紫外可见分光光度法教案.docx
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紫外可见分光光度法教案
第五章紫外—可见分光光度法
一．教学内容
1．紫外－可见吸收光谱的产生（分子的能级及光谱、有机物及无机物电子能级跃迁的类型和特点）
2．吸收定律及其发射偏差的原因
3．仪器类型、各部件的结构、性能以及仪器的校正
4．分析条件的选择
5．应用（定性及结构分析、定量分析的各种方法、物理化学常数的测定及其它方面的应用
二．重点与难点
1．比较有机化合物和无机化合物各种电子跃迁类型所产生吸收带的特点及应用价值
2．进行化合物的定性分析、结构判断
3．定量分析的新技术（双波长法、导数光谱法、动力学分析法）
4．物理化学常数的测定
三．教学要求
1．较为系统、深入地掌握各种电子跃迁所产生的吸收带及其特征、应用
2．熟练掌握吸收定律的应用及测量条件的选择
3．较为熟练仪器的类型、各组件的工作原理
4．运用各种类型光谱及
的经验规则，判断不同的化合物
5．掌握定量分析及测定物理化学常数的常见基本方法
6．一般掌握某些新的分析技术
四．学时安排5学时
研究物质在紫外、可见光区的分子吸收光谱的分析方法称为紫外-可见分光光度法。
紫外—可见分光光度法是利用某些物质的分子吸收200~800nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法。
这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，广泛用于无机和有机物质的定性和定量测定。
第一节紫外—可见吸收光谱
一、分子吸收光谱的产生
在分子中，除了电子相对于原子核的运动外，还有核间相对位移引起的振动和转动。
这三种运动能量都是量子化的，并对应有一定能级。
在每一电子能级上有许多间距较小的振动能级，在每一振动能级上又有许多更小的转动能级。
若用△E电子、△E振动、△E转动分别表示电子能级、振动能级转动能级差，即有△E电子△E振动△E转动。
处在同一电子能级的分子，可能因其振动能量不同，而处在不同的振动能级上。
当分子处在同一电子能级和同一振动能级时，它的能量还会因转动能量不同，而处在不同的转动能级上。
所以分子的总能量可以认为是这三种能量的总和：
E分子=E电子+E振动+E转动
当用频率为的电磁波照射分子，而该分子的较高能级与较低能级之差△E恰好等于该电磁波的能量h时，即有
△E=h（h为普朗克常数）
此时，在微观上出现分子由较低的能级跃迁到较高的能级；在宏观上则透射光的强度变小。
若用一连续辐射的电磁波照射分子，将照射前后光强度的变化转变为电信号，并记录下来，然后以波长为横坐标，以电信号（吸光度A）为纵坐标，就可以得到一张光强度变化对波长的关系曲线图——分子吸收光谱图。
二、分子吸收光谱类型
根据吸收电磁波的范围不同，可将分子吸收光谱分为远红外光谱、红外光谱及紫外、可见光谱三类。
分子的转动能级差一般在0.005~0.05eV。
产生此能级的跃迁，需吸收波长约为250~25m的远红外光，因此，形成的光谱称为转动光谱或远红外光谱。
分子的振动能级差一般在0.05~1eV，需吸收波长约为25~1.25m的红外光才能产生跃迁。
在分子振动时同时有分子的转动运动。
这样，分子振动产生的吸收光谱中，包括转动光谱，故常称为振-转光谱。
由于它吸收的能量处于红外光区，故又称红外光谱。
电子的跃迁能差约为1~20eV，比分子振动能级差要大几十倍，所吸收光的波长约为12.5~0.06m，主要在真空紫外到可见光区，对应形成的光谱，称为电子光谱或紫外、可见吸收光谱。
通常，分子是处在基态振动能级上。
当用紫外、可见光照射分子时，电子可以从基态激发到激发态的任一振动（或不同的转动）能级上。
因此，电子能级跃迁产生的吸收光谱，包括了大量谱线，并由于这些谱线的重叠而成为连续的吸收带，这就是为什么分子的紫外、可见光谱不是线状光谱，而是带状光谱的原因。
又因为绝
大多数的分子光谱分析，都是用液体样品，加之仪器的分辨率有限，因而使记录所得电子光谱的谱带变宽。
由于氧、氮、二氧化碳、水等在真空紫外区（60~200nm）均有吸收，因此在测定这一范围的光谱时，必须将光学系统抽成真空，然后充以一些惰性气体，如氦、氖、氩等。
鉴于真空紫外吸收光谱的研究需要昂贵的真空紫外分光光度计，故在实际应用中受到一定的限制。
我们通常所说的紫外—可见分光光度法，实际上是指近紫外、可见分光光度法。
第二节化合物紫外—可见光谱的产生
在紫外和可见光谱区范围内，有机化合物的吸收带主要由*、*、n*、n*及电荷迁移跃迁产生。
无机化合物的吸收带主要由电荷迁移和配位场跃迁（即d—d跃迁和f—f跃迁）产生.
