基因工程的载体和工具酶.docx

基因工程的载体和工具酶.docx

《基因工程的载体和工具酶.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程的载体和工具酶.docx（24页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

基因工程的载体和工具酶

第二章基因工程的载体和工具酶

【教学时数】9小时

【教学目录与学时分配】

2.1载体（6）

2.1.1质粒载体

2.1.2噬菌体载体

2.1.3其他载体

2.1.4穿梭载体与表达载体

2.2工具酶（3）

2.2.1限制性内切核酸酶

2.2.2DNA聚合酶和Klenow大片段

2.2.3DNA连接酶

2.2.4碱性磷酸酶

2.2.5末端脱氧核苷酸转移酶

【教学目的】

让学生掌握什么是基因工程的载体，有哪些典型的基因工程载体，哪些常用的基因工程工具酶，什么情况下使用工具酶等基本常识。

【教学重点】

常用基因工程载体的结构、工具酶的用途。

【教学难点】

基因工程载体的结构和使用

【教学方式】

多媒体讲解结合启发讨论式教学

第一节载体

一、质粒载体（3）

【教学重点】

质粒载体的构建与标记基因；克隆质粒载体的克隆过程

【教学难点】

质粒的结构

【教学过程与内容】

载体是指运载外源DNA有效的进入受体细胞内的工具。

载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。

作为载体必须满足的条件：

①有多种限制性内切酶的切点，但每一种酶最好只有一个切点；②外源DNA插入以后载体在受体细胞中自我复制；③有便于选择的标记基因；④具有促进外源DNA表达的调控区。

2.1.1质粒载体

质粒是在许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子。

它是闭合环状双链DNA分子，大小1kb到200kb不等。

能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系。

有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有利的。

质粒的复制分松弛型和严谨型两种。

松弛型质粒是指质粒的复制跟细菌染色体的复制不同步，一般在一个菌体内能复制10-200拷贝；严谨型质粒是指质粒复制跟细菌染色体同步，一般含有1-10拷贝。

一、质粒的基本特性

1．质粒的复制

    通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。

在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和θ复制。

在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制起始位点。

 2．质粒的拷贝数

    质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。

严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。

  3．质粒的不相容性

    两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时出现的现象。

不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。

两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。

4．转移性

    质粒具转移性。

它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。

它需要移动基因mob，转移基因tra，顺式因子bom及其内部的转移缺口位点nic。

二、标记基因

（一）选择标记

抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记。

1．氨苄青霉素抗性基因（Ampicillinresistancegene,ampr）

    氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。

青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。

氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化β-内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性。

2．四环素抗性基因（Tetracyclineresistancegene,tetr）

    四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。

四环素抗性基因编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。

pBR322质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。

3．氯霉素抗性基因（chloramphenicolresistancegene,Cmr,cat）

    氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成。

cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基23kDa）。

在乙酰辅酶A存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。

4．卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycinresistancegene,kanr,neor）

    卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。

卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（APH（3'）-Ⅱ,25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。

在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。

（二）筛选标记

    筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源DNA片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。

1．α-互补（α-complementation）

    α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。

大肠杆菌的乳糖lac操纵子中的lacZ基因编码β-半乳糖苷酶，如果lacZ基因发生突变，则不能合成有活性的β-半乳糖苷酶。

例如，lacZ△M15基因是缺失了编码β-半乳糖苷酶中第11-41个氨基酸的lacZ基因，无酶学活性。

对于只编码N-端140个氨基酸的lacZ基因（称为lacZ'），其产物也没有酶学活性。

但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复β-半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。

    在lacZ'编码区上游插入一小段DNA片段（如51个碱基对的多克隆位点），不影响β-半乳糖苷酶的功能内互补。

但是，若在该DNA小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无α-互补能力的β-半乳糖苷酶片段。

利用这一互补性质，可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。

在相应的载体系统中，lacZ△M15放在F质粒上,随宿主传代；lacZ'放在载体上,作为筛选标记。

2．插入失活

    通过插入失活进行筛选的质粒主要有pBR322，该质粒具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两种抗性标记。

