南医生化实验报告2.docx
《南医生化实验报告2.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《南医生化实验报告2.docx(12页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
![南医生化实验报告2.docx](https://file1.bdocx.com/fileroot1/2023-2/21/db4efdf3-4a8e-4a05-9a68-716ff4eca85d/db4efdf3-4a8e-4a05-9a68-716ff4eca85d1.gif)
南医生化实验报告2
南方医科大学
生物化学实验报告
一、实验目的
1.学习并掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理、各试剂的作用及具体操作步骤;
2.学习并掌握PCR基因扩增的原理及具体操作步骤;
3.学习并掌握紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理及方法;
4.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的操作方法。
二、实验原理
1.质粒DNA的提取——碱裂解法
在细菌细胞中,染色体DNA以双螺旋结构存在,质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后,染色体DNA和质粒DNA均被释放出来,但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH高达12.6的碱性条件下,细菌的线性染色体DNA氢键断裂。
其中,双螺旋结构解开而变性;而质粒中超螺旋结构共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。
当以pH4.8的高盐缓冲液调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA复性并保存在溶液中,线状染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心与变性蛋白质与细胞碎片缠绕在一起形成沉淀;而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,溶于上清液。
2.PCR基因扩增
PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶链式反应,可以选择性扩增一段DNA序列。
是指在DNA聚合酶催化下,以DNA为模板,特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,在体外复制DNA的过程。
这种延伸—变性—退火—延伸的循环可以重复多次,使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。
具体步骤为:
(1)变性:
加热使模板DNA在高温下(94℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链;
(2)退火:
使溶液温度降至50~60℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合;
(3)延伸:
溶液反应温度升至72℃,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸,按5’→3’方向复制出互补DNA。
上述3步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍。
3.紫外光吸收法定量检测质粒DNA
核酸的最大吸收波长为260nm,蛋白质的最大吸收波长为280nm。
核酸分子对紫外光的吸收强度与溶液中核酸的浓度成正比,即光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。
故可通过测定在260nm和280nm的A值的比值(A260/A280),估计核酸的纯度。
4.酶切鉴定
限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上,并在此切割双链DNA。
5.琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构,构成大网孔型凝胶。
不同的琼脂糖浓度对应不同孔径的凝胶,可用于分离、纯化相对分子量不同的DNA分子。
DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。
不同DNA分子因其所带的电荷数、相对分子量大小和构象不同,在同一电场中的电泳速度也不同,从而从而分出不同的区带,达到分离的目的。
