硬脂酸镁的微生物限度检查综述.docx
《硬脂酸镁的微生物限度检查综述.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《硬脂酸镁的微生物限度检查综述.docx(12页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
![硬脂酸镁的微生物限度检查综述.docx](https://file1.bdocx.com/fileroot1/2023-2/11/5dfb580d-5c43-4c71-8fac-f65da736d79d/5dfb580d-5c43-4c71-8fac-f65da736d79d1.gif)
硬脂酸镁的微生物限度检查综述
硬脂酸镁的微生物限度检查
一、概述
本报告按USP31中“〈61-62〉非灭菌产品的微生物学检查”的规定,对硬脂酸美的微生物学检查方法学考察。
参照企业提供标准,通过测试实验制定适合于本品的微生物学检查的方法。
企业提供标准:
总需气菌数(TAMC)不得过1000cfu/g;霉菌及酵母菌总数(TYMC)不得过500cfu/g;每1g样品不得检出大肠埃希菌;每10g样品不得检出沙门氏菌。
二、方法学
1、培养基及试剂
实验用培养基及缓冲液均符合USP规定。
BP:
pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液
CA:
溴化十六烷基三甲铵
MCA:
麦康凯琼脂
MCB:
麦康凯肉汤
MSA:
甘露醇盐琼脂
RVS:
RV沙门菌增菌肉汤
SDA:
沙氏葡萄糖琼脂
SDB:
沙氏葡萄糖肉汤
TSA:
大豆胰酪胨琼脂
TSB:
大豆胰酪胨肉汤
XLD:
赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂
2、实验菌株
黑曲霉ATCC16404
枯草芽孢杆菌ATCC6633,CMCC(B)63501
白色念珠菌ATCC10231,CMCC(F)98001
大肠埃希菌ATCC8739
铜绿假单胞菌ATCC9027
霍乱沙门氏菌ATCC14028
金黄色葡萄球菌ATCC6538,CMCC(B)26003
本实验取用中国临床医学菌种保存中心(CMCC)的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌。
这三株菌也来源于ATCC。
实验用菌株,自种子批启用传代不超过5次。
黑曲霉为3个月内制得的4℃保存的孢子悬液,可直接稀释使用。
参照表格2,将其他6株菌分别接种至规定的培养条件培养。
上述各菌分别以pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液10倍稀释至大约50-100cfu/mL的浓度,备用。
参照表格2各菌株的生长条件,采用浇碟法测定稀释得到的最终菌液浓度。
3、方法学
本部分主要包括培养基特性测试和方法的适用性考察。
3.1培养基特性测试
按照USP31中“〈61-62〉非灭菌产品的微生物学检查”的规定,与已经通过测试验证的参比培养基(MⅠ)相比,当微生物限度检查用培养基(MⅡ)符合以下标准,则用于硬脂酸美的微生物学检验:
a.固体培养基的促生长能力:
与MⅠ相比,MⅡ的回收率应在50%-200%之间。
b.固体培养基指示能力:
与MⅠ相比,规定菌株在MⅡ的生长特征应与之类似。
c.液体培养基促生长能力:
与MⅠ相比,规定菌株在MⅡ有明显浑浊。
d.抑制能力:
无论是固体培养基或是液体培养基,规定菌株在其不得生长。
对于固体培养基,通常采用平皿计数法(包括浇碟法和表面接种法)来评价培养基特性,每次平行测试两皿,最后取平均数为计算结果。
培养基特性测试结果见表格3-表格5。
3.2方法适用性
当微生物学检查方法符合以下要求时,说明该方法适用该品种:
a.样品供试液不得抑制测试菌株的生长。
计数实验中,测试微生物在供试样品中的回收率不得低于接种量的50%;控制菌检查中,测试菌在含有规定量供试品的环境中应可以生长。
b.样品自身含有的微生物水平不得干扰菌株回收实验。
供试液制备:
以70%的乙醇擦拭供试品的外包装,使自然挥干。
由于硬脂酸美是一种脂溶性物质,因此用表面活性剂吐温-80将其溶解。
无菌操作取10g硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶,加入一定量的45℃灭菌的含1%吐温-80的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液,振摇使分散均匀,制成1:
40的供试液。
计数方法适用性:
a.实验组:
取4个直径为9cm的无菌平皿。
其中两个平皿中加入1:
40供试液4mL和50-100cfu测试菌,取另两平皿加入1:
40供试液2mL和50-100cfu测试菌。
每个平皿倾注45℃表格2中的规定培养基,摇匀。
待琼脂凝固后,参照表格2的条件倒置培养。
5株测试菌(黑曲霉、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌)均进行该测试。
b.样品组:
取8个直径为9cm的无菌平皿。
其中两个平皿中分别加入1:
