散射截面和散射系数.pptx

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,第三章：

光与生物样品的相互作用,生物光子学,1,主讲教师：

Email:

钱骏副教授,0571-88206516-215/13505815872/636278,Tel:

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http:

/,光与生物样品（细胞、组织）的相互作用,吸收：

光强随着光在生物样品中的传播距离的增加而不断减小,光与生物样散品射：

的相互作用,由于折射率的不,光致发光：

荧光、磷光,光致发热,光声效应,光化学效应：

光蚀除、光诱导、光致活性氧,弹性散射：

瑞利散射、米散射、反射/折射,生物光子学,1,均匀造成的光子传播方向的改变非弹性散射：

拉曼散射、多普勒频移部分非线性光学效应：

二/三次谐波产生、四波混频等,提纲：

3.1生物样品对光的吸收效应3.2生物样品对光的散射效应3.3生物样品发光效应,生物光子学,1,3.1生物样品对光的吸收效应,生物光子学,1,生物样品对光的吸收:

光在通过生物样品时由于部分光能转换成电子、分子的某种运动或热运动从而导致光强度的衰减。

一般吸收：

对一定光谱范围内的所有波长的光的衰减程度相同或相似,选择性吸收：

只对某些特定波长的光有吸收或吸收比较强比如：

角膜和晶状体在可见光波段近似于透明体，但在红外波段表现出强烈的吸收,吸收系数和吸收截面,吸收截面：

被吸收的光功率Pabs与入射光强I0之比（具有面积的量纲）吸收系数：

在单位程长上一个光子被吸收的概率假设某一局部的光子辐射能流率为H（单位：

光子/cm2*s），均匀分布的吸收粒子的能流密度为（单位：

cm-3），则单位时间，单位体积内被吸收的光子数目为（单位：

光子/cm3）。

定义吸收系数比如：

在可见光波段内，水的吸收系数均小于0.026cm-1,生物光子学,1,比尔-朗伯定理：

对于厚度无限薄的吸收层dl，某一波长辐射能的减少由下式给出：

令：

式中，为摩尔吸光系数或摩尔消光系数（mM-1*cm-1），物质特有属性；C为摩尔浓度（mM），l为光程。

设入射到吸收层的初始光强为I0，测量得到的传输光强为I，则：

吸收系数,生物光子学,1,朗伯定律,光密度（opticaldensity）OD=lg（I0/I），即：

比尔-朗伯定理,式中称为消光系数，是吸收物质在特定波长处的特性，不随吸收物质的浓度和光程长度的变化而改变比尔-朗伯定理是比色法和分光（吸收）光度法所依据的基本定律,生物光子学,1,在已知光程的情况下，通过测试不同波长的入射出射光强，则能得到不同成分的浓度C,对于n个吸收物质,测定混合物中各吸收物质含量的定量方法的理论基础对于组织中的n种成分，如water，lipid，HbO，Hb，已知它们的消光光谱,生物光子学,1,分子吸收种类：

生物组织的基本单元是细胞细胞由生物分子组成的分子由碳、氢、氧、氮、磷等原子组成，各个原子之间以化学键相连而组成分子。

对于自由原子（原子间的相互作用可以忽略）：

跃迁的形式：

原子外层电子发生从基态到高能级的跃迁。

跃迁的种类：

Electronictransitions跃迁的条件：

吸收（光）能量，可以是UV,visible,NIRlight,生物光子学,1,非自由原子靠化学键聚在一起组成分子，因此分子对光子的吸收与单个原子的吸收相比要复杂得多,分子的能级取决于分子的运动和状态电子相对于原子核的运动-电子态间的跃迁,生物光子学,1,分子的运动,原子核间的相对振动-振动能级间的跃迁,分子的转动-转动能级间的跃迁,对于分子：

（1）电子相对原子核的运动及吸收,分子中与吸收光谱有关的三种价电子是：

构成单键（如C-C、C-H）的电子构成双键（如C=C键）的电子未共享成键的n电子牢固程度：

键键分子在吸收光辐射能量后可以产生电子态间的跃迁，此时电子由一个低能级的轨道（即成键轨道）跃迁到高能级轨道（称为反键轨道，用上标*表示）,分子也由基态变成为激发态。

