养基

麦康凯琼脂培养基

麦康凯琼脂培养基

供试品规格批号

项目

试验组

阴性对照组

阳性对照组

XLD

XLD

XLD

相应沙门氏菌检查法进行检查。

5.2.3.2.3.4 阳性对照组

取不大于 cuf/m 乙型副伤寒沙门菌 1ml 接种至 200ml 的增菌培养基中，

依相应沙门菌检查法进行检查。

5.2.3.2.4 结果

至少应进行 3 次独立试验。

阳性对照组应检出试验菌，阴性对照组应无菌

生长。

若试验组检出试验菌，照该供试液制备方法和控制菌检查法进行该

供试品控制菌的检查；若试验组未检出试验菌，应采用自然沉降法、培养

基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些

方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

5.2.3.2.4.1 验证连续三批的观察结果

5.2.3.2.4.1.1 大肠埃希菌验证试验结果

日

5.2.3.2.4.1.1 沙门氏菌验证试验结果

日

5.2.3.2.5 结论

6. 验证周期

6.1.药品的组分发生改变可能影响检验结果时。

6.2.验证时检验条件发生改变可能影响检验结果时。

7. 验证综合结论

结论人：

日期：

年月

日