40供试液4mL和2mL,每个平皿倾注45℃TSA;取另两平皿加入1:
40供试液4mL和2mL,每个平皿倾注45℃SDA;各平行测试两皿。
参照表格2培养。
记录平皿计数结果,计算测试菌回收率。
c.菌液组:
计数方法适用性检查中测试菌包括5株测试菌,分别为黑曲霉、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。
参考表格2培养条件,采用浇碟法计数,确定接种量。
d.回收率计算公式如下:
A-实验组平均菌落数;B-样品组平均菌落数;C-菌液组平均菌落数。
控制菌测试方法适用性:
大肠埃希菌
a.预培养:
取1:
40供试液40mL(相当于1g)至400mL灭菌TSB,混匀,置30至35℃培养18至24小时。
b.阳性组1:
接种50-100cfu大肠埃希菌至灭菌TSB中,置30至35℃培养18至24小时。
c.实验组1:
取1:
40供试液40mL(相当于1g)和50-100cfu大肠埃希菌至400mL灭菌TSB,混匀,置30至35℃培养18至24小时。
d.阳性组2:
取1mL灭菌TSB和50-100cfu大肠埃希菌至100mL灭菌麦康凯肉汤中,置42至44℃培养24至48小时;划线接种至麦康凯琼脂,30至35℃培养18至72小时。
e.实验组2:
取TSB预培养物1mL和50-100cfu大肠埃希菌至100mL灭菌麦康凯肉汤中,置42至44℃培养24至48小时。
划线接种至麦康凯琼脂,30至35℃培养18至72小时。
沙门氏菌
a.预培养:
无菌操作取10g硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶,加入45℃的400mL1%吐温-80的灭菌TSB,振摇使分散均匀,置30至35℃培养18至24小时。
b.阳性组1:
接种50-100cfu霍乱沙门氏菌至灭菌的1%吐温-80的TSB中,置30至35℃培养18至24小时。
c.实验组1:
无菌操作取10g硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶,加入45℃的400mL灭菌的1%吐温-80的TSB,振摇使分散均匀。
加入50-100cfu霍乱沙门氏菌置30至35℃培养18至24小时。
d.阳性组2:
取0.1mL灭菌TSB(含1%吐温-80)和50-100cfu霍乱沙门氏菌至10mL灭菌RVS肉汤中,30至35℃培养18至24小时;划线接种至XLD琼脂,30至35℃培养18至48小时。
e.实验组2:
取TSB(含1%吐温-80)预培养物0.1mL和50-100cfu霍乱沙门氏菌至10mL灭菌RVS肉汤中,30至35℃培养18至24小时;划线接种至XLD琼脂,30至35℃培养18至48小时。
4、讨论
表格3至表格5表明本品涉及到所有培养基均符合微生物学检查用的要求。
培养基的灭菌方式各异,参见表格1。
表格6至表格8表明硬脂酸美并不抑制各株测试菌的生长。
计数实验中,胶囊壳自身的颜色使得琼脂清晰度降低,使得对3株细菌(枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌)的计数较为困难,但并不影响黑曲霉和酵母菌的计数。
因此,通过方法适用性实验,确定以增加培养基体积的方式使得平皿计数可行。
控制菌检查方法依照常规方法即可满足。
本品微生物学检查方法的具体内容在后续细述,详见“微生物学检查检验操作程序”。
三、微生物学检查检验操作程序
1、供试样品制备
以70%的乙醇擦拭供试品的外包装,使自然挥干。
无菌操作取10g硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶,加入的45℃含1%吐温-80灭菌pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液,振摇使分散均匀,制成1:
40的供试液。
取1:
40供试液4mL至6mLpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液,制得1:
100供试液。
2、计数测试
实验中均使用直径为9cm的灭菌平皿。
a.需气菌计数(TAMC):
取1:
40供试液2mL,平行测定4皿;取1:
100供试液1mL,平行测定2皿,分别倾注15-20mL45℃TSA琼脂,充分摇匀分散供试品。
待平皿中琼脂凝固后,30-35℃倒置培养3至5天。
b.霉菌和酵母菌计数(TYMC):
取1:
40供试液2mL,平行测定4皿,;取1:
100供试液1mL,平行测定2皿,倾注15-20mL45℃SDA琼脂,充分摇匀分散供试品。
待平皿中琼脂凝固后,20-25℃倒置培养5至7天。
按照规定培养条件结束培养后,点击平皿中的菌落数(CFU)。
通过平皿计数结果求算均值,最后转换为相当于每g样品中含有的菌落数。
若样品中未检出菌落,则结果可解释为“每g样品中菌落数少于10个。
”。
3、控制菌检查
3.1大肠埃希菌
取1:
40供试液40mL(相当于1g)至400mLTSB,混匀,置30至35℃培养18至24小时,观察结果。
取TSB培养物2mL接种至100mL麦康凯肉汤,置42至44℃培养24至48小时,观察结果并划线接种至麦康凯琼脂,置30至35℃培养18至72小时,逐日观察结果。