由于电子跃迁的类型不同，实现跃迁需要的能量不同，因此吸收光的波长范围也不相同。
其中*跃迁所需能量最大，n*及配位场跃迁所需能量最小，因此，它们的吸收带分别落在远紫外和可见光区。
从图中可知，*（电荷迁移）跃迁产生的谱带强度最大，*、n*、n*跃迁产生的谱带强度次之，（配位跃迁的谱带强度最小）。
一、有机化合物的紫外—可见吸收光谱
（一）、跃迁类型
基态有机化合物的价电子包括成键电子、成键电子和非键电子（以n表示）。
分子的空轨道包括反键*轨道和反键*轨道，因此，可能的跃迁为*、*、n*n*等。
1，*跃迁它需要的能量较高，一般发生在真空紫外光区。
饱和烃中的—c—c—键属于这类跃迁，例如乙烷的最大吸收波长max为135nm。
2，n*跃迁实现这类跃迁所需要的能量较高，其吸收光谱落于远紫外光区和近紫外光区，如CH3OH和CH3NH2的n*跃迁光谱分别为183nm和213nm。
3，*跃迁它需要的能量低于*跃迁，吸收峰一般处于近紫外光区，在200nm左右，其特征是摩尔吸光系数大，一般max104，为强吸收带。
如乙烯（蒸气）的最大吸收波长max为162nm。
4，n*跃迁这类跃迁发生在近紫外光区。
它是简单的生色团如羰基、硝基等中的孤对电子向反键轨道跃迁。
其特点是谱带强度弱，摩尔吸光系数小，通常小于100，属于禁阻跃迁。
5，电荷迁移跃迁
所谓电荷迁移跃迁是指用电磁辐射照射化合物时，电子从给予体向与接受体相联系的轨道上跃迁。
因此，电荷迁移跃迁实质是一个内氧化—还原的过程，而相应的吸收光谱称为电荷迁移吸收光谱。
例如某些取代芳烃可产生这种分子内电荷迁移跃迁吸收带。
电荷迁移吸收带的谱带较宽，吸收强度较大，最大波长处的摩尔吸光系数max可大于104。
（二）、常用术语
1，生色团
从广义来说，所谓生色团，是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。
但是，人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色团。
2，助色团
助色团是指带有非键电子对的基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它们本身不能吸收大于200nm的光，但是当它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸光度。
3，红移与蓝移（紫移）
某些有机化合物经取代反应引入含有未共享电子对的基团（-OH、-OR、-NH2、-SH、-Cl、-Br、-SR、-NR2）之后，吸收峰的波长将向长波方向移动，这种效应称为红移效应。
这种会
使某化合物的最大吸收波长向长波方向移动的基团称为向红基团。
在某些生色团如羰基的碳原子一端引入一些取代基之后，吸收峰的波长会向短波方向移动，这种效应称为蓝移（紫移）效应。
这些会使某化合物的最大吸收波长向短波方向移动的基团（如-CH2、-CH2CH3、-OCOCH3）称为向蓝（紫）基团。
（三）有机化合物紫外-可见吸收光谱
1，饱和烃及其取代衍生物
饱和烃类分子中只含有键，因此只能产生*跃迁，即电子从成键轨道（）跃迁到反键轨道（*）。
饱和烃的最大吸收峰一般小于150nm，已超出紫外、可见分光光度计的测量范围。
饱和烃的取代衍生物如卤代烃，其卤素原子上存在n电子，可产生n*的跃迁。
n*的能量低于*。
例如，CH3Cl、CH3Br和CH3I的n*跃迁分别出现在173、204和258nm处。
这些数据不仅说明氯、溴和碘原子引入甲烷后，其相应的吸收波长发生了红移，显示了助色团的助色作用。
直接用烷烃和卤代烃的紫外吸收光谱分析这些化合物的实用价值不大。
但是它们是测定紫外和（或）可见吸收光谱的良好溶剂。
2，不饱和烃及共轭烯烃
在不饱和烃类分子中，除含有键外，还含有键，它们可以产生*和*两种跃迁。
*跃迁的能量小于*跃迁。
例如，在乙烯分子中，*跃迁最大吸收波长为180nm
在不饱和烃类分子中，当有两个以上的双键共轭时，随着共轭系统的延长，*跃迁的吸收带将明显向长波方向移动，吸收强度也随之增强。
