PCR实验技术总结.docx

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PCR实验技术总结

增加PCR的特异性：

1.primersdesign

这是最重要的一步。

理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其它序列退火的primer要符合下面的一些条件

a.足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的primer同样会降低特异性,并且降低产量

b.GC%40%~60%

c.5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性

d.避免3'端GCrich,最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC（有人说：

3'端最好是GC/CG/CC/GG。

）

e.避免3'端的互补,否则容易造成DIMER

f.避免3'端的错配

g.避免内部形成二级结构

h.附加序列（RTsite,Promotersequence）加到5'端,在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们

i.使用兼并primer时,要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并primer,并使用较高的primer浓度（1uM-3uM）

j.最好学会使用一种designsoftware.PP5,Oligo6,DNAstar,VectorNTI,Onlinedesignetal.

*primer的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。

这是当50％的primer和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。

在理想状态下，退火温度足够低，以保证primer同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。

合理的退火温度从55℃到70℃。

退火温度一般设定比primer的Tm低5℃。

设定Tm有几种公式。

有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的primer。

有的是根据GC含量估算Tm。

确定primerTm最可信的方法是近邻分析法。

这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测primer的杂交稳定性。

大部分计算器程序使用近邻分析法。

根据所使用的公式及primer序列的不同，Tm会差异很大。

因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。

可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。

开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。

较高的退火温度会减少primer二聚体和非特异性产物的形成。

为获得最佳结果，两个primer应具有近似的Tm值。

primer对的Tm差异如果超过5℃，就会primer在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。

如果两个primerTm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃

或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。

这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

2.stabilityofprimers

定制primer的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。

primer产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。

定制primer以干粉形式运输。

最好在TE重溶primer，使其最终浓度为100μM。

TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核甘的水解。

primer的稳定性依赖于储存条件。

应将干粉和溶解的primer储存在-20℃。

以大于10μM浓度溶于TE的primer在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。

干粉primer可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。

1.PCR产物的电泳检测时间

　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

2.假阴性，不出现扩增条带

　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

　　模板：

①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

　　酶失活：

需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

　　引物：

引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：

①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

　　Mg2+浓度：

Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

　　反应体积的改变：

通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。

或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

　　物理原因：

变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

　　靶序列变异：

如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

3.假阳性

　　出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

　　引物设计不合适：

选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。

靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。

需重新设计引物。

　　靶序列或扩增产物的交叉污染：

这种污染有两种原因：

一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：

①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。

③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。

可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

4.出现非特异性扩增带

　　PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现，其原因：

一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

其对策有：

①必要时重新设计引物。

②减低酶量或调换另一来源的酶。

③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

④适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。

5.出现片状拖带或涂抹带

　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

其对策有：

①减少酶量，或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。

③适当降低Mg2+浓度。

④增加模板量，减少循环次数克隆PCR产物

PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系：

　　　　　　10×扩增缓冲液　10ul

　　　　　　4种dNTP混合物　各200umol/L

　　　　　　引物　　　　　各10～100pmol　

　　　　　　模板DNA　　　　0.1～2ug　

　　　　　　TaqDNA聚合酶　2.5u　

　　　　　　Mg2+　　　　　　1.5mmol/L

　　　　　　加双或三蒸水至　100ul

　　PCR反应五要素：

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

　　引物：

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度：

15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度：

以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：

G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。

ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：

引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

引物量：

每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

　　酶及其浓度　目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。

催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

　　dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。

dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。

HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。

多次冻融会使dNTP降解。

在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。

浓度过低又会降低PCR产物的产量。

dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

　　模板（靶基因）核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。

SDS的主要功能是：

溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。

提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。

一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。

RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

　　Mg2+浓度　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。

Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

　　PCR反应条件的选择

　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

　　温度与时间的设置：

基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。

在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。

对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性）。

　　①变性温度与时间：

变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。

一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。

此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

　　②退火（复性）温度与时间：

退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。

变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。

由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。

退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。

对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。

引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

　　　　　Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）

　　　　　复性温度=Tm值-（5～10℃）

　　在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。

复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

　　③延伸温度与时间：

TaqDNA聚合酶的生物学活性：

　　　　　　　　　70～80℃150核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　70℃60核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　55℃24核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。

