胎儿游离DNA浓度低导致无创产前检测失败的相关因素研究进展cffDNANIPT.docx

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胎儿游离DNA浓度低导致无创产前检测失败的相关因素研究进展cffDNANIPT

胎儿游离DNA浓度低导致无创产前检测失败的相关因素研究进展（cffDNA、NIPT）

      随着母血中胎儿游离DNA（cell－freefetalDNA,cffDNA）的发现，无创产前检测（non－invasiveprenataltesting,NIPT）技术迅猛发展。

大量研究表明，NIPT在胎儿非整倍体检测中具有较高的敏感性和特异性，对21－三体、18－三体和13－三体的检出准确率分别达到99.3％、97.4％和97.4％，总体假阳性率＜1％[1－9]，比唐氏综合征血清学筛查的准确率更高[10]。

NIPT主要通过提取母体外周血血浆中的游离DNA片段（包括母体和胎儿的DNA片段），进行基因组测序，并将测序结果进行生物学分析，从而检出胎儿染色体是否存在非整倍性变异。

由于其具有无创性，避免了羊膜腔穿刺、绒毛膜活检、脐静脉穿刺等有创性取材方式带来的感染、出血以及流产等风险，所以深受广大孕妇和临床工作者的青睐。

新一代的高通量基因测序技术具有快速、自动化、大规模、精确、并行测序等优势，可以精确、快速计算出母体血浆中各种游离DNA的含量，经序列比对计算每条染色体的相对数量，进而发现胎儿21－三体、18－三体、13－三体及少数性染色体异常。

      母体外周血中混合了母体和胎儿两者的游离DNA，能否准确检测出胎儿非整倍染色体异常主要取决于cffDNA占母体血中所有游离DNA的比例，即cffDNA浓度。

大量研究表明，cffDNA的平均浓度为10％~15％，变化范围可以达到3％~30％，甚至更大[1,11－12]。

通常情况下，胎儿非整倍体的基因筛查要求cffDNA浓度至少达到4％，1％~3％的母体血浆达不到此最低标准[1,12]。

如果母血中的cffDNA浓度过低（＜4％），异常的胎儿DNA可能受相对大量的母体正常整倍体DNA影响而无法检测出准确结果，通常建议这部分孕妇重新采血再次检测，如果重采血的cffDNA浓度仍低于4％，则第2次NIPT依然会失败。

NIPT失败不仅给孕妇造成困扰，还降低了该技术在临床应用的可行性及优势性。

因此，探究影响cffDNA低浓度的因素，分析NIPT失败的原因，针对不同孕妇制定个体化的产前遗传学检测方案，具有重要的临床意义。

现就cffDNA低浓度的影响因素进行综述。

一、影响母体外周血中cffDNA浓度的相关因素

      目前研究表明，cffDNA浓度受母体和胎儿两方面因素影响，已经证实与孕周呈正相关，与孕妇体重、体重指数（bodymassindex，BMI）呈负相关，胎儿染色体核型也会影响母血中的cffDNA浓度，孕妇的妊娠期并发症或合并症、年龄、中孕期唐氏综合征血清学筛查的危险系数及胎儿颈项透明层厚度等也是潜在的影响因素[13－28]。

二、cffDNA浓度与孕周的关系

      近期研究表明，cffDNA浓度与采血时的孕周有很强的正相关性。

随着孕周增加，胎盘体积逐渐增大，凋亡的滋养层细胞增多，因此释放到母血中的DNA片段增加，导致cffDNA浓度升高。

国外一项研究纳入了22384例妊娠10周以上的单胎孕妇进行对照分析，发现cffDNA浓度随孕周增加而升高，但增长速度不一致，从孕10周到孕21周，cffDNA浓度每周升高0.1％，孕21周之后每周升高1％[13]。

另一项大样本量（n=140377）的回顾性队列研究，测定cffDNA浓度，发现孕20周前每周升高0.083％，20周之后每周升高1％，以3.7％的cffDNA浓度为界确定了孕周的临界值为9~10周，这个孕周之前取血，将无法检测出结果[14]。