三、材料与方法:
1.实验材料
(1)质粒DNA的提取—碱裂解法
样品:
菌液
试剂:
LB培养基(液体、固体)、溶液P1(S1)、溶液P2(S2)、溶液P3(S3)、去蛋白液PE(W1)、漂洗液WB(W2)、洗脱液EB(Eluent)
仪器:
恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅、Eppendorf管、吸附柱、1.5ml收集管、离心管
(2)PCR基因扩增
样品:
菌液
试剂:
2×PremixTaq、引物1-SO100(10mol/L)、引物2-SO101(10mol/L)、灭菌的去离子水
仪器:
加样枪、0.2mlPCR反应管、台式离心机、基因扩增仪
(3)紫外光吸收法定量检测质粒DNA
样品:
提取的质粒DNA溶液
试剂:
灭菌的去离子水
仪器:
紫外分光光度计、UVette比色皿、1.5mlEP管、加样枪
(4)酶切鉴定
样品:
菌液
试剂:
灭菌的去离子水、10×R+BSA酶切缓冲液、质粒DNA、HindIII(15U/ul)、EcoRI(12U/ul)
仪器:
0.2ml收集管、加样枪、台式离心机
(5)琼脂糖凝胶电泳
样品:
质粒DNA溶液、PCR产物、酶切产物
试剂:
6×loadingbuffer、电泳缓冲液、DNAMarker5000
仪器:
加样枪、凝胶成像分析系统、电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪
2.实验流程
(1)质粒DNA的提取—碱裂解法
13000rpm离心1min洗脱质粒DNA,保留备用。
(2)PCR基因扩增
取0.2mlPCR反应管一只,用微量加样枪加入4.5μl灭菌去离子水;
加入12.5μl2×PremixTaq;
加入1.5μl引物1-SO100(10mol/L);
菌液煮沸10min,冷冻,室温解冻后离心取上清;
将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心;
加入5μl菌液;
加入1.5μl引物2-SO101(10mol/L);
将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上。
(3)紫外光吸收法定量检测质粒DNA
取2μl质粒DNA溶液,加入UVette比色皿中,并与98μl灭菌的去离子水充分混合,测量并记录数据;
打开紫外分光光度计,在UVette比色皿中加入98μl灭菌的去离子水,调零;
重复上一步骤2次,测量并记录数据。
(4)
取0.2mlPCR反应管一只,用微量加样枪加入9.0μl去离子的无菌水;
酶切鉴定
加入2.0ml10×R+BSA酶切缓冲液;
加入7.0μl质粒DNA;
混合均匀后,37℃水浴1.5h。
加入1.0μlHindIII(15U/ul)
加入1.0μlEcoRI(12U/ul)
电泳板放入电泳槽;
胶床准备;
铺胶;
(5)琼脂糖凝胶电泳
凝胶准备;
上样:
每排样品孔预留第一个孔,加DNAMarker5000;
第一孔:
5μl质粒DNA+1μl6×loadingbuffer混匀后上样;
加电泳缓冲液;
第二孔:
5μl酶切产物+1μl6×loadingbuffer混匀后上样;
第三孔:
5μlPCR产物直接上样;
拍照。
电泳;
四、结果与讨论:
1.实验结果
(1)紫外光吸收法定量检测质粒DNA
根据本次实验数据记得下表:
测定次数
A260/A280
DNA浓度(μg/ml)
1
1.96
34.8
2
1.82
36.9
3
2.09
31.8
平均值
1.96
34.5
经查阅资料可知:
A260/A280即Ratio的数值有以下含义:
当Ratio=1.8,则表示DNA样品较纯,符合实验要求;
当Ratio>1.9,则表示DNA样品有RNA污染;
当Ratio<1.6,则表示DNA样品有蛋白质或其它杂质的污染。
而本人本次实验所测,Ratio=1.96>1.9,所以本次提取的质粒DNA有RNA污染。
同时DNA平均浓度为34.5μg/ml,表示本提取的质粒DNA含量较低。
(2)琼脂糖凝胶电泳
本次实验琼脂糖凝胶电泳结果如下:
本次实验琼脂糖凝胶电泳预期结果如下:
经与预期实验结果对比:
实验中质粒DNA的区带与预期实验结果中质粒DNA的区带略有区别。
预期实验结果中质粒DNA有两个区带,表示其中一种片段长度在5000bp以上,另一种片段长度在2000bp-3000bp之间;而本次实验显示,质粒DNA有三个区带,其中两种片段长度都在5000bp以上,另一种片段长度在2000bp-3000bp之间。
实验中酶切产物的区带与预期实验结果中酶切产物的区带不一致。
预期实验结果中酶切产物有两个区带,分别为酶切长片段,长度在2000bp-3000bp之间;含目的DNA片段的酶切短片段,长度在250bp-500bp之间。
而本次实验显示,酶切产物仅一个区带,且长度大约为3000bp,与酶切长片段长度基本一致;但含目的DNA片段的酶切短片段区带缺失。