　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。

PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。

3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。

延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。

对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

4．1TaqDNA聚合酶

在早期进行的PCR反应中，使用的是大肠杆菌DNA聚合酶1的大片段，，即Klenow片段。

也曾有人用噬菌体T4DNA聚合酶。

这两种酶的共同弱点是对热不稳定性，DNA合成反应只能在370C进行。

PCR时每一循环的解链温度都在90C以上进行，故在每两个循环之间要加入新的DNA聚合酶，使得整过程整个实验过程很繁琐和昂贵。

同时在370C，引物与DNA模板之间会发生分子非特异性结合，最终导致很多非特异性DNA片段的扩增。

Taq酶有耐高温的特性，其最适的活性温度是720C（75-80），连续保温30分钟仍具有相当的活性，而且在比较宽的温度范围内都保持着催化DNA合成的能力，一次加酶即可满足PCR操作过程自动化的实现。

（1）TaqDNA聚合酶的热稳定性及最适延伸温度

相对分子质量为94000的TaqDNA聚合酶的酶活性较高，大约为Umg，在合成时有一个较高的最适温度75-80C，转换数Kcat接近150nt/（s•酶分子）。

这种活性有明显的温度依赖性。

TaqDNA聚合酶虽然在90C以上合成DNA的能力有限，但高温时仍比较稳定。

有人试验证明在92.5C,95C,和97.5C时，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分别经130分钟、40分钟和5-6分钟后仍可保持50%左右的活性，其半衰期较长。

所以，在一个PCR预备试验中，每次循环时上限温度为95C（试管内）处理20秒，则循环50次后TaqDNA聚合酶仍可保持65%的活性，能够保证实验的需要。

TaqDNA聚合酶具有很高的加工合成特性，其最适延伸温度在75-80C时，dNTP的掺入速度为35-100nt/（•酶分子）,最长延伸长度7。

6kb，如对M13上的富含GC的30-me引物，该酶在70C的延伸率高于60nt/（•酶分子）,在55C仍有较高的延伸活性，22C和37C时延伸速度分别为0。

25和1。

5nt/（•酶分子）。

由此可见，在低温下，TaqDNA聚合酶一表现活性明显降低，因而，导致此酶在模板链分子内局部二级结构区域的延伸能力受损或前进速率常数与解离常数的比值发生改变。

在很高的温度（90C以上）时，很少DNA合成。

在体外条件下，DNA在较高温度时的合成速度受到引物或引物链与模板链的双链结构稳定性的限制。

温度对TaqDNA聚合酶活性的影响见表。

由于TaqDNA聚合酶的最适延伸温度高达75-80C，故退火和延伸反应温度均可提高，限制了非特异性扩增产物的出现，增加了PCR的特异性。

4．2模板

（1）模板的纯度一般不要求很高，不需要达到超纯。

某些扩增实验中甚至可以直接将溶细胞液煮沸加热，用蛋白质变性后的DNA溶液作模板。

但DNA溶液中不能有影响扩增反应的物质存在，例如蛋白酶、核酸酶、结合DNA的蛋白质等；另一类是尿素、十二烷基硫酸钠、卟啉类物质等；还有一类是二价金属离子的络合剂（如EDTA）等，会与Mg2+络合，影响TaqDNA聚合酶的活性。

上述物质的存在会影响扩增效果，甚至使扩增失败。

（2）模板DNA的量一般对于单拷贝的哺乳动物基因组模板来说，100ul的反应体系中有100ng的模板已足够。

有时，加的模板太多，会令扩增失败。

这时如果对模板稀释后再加入反应体系中，往往能获得成功。

4．3dNTP

dNTP储备液必须为PH7.0左右,浓度一般为2mmol/L,分装后置-20C保存.典型的PCR扩增体系中,两种dNTP的终浓度为20-200umol/L.理论上,100ul反应液中两种dNTP的浓度为20umol/L时,足以合成12.5ugDNA或合成10pmol400bp的DNA片段.DNTP会络合溶液中的Mg2+,而且大于200umol/L的dNTP会增加TaqDNA聚合酶的错配率.如果dNTP的浓度达到1mmol/L时,则会抑制TaqDNA聚合酶活性.

4．4Mg2+浓度

TaqDNA聚合酶在合成新DNA链时,要求有游离的Mg2+,因而在PCR系统中确定Mg2+的最适浓度是必要的.Mg2+浓度太低会无PCR产物,太高又会导致非特异的产物产生.故常需根据各自的实验预先试验,以确定本实验的最佳Mg2+浓度,保证DNA聚合酶具有良好的活性.

通常情况下,要求反应体系中有0.5-2.5mmol/L的游离Mg2+.反应内容物中,dNTP能与Mg2+.结合,所含EDTA会与Mg2+络合,高浓度的DNA也有干扰作用,都会影响Mg2+的有效浓度.