三、cffDNA浓度与孕妇体重及BMI的关系

      研究cffDNA浓度与孕妇体重的关系有助于为肥胖人群选择合适的采血孕周和产前筛查方式，减少无意义的临床行为，避免对孕妇和临床医生造成恐慌与困扰。

      2004年，利用特异性Y染色体探针技术测定中孕期母体血浆cffDNA浓度的研究首次发现了孕妇体重与cffDNA浓度之间存在负相关[15]。

另一项研究纳入400例孕11~13周的孕妇，孕妇体重范围为60~120kg，结果显示对应平均cffDNA浓度从12％下降到6％，分析认为cffDNA浓度与孕妇体重的关系主要受母血中总体游离DNA含量的影响，随着孕妇体重的增长，血容量增加导致血中的总体DNA含量升高，从而稀释了外周血中的cffDNA，使cffDNA浓度降低[16]。

后续研究证实了这一观点，该研究分析1482例孕育整倍体的单胎妊娠孕妇，依据体重、孕周及是否有阴道出血计算出一个预测cffDNA浓度的线性回归方程，即cffDNA拷贝数/ml=6283×1/体重（kg）+3.6×孕周+12.8×是否阴道出血－16.0[17]。

      一项回顾性队列研究将孕妇体重按间隔10kg分为一组，发现不同体重区间孕妇cffDNA浓度差异有统计学意义（P=0.0003），与体重变化呈负相关，且cffDNA浓度高于4％的比例随体重增长而依次递减，说明体重越大的孕妇发生NIPT失败的概率越高[13]。

除此之外，因为母体血容量受体重和身高2方面影响，所以该研究认为用BMI或血容量这种综合的指标替代体重更有意义。

因为在肥胖孕妇中，脂肪组织通过脂肪细胞坏死或基底层的血管组织凋亡进行活跃的脂肪重建，脂肪细胞裂解后，游离DNA释放入血，从而导致血中母体来源的DNA含量更高[18]。

进而推测，用体脂率代替BMI可能更加准确，因为有些BMI高的孕妇，肌肉含量很高，脂肪含量很低，所以体脂率相对较低，测得的cffDN浓度可能比体脂率高但BMI值低的孕妇更高[16]。

但临床上并不常规测定孕妇的体脂率，所以相关研究或应用较难实现。

      但也有研究认为，与孕妇BMI相比，孕妇体重与cffDNA浓度的相关性更为显著。

该研究将孕妇体重、BMI、血容量、身高按与cffDN浓度的相关性强度进行了排序，由大到小依次为体重、BMI、血容量和身高（Spearman´sρ=－0.4072、－0.3934、－0.3780和－0.1970），说明与BMI和血容量相比，孕妇体重与cffDNA浓度的关系更接近线性关系[14]。

      上述研究表明，孕妇体重或BMI增加会降低cffDNA浓度。

因此，为肥胖孕妇确定一个行NIPT检查的合适孕周范围，以降低NIPT失败的发生率具有重要临床意义。

一项单中心回顾性队列研究探讨了孕妇BMI与NIPT失败发生率的关系，按世界卫生组织制定的BMI分级将2385例孕妇按体重逐级分层（偏瘦：

BMI≤18.5；正常：

BMI18.5~24.9；超重：

BMI25~29.9；肥胖Ⅰ级：

BMI30~34.9；肥胖Ⅱ级：

BMI35~39.9；肥胖Ⅲ级：

BMI≥40），通过分类变量的单因素方差分析发现无论哪个体重级，其NIPT失败的发生率均随孕周的增长而下降。

其中BMI＞35（肥胖Ⅱ、Ⅲ级）的孕妇从孕8周到孕16周NIPT失败的发生率有显著下降趋势（下降了4.5％），孕21周后与正常体重孕妇的差异无统计学意义[19]。

但NIPT检测孕周越大风险越高，因为可能会延迟胎儿非整倍体的诊断时间。

所以对于明显肥胖的孕妇（BMI＞35），适当延迟检测孕周对降低NIPT失败的发生率有一定的可行性。

唯一不足的是，该研究没有定量分析cffDNA浓度，NIPT失败也可能是其他因素引起，因此无法显示cffDNA浓度对检测结果的影响[19]。

随着NIPT的普及和肥胖孕妇的增加，NIPT失败较为常见，主要受cffDNA浓度的影响，因此需要确定一个对于NIPT可行的体重或BMI限值。

目前，临床医生对明显肥胖的孕妇，应该事先考虑到其发生NIPT失败的可能性更高，需要告知相关风险。

四、cffDNA浓度与妊娠相关并发症/合并症的关系

      一些妊娠期的母体及胎儿并发症影响cffDNA浓度，已经证实某些并发症可以使cffDNA浓度升高，比如子痫前期、胎儿生长受限、早产、前置胎盘和妊娠剧吐等[20]。

cffDNA来源于凋亡的胎儿滋养层细胞，经过胎盘屏障时受母体免疫攻击破裂、坏死，从胎盘的合体滋养层细胞中进入母血自然降解成DNA片段，绝大部分的cffDNA包裹在核小体内部，与胎儿游离RNA相比，其在外周血中的性质更加稳定。