实验中PCR产物的区带与预期实验结果中PCR产物的区带相一致,仅一个区带,且PCR产物的片段长度在250bp-500bp之间。
2.结果分析
本次实验结果显示:
(1)本次提取的质粒DNA有RNA污染且质粒DNA的含量较低。
(2)质粒DNA有三个区带,其中两种片段长度都在5000bp以上,另一种片段长度在2000bp-3000bp之间;酶切产物仅一个区带,且长度大约为3000bp,与酶切长片段长度基本一致;但含目的DNA片段的酶切短片段区带缺失;PCR产物仅一个区带,且PCR产物的片段长度在250bp-500bp之间。
为此,经查阅资料与和同学讨论得以下影响因素及注意事项:
a.加入250μl溶液S1时,可剧烈震荡,使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液,不能有结块,此时细胞尚未破裂,染色体不会断裂;
b.加入250μl溶液S2时,时间勿太久,轻轻颠倒4-6次,动作要温柔,不可剧烈震荡,避免把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中;
c.加入350μl溶液S3时,复性时间不宜过长,也不可以剧烈震荡;
d.EP管与管盖相连的一侧最好朝向离心机的外侧,便于离心后吸取上清液,吸取上清液的时候注意不要碰到沉淀;
e.在用70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀时,应尽量将乙醇挥发干净,因为残留较多乙醇,以后在做酶切鉴定的时候,乙醇会使限制性内切酶失活;
f.菌液离心后除去上清液时,上清液应尽可能去除干净。
为最大限度去除上清,可在倒掉部分上清后,再将离心管放入离心机稍作离心,使残留在管壁的液体集中到离心管底部;
g.注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。
也不要快速按出吸头内的样品,避免挤出的空气将样品冲出样品孔;
h.DNA区带不清晰,有可能是点样量少或过大,也有可能是电压过高、凝胶有气泡、凝胶孔破裂等原因;
i.为了消除RNA的影响,可以在电泳前加入RNA酶(约每10μlDNA加1μlRNA酶),37℃水浴30min;
j.配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。
因为pH或离子强度很小的差别也会在凝胶前部造成紊乱,严重影响DNA片段的电泳。
3.讨论总结
(1)碱法提质粒中溶液I、II、III的作用?
溶液I:
由50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris·Cl(pH8.0)、10mmol/LEDTA(pH8.0)和Rnase组成。
作用是用葡萄糖悬浮细胞,EDTA鳌合金属镁离子、钙离子使DNase失活,也为溶菌酶的反应提供较低的离子强度的环境;
溶液II:
由0.2mol/LNaOH和1%SDS组成。
作用是溶解细胞膜上的脂质和蛋白,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。
还可以解聚细胞中的核蛋白。
SDS可以与蛋白质结合,使蛋白质变性而沉淀下来。
溶液III:
5mol/L乙酸钠、冰乙酸和水组成。
作用是使溶液的pH调回中性,使变性的质粒DNA能够复性并稳定存在。
Na+可以中和DNA,且钠盐可以与SDS-蛋白复合物作用,从而使变性蛋白-SDS和线性DNA沉淀。
(2)结合实验情况,如何提高限制性酶切的反应效率?
a.若在DNA样品中若含有蛋白质,或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS和某些高浓度金属离子,均会降低限制酶的催化活性,甚至使限制酶不起作用。
所以应该提高DNA的浓度,尽量将其中的蛋白质除尽;
b.不同限制性核酸内切酶对NaCl浓度的要求不同。
据此可分为高盐、中盐和低盐缓冲液,在进行双酶解或多酶解时,若这些酶切割可在同种缓冲液中作用良好,则几种酶可同时酶切;若这些酶所要求的缓冲液有所不同,可以先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化DNA,然后补足适量的NaCl,再用要求高盐缓冲液的限制酶消化;
c.DNA分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响,如消化超螺旋的DNA比消化线性DNA用酶量要高出许多倍,可以改变DNA的构象,使其简单化。
有些限制酶在消化它们自己的处于不同部位的限制位点,其效率也有明显差异;
d.实验中要有适宜的温度,多数限制内切酶的最适反应温度是37℃,少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37℃。