3.2沙门氏菌
无菌操作取10g硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶,加入400mL的45℃灭菌TSB(含1%吐温-80),振摇使分散均匀,置30至35℃培养18至24小时,观察结果。
取0.1mLTSB培养物接种至10mLRVS肉汤,置30至35℃培养18至24小时,观察结果并划线接种至XLD琼脂,置30至35℃培养18至48小时,逐日观察结果。
4、阴性对照
实验设置阴性对照组,以确证实验操作条件的可靠性。
阴性对照操作同上述操作过程,其中以稀释剂代替供试品同步操作。
表格:
表格1:
培养基来源信息
参比培养基
测试用培养基
灭菌条件
厂家
批号
厂家
批号
BP
/
/
美坛
090205
121℃,15min
MCA
NICPBP
DCM0008
美坛
070124
121℃,15min
MCB
NICPBP
DCM0013
美坛
080321
121℃,15min
RVS
NICPBP
DCM0003
Merck
VM855366721
115℃,15min
SDA
NICPBP
DCM0005
美坛
070315
121℃,15min
SDB
NICPBP
DCM0001
美坛
090209
121℃,15min
TSA
NICPBP
DCM0002
美坛
080701
121℃,15min
TSB
NICPBP
DCM0011
美坛
090414
121℃,15min
XLD
NICPBP
DCM0012
BD
7088156
Heattoboiling
表格2:
测试用菌株生长条件
测试用菌株
菌株复苏用
培养基
计数用培养基
培养温度
培养时间
黑曲霉
/
SDA
20-25℃
5-7days
枯草芽孢杆菌
TSB
TSA
30-35℃
3-5days
白色念珠菌
SDB
SDA
20-25℃
5-7days
大肠埃希菌
TSB
TSA
30-35℃
3-5days
铜绿假单胞菌
TSB
TSA
30-35℃
3-5days
霍乱沙门氏菌
TSB
TSA
30-35℃
3-5days
金黄色葡萄球菌
TSB
TSA
30-35℃
3-5days
表格3.固体培养基促生长能力测试结果
培养基
测试菌株
测试次数
平均菌落数
回收率
(%)
接种量
回收量
TSA
①
黑曲霉
1
19
17
87
2
19
16
86
3
92
81
89
枯草芽孢杆菌
1
135
114
85
2
85
82
96
3
128
120
84
白色念珠菌
1
52
50
95
2
64
51
79
3
77
57
73
铜绿假单胞菌
1
89
56
63
2
38
25
64
3
142
115
81
金黄色葡萄球菌
1
81
53
66
2
58
39
67
3
52
39
75
SDA
①
黑曲霉
1
45
43
94
2
26
25
96
3
24
19
81
白色念珠菌
1
88
85
97
2
48
42
87
3
56
52
94
MCA
②
大肠埃希菌
1
168
161
96
2
125
160
128
3
80
100
125
XLD
②
霍乱沙门氏菌
1
96
78
81
2
110
92
84
3
125
132
106
方法:
①—浇碟法②—表面接种法
接种量-MⅠ菌落计数结果;回收量-MⅡ菌落计数结果
表格4.固体培养基指示能力和抑制能力测试结果
培养基
测试菌株
指示能力
抑制能力
MCA
大肠埃希菌
紫红色或粉红色圆形菌落。
/
XLD
霍乱沙门氏菌
红色菌落,有黑色中心。
/
大肠埃希菌
白色圆形菌落
/
表格4中各测试均采用表面接种法。
表格5.液体培养基促生长能力和抑制能力测试
培养基
测试菌株
促生长能力
抑制能力
TSB
枯草芽孢杆菌
+
/
铜绿假单胞菌
+
/
金黄色葡萄球菌
+
/
SDB
白色念珠菌
+
/
MCB
大肠埃希菌
+
/
金黄色葡萄球菌
/
Nogrowth
RVS
霍乱沙门氏菌
+
/
金黄色葡萄球菌
/
Nogrowth
表格6.计数方法适用性考察结果
测试菌株
测试次数
平均菌落数
回收率
(%)
接种量
回收量
枯草芽孢杆菌
1
33
31
94
2
109
97
89
3
105
96
91
铜绿假单胞菌
1
170
154
90
2
27
25
91
3
53
51
97
金黄色葡萄球菌
1
49
49
100
2
43
45
103
3
60
54
91
白色念珠菌
1
67
61
91
2
72
67
93
3
60
63
105
黑曲霉
1
69
52
76
2
62
61
97
3
67
54
81
表格7.表格8测试用菌株接种量
测试菌株
接种量
第一次
第二次
第三次
大肠埃希菌
62
90
33
霍乱沙门氏菌
88
19
80
表格8.控制菌检查方法适用性考察结果
检查的
目标控制菌
培养基
第一次
第二次
第三次
S组
T组
S组
T组
S组
T组
大肠埃希菌
TSB
+
+
+
+
+
+
MCB
+
+
+
+
+
+
MCA
+
+
+
+
+
+
沙门氏菌
TSB
+
+
+
+
+
+
RVS
+
+
+
+
+
+
XLD
+
+
+
+
+
+
S组-阳性菌组;T组-实验组。