4．5PCR系统中的其它成分

PCR反应缓冲溶液通常用10mmol/LTris-HCl（PH8.3,20C）,它是两性离子缓冲剂.此外,还有50mmol/LKCL,它有利于引物与模板退火.高于50mmol/L的KCL,或50mmol/L的NaCl对TaqDNA聚合酶有抵制作用.明胶或血清白蛋白（100ug/ml）及非离子去污剂,如Tween20等,对TaqDNA聚合酶起稳定作用.

4．6PCR的热循环计划

在标准反应中,将标本加热至90-95C,使DNA双链变性,再快速冷却至40-60C使引物退火并结合到互补靶序列上,然后升温至70-75C,在TaqDNA聚合酶的作用下掺入单核苷酸使引物沿模板延伸.每步时间从反应达到要求温度后计算.PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性\引物退火和反应延伸3个步骤组成的.图中设定的反应参数是94C变性1分钟,60C退火1分钟,72C延伸1.5分钟.如此周而复始,重复进行,直到扩增产物的数量满足实验需求为止.

（1）变性温度与时间使靶基因模板和PCR产物完全变性是PCR成败的关键.DNA在其链分解温度时的变性只需几秒钟,但反应管内达到Tss还需一定时间,变性温度太高会影响酶活性;通常情况下94-95C变性1分钟就足以使模板DNA完全变性,更高的温度可能更为有效（尤其是富含C+G的靶基因）,若低于94C,则需延长变性时间.为提高起始模板的变性效果,保存酶活性,常常在加入Taq酶之前97C先变性7-10分钟,再按94C的变性温度进入循环方式,这对PCR的成功有益处.

（2）复性温度与时间复性温度决定着PCR的特异性.引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。

合适的复性温度应低于扩增引物在PCR条件下真实Tm值的5C，引物越短（12-15bp）,复性温度越低（40-45C）。

一般来说，若降低复性温度（37C），可提高坟增产量，但引物与模板间错配现象会增多，导致非特异性扩增上升；若提高复性温度（56-70C），虽扩增反应的特异性增加，但扩增效果下降。

理想的方法是：

设置一系列对照反应，以确定扩增反应的最适复性温度。

（3）延伸温度与时间TaqDNA聚合酶虽能在较宽的温度范围内催化DNA的合成，但不合适的温度仍可对扩增产物的特异性、产量造成影响。

引物延伸温度一般为72C（较复性温度高10C左右），延伸时间视目标DNA片段长短和浓度而定。

在最适温度下，核苷酸的掺入率为35-100nt/s，这也取决于缓冲体系、PH值、盐浓度和DNA模板的性质等，延伸1分钟对长达2kb的扩增片段是足够的，延伸时间过长会导致非特异扩增带的出现，但在循环的最后一步延伸时，为使反应完全，提高产量，可将延伸时间延长4-10分钟。

（4）循环数循环数决定着扩增程度，常规PCR一般为25-40周期，在其他参数交已优化的条件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓度，其相应关系参照下表

模板DNA分子数需要热循环次数

3．0×10525-30

1．5×10430-35

1．0×10335-40

5040-45

循环次数太少，得不到一定的产物量；循环次数太多时，扩增反应的后期，产物积累的指数率下降甚至不再有正确的产物生成，正常的反应几乎停止，呈现平台效应。

影响出现平台效应的因素有：

A、反应试剂（dNTP或酶）稳定性的改变；

B、终产物（如焦磷酸）的抑制效应；

C、产物浓度超过10-5时可产生重复退火，于是会降低引物延伸速率或DNA聚合酶的活性

D、高浓度产物DNA双链的解链不宝剑。

平台效应时的一种重要后果是由于错误引导，在开始时浓度不高的非特异产物会继续扩增，使结果的分析复杂化。

4．3引物的要求：

（1）一般长15-30bp，常用20bp（理论上420=11×1011长的DNA片段才会有重复）。

引物过长，扩增的效率降低。

（2）碱基组成：

C+G占50-60%（常规），尽量避免数个嘌呤和嘧啶的连续排列。

（3）一对引物之间不能有2个以上的碱基互补，特别是3‘末端；引物之间的碱基互补会形成引物二聚体，引物本身应避免回文序列。

（4）引物与模板退火的温度和所需的时间取决于引物的碱基组成、长度和溶液中引物的浓度。

合适的退火温度是低于引物本身的实际变性温度（Tm）50C