跃迁需要的能量最高，一般该吸收发生在真空紫外区，例如C-H的电子跃迁发生在100-150nm。

跃迁需要的能量稍低于跃迁，吸收峰一般发生在近紫外区，例如C=O的吸收发生在小于200nm的光波段跃迁需要的能量较低，吸收峰一般位于近紫外和可见光区总的来说，电子态之间的跃迁所引起的吸收出现在可见光、紫外或波长更短的光谱区,生物光子学,1,

（2）分子的振动及吸收,分子从一个振动态变化到另一个振动态移动时造成的能量的变化伸展振动：

原子沿着键价方向来回运动分子的振动弯曲振动：

原子在垂直于键价方向运动高频区伸展振动能量弯曲振动能量低频区引起振动跃迁的能量通常对应在红外区域,生物光子学,1,振动吸收峰的种类：

生物光子学,1,基频吸收（很强）：

分子吸收红外辐射后，由基态振动能级（=0）跃迁至第一振动激发态（=1）时，所产生的吸收峰称为基频峰。

倍频吸收（较弱）：

振动能级由基态（=0）跃迁至第二振动激发态（=2）、第三振动激发态（=3），所产生的吸收峰称为倍频峰。

由=0跃迁至=2时，=2，即吸收的红外线谱线是分子振动频率的二倍，产生的吸收峰称为二倍频峰。

合频/差频吸收（较弱）：

此外，还有合频峰（1+2，21+2等），差频峰（1-2，21-2等），这些峰多数很弱，一般不容易辨认。

倍频峰、合频峰和差频峰统称为泛频峰。

（3）分子的转动及吸收,生物光子学,1,分子的转动是指分子绕质心进行的运动，转动能级代表分子处于不同转动状态时所具有的能量转动吸收所需要的能量低于实现振动能级跃迁所需要的能量，通常其吸收谱位于红外区。

转动吸收是在振动吸收的基础上所产生的附加的精细结构。

红外光谱区所测得的吸收表现了分子的振动与转动吸收的加和，因此红外光谱也被称为分子光谱或振动光谱。

当分子结构稍有不同时，红外吸收光谱就有细微的差异，并显示出分子特征。

这种情况就像人的指纹一样，因此红外光谱也被称为指纹光谱，可以作为化合物存在某种基团的旁证。

转动能级跃迁需要的能量振动能级跃迁需要的能量电子跃迁需要的能量分子吸收总能量可以看成是电子、振动和转动能量的总和,生物光子学,1,各光波段对应的跃迁,要把电子跃迁和分子振动、转动的跃迁完全分开是不可能的。

由于转动、振动在电子态间形成了很多精细能级，因此可能发生的跃迁是多种多样的，分子吸收光谱应该是带状光谱而非线状光谱。

生物光子学,1,生物样品中的吸收物质,生物光子学,1,水（74%ofbodymass）油脂（ineverycell）黑色素（inskin）血红蛋白/氧合血红蛋白（inblood）血糖（inblood）,水的吸收光谱,在小于800nm的波段内，水的吸收系数均小于0.026cm-1，说明光在水中传输100cm后，至少还剩余约7%的光强。

在1460nm处，水的吸收系数约为28.4cm-1，说明光在水中传输1mm，只剩余原来约6%的光强。

生物光子学,1,油脂、血红蛋白/氧合血红蛋白等的吸收光谱,生物光子学,1,水、血糖、白蛋白在1000-2500nm范围的吸收光谱,生物光子学,1,生物组织的光学透明窗口,光学透明窗口只由吸收决定吗？