当外源DNA片段插入tetr基因后，导致tetr基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。

这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。

三、质粒DNA的制备与注意事项：

细菌的培养：

从琼脂平板上挑取单菌落接入5ml含适合抗生素的LB培养基中，于37℃摇床中振荡培养过夜。

保种：

取80%灭菌甘油300ul加入1ml菌种中冷冻保存。

质粒提取：

（1）1.5ml过夜培养物倒入EP管，5000rpm/10min，弃上清。

（2）加入150ul冰预冷的solutionⅠ，vortex，使菌分散重悬。

（3）加入300ulsolutionⅡ，来回颠倒4-6次，冰上≤5min。

（4）加入225ulsolutionⅢ，来回颠倒4-6次，冰上≥5min。

（5）6000rpm/15min（或12000rpm/5min）。

（6）吸上清移入新EP管，等体积酚/氯仿抽提一次，vortex，12000rpm/15min。

（7）吸上清移入新EP管，等体积氯仿抽提，vortex，12000rpm/5min。

（8）重复步骤7）1-2次。

（9）吸上清移入新EP管，0.7倍体积异丙醇沉淀，vortex，12000rpm/15min。

（10）弃上清，1ml70%酒精洗涤1-2次，12000rpm/5min。

（11）弃上清，空气中干燥。

（12）加入10-20ul灭菌ddH2O溶解。

（13）加入适量RNaseA，37℃温育。

如果要用限制酶酶切DNA，缓冲液和限制酶可与RNaseA同时加入，同时进行反应。

提质粒DNA时,溶液I,II,III的作用:

溶液I:

溶菌液,含溶菌酶,使细菌壁溶解,裂解细菌;

溶液II:

NaOH-SDS液,强碱使质粒DNA和染色体DNA变性,而SDS使蛋白质解聚沉淀.

溶液III,酸性高盐溶液,使质粒DNA复性,但高盐使染色体DNA变性沉淀,从而使染色体DNA和质粒DNA分离.

质粒DNA的纯化

RNA酶去RNA

SDS-蛋白复合物

蛋白酶K去蛋白质

酚-氯仿抽提

纯化试剂盒

紫外分光光度计测A260与A280值：

1·8或2·0

SDS的作用

十二烷基硫酸钠，离子型表面活性剂

溶解细胞膜上的脂质与蛋白

解聚核蛋白

与蛋白质结合成复合物

有毒，是一种刺激物，避免吸入粉末

酚与氯仿的使用

酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性，离心后沉淀在下层，而DNA水溶液在上层。

虽然酚比氯仿变性效果好些，但酚与水相有一定程度的混溶，而氯仿与水不混溶，所以混合使用酚与氯仿比较好。

酚要用Tris-HCl缓冲液饱和，并调PH到8，使DNA更稳定，获得RNA含量较少的DNA样品。

质粒DNA沉淀

二倍体积的无水乙醇与DNA相混合。

使乙醇的终含量占67%左右。

室温静置30分钟。

乙醇沉淀时，加NaAcorNaCl至终浓度为0·1-0·25M，是为了中和DNA分子在碱性条件下所带的负电荷，减少DNA分子同性电荷的相斥力。

0·6倍体积的异丙醇沉淀，-20°C半小时。

DNA分离

琼脂糖凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳

氯化铯密度梯度离心

DNA浓度检测

琼脂糖凝胶电泳0.05-0.1µg

EB-标准DNA浓度比较:

1ng

紫外分光光度计测A260:

0.1-1ideal,0.05-1.5accepted

纯度:

分光光度计不但能确定核酸的浓度，还可以通过A260/A280估计核酸纯度。

纯DNA其比值为1.8，纯RNA为2.0。

如比值高于1.8，说明DNA样品中含RNA，而样品中的酚和蛋白质将会导致比值降低。

在紫外透射仪下看DNA时，DNA亮度与哪些因素有关？

DNA浓度

DNA大小

波长

纯度

EB量等有关

四、质粒载体的种类

（一）克隆载体

    克隆载体主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。

1．pBR322

     pBR322质粒的大小为4361bp，GenBank注册号为V0lll9和J01749，含有30多个单一位点，具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr），其质粒复制区来自pMB1。

目前使用广泛的多质粒载体几乎都是由此发展而来的。

利用四环素抗性基因内部的BamHⅠ位点来插入外源DNA片段，可通过插入失活进行筛选。

 pBR322质粒克隆外源基因的过程，见幻灯片课件中的图。

2．pUC18和pUC19

    pUC18和pUC19大小只有2686bp，是最常用的质粒载体，其结构组成紧凑，几乎不含多余的DNA片段，GenBank注册号为L08752（pUC18）和X02514（pUC19）。

由pBR322改造而来，其中lacZ（MSC）来自M13mp18/19。

    这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的排列方向相反。

这些质粒缺乏控制拷贝数的rop基因，因此其拷贝数达500-700。

pUC系列载体含有一段lacZ蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现α-互补作用。

因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。

（二）穿梭载体

穿梭载体是指具有多个复制子能在两个以上的不同宿主细胞复制和繁殖的载体。

（三）表达载体

    表达载体是指能将目的基因在人工控制下置于生物宿主中大量生产的载体.

表达载体的三个系统:

1.DNA复制及质粒DNA的筛选:

有DNA复制起点ori,及Amp,Tet抗性基因

2.目的基因的转录:

这一系统包括启动子,抑制物基因和转录终止子.启动子位于目的基因的上游,常用的如Placz等.