基于这一原理推测，子痫前期、胎儿生长受限等并发症，因为胎盘功能不全、免疫炎症反应或缺血缺氧继发的胎盘灌注不良导致细胞裂解、坏死，胎盘释放DNA增加，从而可能使cffDNA浓度升高。

      肥胖是导致cffDNA浓度低的高危因素，根据体重与cffDNA浓度的负相关性推测临床上常伴有肥胖的疾病如多囊卵巢综合征（polycysticovarysyndrome,PCOS）、激素治疗的自身免疫性疾病和糖尿病也可能会导致cffDNA浓度降低，使NIPT失败的发生率增加，但目前的研究结果尚未证实这一观点。

一项研究选取了257例PCOS患者，采用双盲随机对照试验分别予二甲双胍治疗或者安慰剂，发现早孕期二甲双胍治疗组的cffDNA浓度大于安慰剂组，中晚孕期差异无统计学意义[21]。

二甲双胍常用于治疗肥胖和胰岛素抵抗的PCOS患者，可以减轻患者体重，但没有直接证据表明PCOS患者的cffDNA浓度降低。

另一项研究比较了4例经治疗的抗磷脂综合征患者和21例正常孕妇cffDNA浓度及其随孕周的变化，结果差异无统计学意义，但该研究认为抗磷脂综合征作为一种自身免疫性疾病，会促发胎盘病理性的免疫炎症反应，从而使滋养层细胞凋亡破裂增加，可能会使cffDNA浓度升高而不是降低[22]，故确切结果有待进一步研究。

大样本研究发现，糖尿病合并妊娠（n=41）、甲状腺功能亢进（n=62）孕妇的cffDNA浓度与正常孕妇（n=22650）差异无统计学意义[23]。

      cffDNA浓度的变化机制尚处于猜测中，妊娠相关并发症的发生机制复杂，目前尚未检索到大样本量研究证明哪种并发症可使cffDNA浓度降低。

五、cffDNA浓度与胎儿染色体核型的关系

      近年来，有研究发现NIPT检测结果的Z值受母体血浆中cffDNA浓度的影响，并呈现一定的线性增长关系[24]。

Z值是测序数据经去低质量、去重复、GC校正等处理后得到的21、18和13号染色体的风险判断值，以Z值＞3判断为该染色体三体阳性[25]。

异常染色体的比例与cffDNA浓度成正比，cffDNA浓度越高，异常的染色体越容易被检测到；相反，cffDNA浓度越低，异常的胎儿DNA可能受相对大量的母体正常整倍体DNA影响而无法检测出准确的结果。

换言之，因cffDNA浓度低导致NIPT失败的人群胎儿非整倍体的风险更高。

      2项回顾性研究分析了超过16000例孕妇，结果发现母血中的cffDNA浓度低会增加胎儿非整倍体的风险，其中三倍体最常见（31％），21－三体在cffDNA低浓度病例中占23％[26－27]。

研究显示，与正常整倍体胎儿相比，21－三体胎儿孕妇cffDNA浓度升高，胎儿18－三体、13－三体时cffDNA浓度下降[16]。

胎儿染色体核型对cffDNA浓度的影响是随孕周变化而变化的，其中21－三体在孕16周之前与整倍体的cffDNA浓度相似，在孕16周后比整倍体更高；18－三体在孕21周之前cffDNA浓度远低于整倍体，但孕21周后2者差异无统计学意义；13－三体，起始cffDNA浓度最低，到18周后超过正常整倍体，孕20周开始超过21－三体，成为cffDNA浓度最高的染色体核型，直到孕28周后浓度逐渐降低[14]。

      虽然胎儿染色体核型导致cffDNA浓度变化的生物学机制尚不确定，但cffDNA浓度与染色体核型具有比较明确的相关性，说明对NIPT失败人群完善产前诊断和提供遗传咨询，并对其胎儿结局进行随访十分重要。