答案是否定的，另外一个重要的因素就是散射,生物光子学,1,3.2生物样品对光的散射效应,生物光子学,1,散射与反射、折射等的区别？

生物光子学,1,如果待测样品的折射率不均匀尺度远大于光波长的数量级，例如处理样品边界、样品和探测器之间的区域时，则发生折射，反射等宏观的效应。

此时更多考虑光的波动性。

如果尺度达到光波长数量级的待测样品小块间存在折射率的较大差异，光线除了按照几何光学规律传播发生反射和折射外，还会发生散射。

此时更多考虑光的粒子性，同时待测样品也要被看作是由亚微米或微米量级尺度的离散颗粒组成。

弹性散射：

入射和散射光子频率相同如瑞利散射，米散射光散射非弹性散射：

入射和散射光子频率不同如拉曼散射，布里渊散射,生物光子学,1,弹性散射的分类,相对折射率m：

散射粒子的折射率ns和背景媒质的折射率n之比,尺寸参数x：

散射粒子的半径和入射波长的比,当x50时，散射属于几何光学范畴，光会在样品边界发生反射和折射根据粒子的尺寸进行的划分,生物光子学,1,瑞利散射：

散射光的强度与波长的四次方成反比，即散射光的强度随波长增加而减小。

散射前后向对称。

米散射：

散射强度比瑞利散射大得多对波长的依赖性弱。

散射粒子的尺寸与光波长相近时，散射光强度的对称性被破坏。

散射具有强烈的前向趋势，且随着颗粒尺寸的增加，散射的前向趋势也随之增大,生物光子学,1,细胞内的弹性散射,生物光子学,1,散射截面和散射系数,散射截面：

光强为I0的光在被粒子散射后，部分光功率Psca成为空间各个方向的分布，定义被散射的功率与入射光强度的比值为散射截面（具有面积的量纲）散射系数：

单位体积内具有个散射粒子，每一个粒子的散射截面均为，则定义散射系数为（单位：

cm-1）经过距离l后没有被散射的光强表示为：

生物光子学,1,修正的比尔-朗伯定理,背景引起的损耗,绝大多数生物样品同时具有吸收和散射效应，则：

总衰减截面：

总衰减系数：

对于足够薄的生物样品，如细胞，散射所导致的光程增加可忽略，则：

对于厚的生物样品，如生物组织，散射所导致的光程增加不可忽略，则：

路径因子，用以描述,生物光子学,1,散射引起的光程加长,由生物组织出射的光子的分类,提高高散射生物样品中成像深度的方法：

选择合适的光波长，降低散射效应在组织中加入适当的清透剂，使组织内部的折射率相对匹配,生物光子学,1,Olympus公司清透剂,WD:

4mmor8mm,生物光子学,1,小鼠大脑孵育清透剂两周前后,CUBIC（clear,unobstructedbrainimagingcocktails）,COCKTAIL:

chemicalmixturescontainingaminoalcohols,mCherry,EGFPNeuron-YFPCell157,7267392014,生物光子学,1,非弹性散射：

拉曼散射,拉曼散射（RamanScattering）是指当光通过介质时与分子发生相互作用而引起的频率发生变化的非弹性散射。

印度物理学家C.V.Raman1928年发现拉曼散射，1930年因此获得诺贝尔物理学奖,生物光子学,1,当处于在基态（E0）的分子受到能量为h0的入射光子碰撞时，由于介质分子以某个频率m振动或者转动吸收了入射光子的一部分能量，这时辐射出的散射光（h0-hm）叫做斯托克斯线，光子能量变少，波长发生红移若分子处于激发态（E0+hm），碰撞过程中介质分子释放出一部分能量，则辐射出反斯托克斯线（h0+hm），光子能量变大，波长发生蓝移。

遵守波尔兹曼分布定律，反斯托克斯线的强度比斯托克斯线弱,当入射光子和分子相碰撞时，分子的振动能量或转动能量和光子能量相叠加，因此利用拉曼光谱可以把处于红外区的分子能谱转移到可见光区来观测，反映了分子的结构和振动，也是一种指纹光谱。

生物光子学,1,增强拉曼光谱的方法,增大102106倍荧光背景噪声特定波长激发,自发拉曼散射非常弱，大约一百万个光子中才有一个作用产生拉曼光子。

如何提高拉曼散射的强度？

共振拉曼散射表面增强拉曼散射,增大1041012倍克服荧光背景噪声引入新的金属材料,受激拉曼散射（SRS）相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）,增大约105倍低背景噪声无需引入金属材料系统复杂,生物光子学,1,（SERS）针尖增强拉曼散射（TERS）,（增强）拉曼光谱在生物光子学中的应用,拉曼编码,生物成像,生物医学诊断生物分子传感,生物光子学,1,3.3生物样品发光（luminescence）效应,自发发光激励发光：

光致发光（photonluminescence），电致发光，声致发光，化学发光,生物光子学,1,荧光（fluorescence）磷光（phosphorescence）,单重态和三重态,单重态（singlet,S）：

同一轨道上的电子具有相反方向的自旋单重激发态（S1,S2）：

被激发的电子在新轨道中的自旋方向和（自己）原来相同三重激发态（t