3.蛋白质的翻译:

包括核糖体识别位点SD,翻译起始密码子和终止密码子.

表达载体又分为完整蛋白表达载体和融合蛋白表达载体两类。

该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。

【思考题】

1.质粒的克隆过程如何？

2.质粒克隆片段大小是多少？

3.质粒的克隆表现形式是什么？

第一节载体

二、噬菌体载体与其他类型载体（3）

【教学重点】

噬菌体载体的改建；柯斯载体与人工染色体的结构组成特点

【教学难点】

噬菌体与其他载体的克隆过程

【教学过程与内容】

（一）λ噬菌体

噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。

噬菌体基因组为长度约为50kb的双链DNA分子，实际大小为48502bp（GenBank注册号为：

J02459或M17233）。

在噬菌体颗粒内，基因组DNA呈线性，其两端的5'末端带有12个碱基的互补单链粘性末端，叫COS位点。

12个碱基的序列为5'-GGGCGGCGACCT-3'。

当噬菌体DNA进入宿主细胞后，COS位点两端互补单链通过碱基配对形成环状DNA分子，而后在宿主细胞的DNA连接酶和旋促酶（gyrase）作用下，形成封闭的环状DNA分子，充当转录的模板。

同时COS位点也是噬菌体包装蛋白的识别位点，包装范围在35kb－51kb。

噬菌体的基因组可分为3个区域：

右侧的DNA复制与调控及裂解相关区域，左侧是头部蛋白和尾部蛋白基因区域，中间为非必需区，可被外源基因取代。

野生型λ噬菌体基因组DNA为48kb，若用外源DNA片段完全替换可取代区，外源DNA片段的大小将在9-23kb范围内。

λ噬菌体的选择标记：

lacZ基因

lacZ基因也可用于λ噬菌体载体，通过插入或替换载体中的β-半乳糖苷酶基因片段，在IPTG/X-gal平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体。

λ噬菌体载体的类型：

噬菌体λ载体有两种类型：

插入型和置换型。

插入型λ噬菌体是由于改建后的噬菌体λ较野生型短，所以可插入外源DNA。

而且缺失的片段越长，插入的片段越大。

置换型λ噬菌体基因组分三个区域：

左侧区域包括外壳蛋白基因，约20kb；中间区域18kb，为不重要的替换区，可被外源基因替换；右侧区域含有复制及裂解基因，约12kb。

λDNA与外源DNA之和必须在39-53kb之间，所以可插入7-21kb的外源DNA片段。

（二）单链M13噬菌体：

M13丝状噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，其基因组为单链环状DNA分子，全长6.5kb。

M13感染宿主菌以后，单链DNA转变成双链复制形式的DNA，当复制200-300拷贝以后，又只合成单链DNA，最后包装成单链噬菌体粒子。

 M13噬菌体的基因组为单链DNA，由6407的碱基组成（GenBank注册号为V00604）。

基因组90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。

较大的间隔位于基因Ⅷ和基因Ⅲ以及基因Ⅱ和基因Ⅳ之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。

M13单链噬菌体主要用于需要单链DNA做模板时，如DNA测序。

M13噬菌体基因组中主要含有与复制有关的遗传信息，只有一段由507个核苷酸组成的序列可被替换，因此M13噬菌体载体只能插入约300-400bp的外源片段。

（三）柯斯质粒载体：

1978年由Collins和Hohn改建的一种新型的大肠杆菌克隆载体，用正常的质粒与噬菌体λ的cos位点构成。

一般长为4-6kb。

含有Ampr和Tetr抗性基因。

其上的cos位点可识别噬菌体的外壳蛋白。

凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度上相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。

因此，插入柯斯质粒的外源DNA片段的长度可大于40kb，从而大大增加了载体的携带能力。

粘粒的结构特征和用途

     粘粒（cosmid）实际是质粒的衍生物，是带有cos序列的质粒。

粘粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr），cos位点，因而能象质粒一样转化和增殖。

它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。

粘粒载体的工作原理

   粘粒克隆的主要原理类似噬菌体载体。

在外源片段与载体连接时，粘粒载体相当于噬菌体载体的左右臂，cos位点通过粘端退火后，再与外源片段相间连接成多联体。

当多联体与噬菌体包装蛋白混合时，噬菌体A基因蛋白的末端酶功能将切割两个cos位点，并将两个同方向cos位点之间的片段包装到噬菌体颗粒中去。

这些噬菌体颗粒感染大肠杆菌时，线状的重组DNA就象噬菌体DNA一样被注入细胞并通过cos位点环化，这样形成的环化分子含有完整的粘粒载体，可象质粒一样复制并使其宿主获得抗药性。