六、cffDNA浓度与孕妇年龄、唐氏综合征血清学筛查结果、胎儿颈项透明层厚度等非整倍体高危因素的关系

      一项回顾性队列研究将3007例孕10周以上、年龄超过18岁的单胎妊娠孕妇按孕妇年龄、中孕期唐氏综合征血清学筛查的危险系数和胎儿颈项透明层厚度作为胎儿非整倍体的危险因素，分为高风险人群和低风险人群，比较cffDNA浓度，结果发现每种影响因素的高风险和低风险人群中cffDNA浓度差异并无统计学意义，即cffDNA浓度不受孕妇年龄、中孕期唐氏综合征血清学筛查的危险系数和胎儿颈项透明层厚度这3个因素的影响[28]。

七、重采血可行性

      临床上对于首次检查发现cffDNA浓度低的孕妇先进行重采血检测，而不直接进行有创产前诊断。

目前重采血时机选择及再次NIPT获得结果的可能性尚未达成共识，因为重采血时，随着孕周的增加，孕妇体重和BMI也会增加。

      一项研究纳入22384例单胎妊娠孕妇，357例第1次采血时的cffDNA浓度＜4％，其中135例进行了重采血，2次采血的平均间隔时间为3.6周，总体22384例孕妇与重采血的135例孕妇比较，初次采血的平均孕周更小（13.9与15.8周，P＜0.0001），初次采血的平均体重更高（103与73kg，P＜0.0001），重采血孕妇的平均cffDNA浓度较初次采血的孕妇升高1％。

重采血的135例孕妇中有76例（56％）第2次采血的cffDNA浓度＞4％，对135例孕妇进行了体重分层（孕妇体重：

＜90kg，90~100kg，100~110kg，110~120kg，120~130kg，130~140kg以及≥140kg），发现重采血时cffDNA浓度＞4％的孕妇占所有重采血的135例孕妇的比例随体重增加而下降[13]，也就是说体重越大的孕妇再次进行NIPT的成功率越低。

因此，需要预先限制重采血人群的体重范围。

      另一项研究比较了2次采血的时间间隔与第2次NIPT成功率的关系。

该研究纳入了684例因cffDNA浓度低导致NIPT失败的孕妇，其中有371例选择重采血进行第2次NIPT，208例第2次NIPT成功，成功率为56.2％（208/371）。

同一孕妇2次采血的时间间隔波动在1~40d，平均为14d。

将这371例孕妇按2次采血的间隔时间长短逐级分层，NIPT成功率分别为71.43％（间隔1~10d，n=35）、53.85％（间隔11~20d，n=247）、53.42％（间隔21~30d，n=73）、50.00％（间隔31~40d，n=16），可见2次采血的时间间隔在1~10d时第2次NIPT的成功率最高，而间隔11~40d的成功率基本波动在同一水平（略高于50％），所以延长2次采血的时间间隔并不一定能增加第2次采血时NIPT的成功率[14]。

      当第1次NIPT失败时，选择重采血进行NIPT是一个可行的办法，50％~60％的孕妇第2次NIPT会得到结果[27,29]。

对于第2次NIPT失败的孕妇，建议接受进一步的遗传咨询、全面的超声评估和产前诊断[30]。

但美国医学遗传与基因组学学会在2016年发布的关于NIPT在胎儿染色体非整倍体疾病筛查的应用指南中建议：

如果孕妇是在合适的检测孕周出现了cffDNA浓度低导致的NIPT失败，建议患者直接进行产前诊断，而不是重采血再次NIPT检测[31]。

      综上所述，孕周和体重对母血中cffDNA浓度的影响基本明确，孕周越小，体重越大，cffDNA浓度越低，NIPT的失败率越高，所以临床上需要告之相关风险，根据患者的体重情况确定个体化的采血时间，对于明显肥胖的孕妇建议进行传统的血清学检测替代NIPT。

但仍有一部分cffDNA浓度低导致NIPT失败的原因不明，后续关于胎儿染色体核型、母体并发症/合并症、重采血时机和其他影响cffDNA浓度的因素研究需要进一步完善。

另外，导致NIPT失败的原因除了cffDNA浓度低，还可能与实验室设备误差，肿瘤或有输血、移植史的患者体内存在异源性的基因干扰，微缺失、微重复等复杂的染色体核型有关，NIPT报告中应该明确标注cffDNA浓度值，相关医务人员应结合这部分患者的临床情况进一步明确导致cffDNA浓度低的相关因素。