因而，带有重组粘粒的细菌可用含适当抗生素的培养基挑选。

通过这种方式，就将外源DNA片段通过粘粒载体克隆到大肠杆菌中了。

   与噬菌体载体不同的是，外源片段克隆在粘粒载体中是以大肠杆菌菌落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。

这样所得到的菌落的总和就构成了基因文库。

（四）其他载体----人工微小染色体：

随着基因工程应用的深入，越来越需要克隆大片段的外源DNA，而且也需要逐步把外源基因转入真核生物体内，而前面提及的载体显然不能满足需要，于是构建人工微小染色体的设想提了出来。

构建人工染色体必须包括染色体的4个基本要素，即基因，复制起点，着丝粒和端粒结构。

首先构建的是酵母人工微小染色体（YAC）。

它含有酵母的标记基因leu2，酵母染色体的着丝粒序列CEN3和自主复制序列ARS1，以及四膜虫的两个端粒序列Tr末端。

YAC由质粒pBR322改建而来，本身为环状；但去转化酵母细胞后，在细胞内断开成为线状的重组DNA分子，可以象天然染色体一样地复制和分离。

天然的酵母染色体长度为150-1000kb，而YAC长为7-15kb，可以携带长度为1-2Mb的外源DNA片段。

但是YAC的装载能力过大也有不利的一面，例如，必须进行亚克隆以及形成“嵌合体”等。

因此现在在人类基因组计划中所使用的新型载体有BAC（细菌人工染色体）,PAC（PI人工染色体）,MAC（哺乳细胞人工染色体）,Fosmid（一种类似于BAC，来源于大肠杆菌的F因子的载体）等,装载能力居中（80-200kb），又方便可靠。

1.酵母人工染色体（YeastartificialchromosomesYACs） 

    在YAC载体中最常用的是pYAC4。

由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。

但是，为了方便制备YAC载体，YAC载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。

   YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。

当用BamHⅠ切割成线状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要顺式元件，如自主复制序列、着丝粒和位于两端的端粒。

这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的DNA片段。

对于BamHⅠ切割后形成的微型酵母染色体，当用EcoRⅠ或SmaⅠ切割抑制基因sup4内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNA的目的。

YAC文库装载的DNA片段的大小一般可达200-500kb，有的可达1Mb以上，甚至达到2Mb。

2.细菌人工染色体载体（Bacterialartificialchromosomes，BACs） 

是基于大肠杆菌的F质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。

每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌F因子（致育因子）的严谨型控制的复制子oriS，一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶（（RepE）以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA,parB,和parC）。

BAC载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。

    第一代BAC载体，不含那些能够用于区分携带重组子的抗生素抗性细菌菌落与携带空载体的细菌菌落的标记物。

新型的BAC载体可以通过α互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了用于回收克隆DNA的NotⅠ酶切位点和用于克隆DNA测序的Sp6启动子、T7启动子（Kimetal.1996;Asakawaetal.1997）。

NotⅠ识别序列，位点十分稀少。

重组子通过NotⅠ消化后，可以得到完整的插入片段。

Sp6、T7是来源于噬菌体的启动子，用于插入片段末端测序。

 BAC与YAC和PAC（P1artificialchromosomes，P1人工染色体）相似，没有包装限制，因此可接受的基因组DNA大小也没有固定的限制。

大多数BAC文库中克隆的平均大小约120kb，然而个别的BAC重组子中含有的基因组DNA最大可达300kb。

【思考题】

1.噬菌体的克隆体现形式是什么？

2.粘粒载体的优势是什么？

3.人工染色体构建原则是什么？

第二节工具酶（3）

【教学时数】3小时

【教学目录】

1限制性内切核酸酶

2DNA聚合酶和Klenow大片段

3DNA连接酶

4碱性磷酸酶

5末端脱氧核苷酸转移酶

【教学目的】

让学生掌握基因工程常用的工具酶有哪些，这些工具酶有什么用途，在什么情况下使用，以及使用有哪些注意事项等基本常识。

【教学重点】

限制性核酸内切酶、DNA聚合酶的性质与使用。

【教学难点】

限制性核酸内切酶的类型与使用注意事项。

【教学方式】

多媒体讲解结合启发讨论式教学

【教学过程与内容】

第二节工具酶

在基因工程的操作中，通常要对目的基因或外源DNA片段以及载体DNA进行剪切，修饰加工与连接等操作，这些处理是通过工具酶来完成的。

1.限制性内切核酸酶

（1）限制性核酸内切酶的概念：

限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异性核苷酸序列并由此特异切割DNA双链结构的水解酶。

是在DNA分子内部切割，水解磷酸二酯键的核酸内切酶。

能够识别特异的DNA碱基序列，DNA碱基序列往往呈回文