在共轭体系中，*跃迁产生的吸收带又称为K带。
3，羰基化合物
羰基化合物含有C=O基团。
C=O基团主要可产生*、n*、n*三个吸收带，n*吸收带又称R带，落于近紫外或紫外光区。
醛、酮、羧酸及羧酸的衍生物，如酯、酰胺等，都含有羰基。
由于醛酮这类物质与羧酸及羧酸的衍生物在结构上的差异，因此它们n*吸收带的光区稍有不同。
羧酸及羧酸的衍生物虽然也有n*吸收带，但是，羧酸及羧酸的衍生物的羰基上的碳原子直接连结含有未共用电子对的助色团，如-OH、-Cl、-OR等，由于这些助色团上的n电子与羰基双键的电子产生n共轭，导致*轨道的能级有所提高，但这种共轭作用并不能改变n轨道的能级，因此实现n*跃迁所需的能量变大，使n*吸收带蓝移至210nm左右。
4，苯及其衍生物
苯有三个吸收带，它们都是由*跃迁引起的。
E1带出现在180nm（MAX=60，000）；E2带出现在204nm（MAX=8，000）；B带出现在255nm（MAX=200）。
在气态或非极性溶剂中，苯及其许多同系物的B谱带有许多的精细结构，这是由于振动跃迁在基态电子上的跃迁上的叠加而引起的。
在极性溶剂中，这些精细结构消失。
当苯环上有取代基时，苯的三个特征谱带都会发生显著的变化，其中影响较大的是E2带和B谱带。
5，稠环芳烃及杂环化合物
稠环芳烃，如奈、蒽、芘等，均显示苯的三个吸收带，但是与苯本身相比较，这三个吸收带均发生红移，且强度增加。
随着苯环数目的增多，吸收波长红移越多，吸收强度也相应增加。
当芳环上的-CH基团被氮原子取代后，则相应的氮杂环化合物（如吡啶、喹啉）的吸收光谱，与相应的碳化合物极为相似，即吡啶与苯相似，喹啉与奈相似。
此外，
由于引入含有n电子的N原子的，这类杂环化合物还可能产生n*吸收带。
二、无机化合物的紫外-可见吸收光谱
产生无机化合物紫外、可见吸收光谱的电子跃迁形式，一般分为两大类：
电荷迁移跃迁和配位场跃迁。
（一）电荷迁移跃迁
无机配合物有电荷迁移跃迁产生的电荷迁移吸收光谱。
在配合物的中心离子和配位体中，当一个电子由配体的轨道跃迁到与中心离子相关的轨道上时，可产生电荷迁移吸收光谱。
不少过度金属离子与含生色团的试剂反应所生成的配合物以及许多水合无机离子，均可产生电荷迁移跃迁。
此外，一些具有d10电子结构的过度元素形成的卤化物及硫化物，如AgBr、HgS等，也是由于这类跃迁而产生颜色。
电荷迁移吸收光谱出现的波长位置，取决于电子给予体和电子接受体相应电子轨道的能量差。
（二）配位场跃迁
配位场跃迁包括d-d跃迁和f-f跃迁。
元素周期表中第四、五周期的过度金属元素分别含有3d和4d轨道，镧系和锕系元素分别含有4f和5f轨道。
在配体的存在下，过度元素五个能量相等的d轨道和镧系元素七个能量相等的f轨道分别分裂成几组能量不等的d轨道和f轨道。
当它们的离子吸收光能后，低能态的d电子或f电子可以分别跃迁至高能态的d或f轨道，这两类跃迁分别称为d-d跃迁和f-f跃迁。
由于这两类跃迁必须在配体的配位场作用下才可能发生，因此又称为配位场跃迁。
三、溶剂对紫外、可见吸收光谱的影响
溶剂对紫外—可见光谱的影响较为复杂。
改变溶剂的极性，会引起吸收带形状的变化。
例如，当溶剂的极性由非极性改变到极性时，精细结构消失，吸收带变向平滑。
改变溶剂的极性，还会使吸收带的最大吸收波长发生变化。
下表为溶剂对亚异丙酮紫外吸收光谱的影响。
正己烷CHCl3CH3OHH2O
*max/nm230238237243
n*max/nm329315309305
由上表可以看出，当溶剂的极性增大时，由n*跃迁产生的吸收带发生蓝移，而由*跃迁产生的吸收带发生红移。
因此，在测定紫外、可见吸收光谱时，应注明在何种溶剂中测定。
由于溶剂对电子光谱图影响很大，因此，在吸收光谱图上或数据表中必须注明所用的溶剂。
与已知化合物紫外光谱作对照时也应注明所用的溶剂是否相同。
在进行紫外光谱法分析时，必须正确选择溶剂。
选择溶剂时注意下列几点：
（1）溶剂应能很好地溶解被测试样，溶剂对溶质应该是惰性的。
即所成溶液应具有良好的化学和光化学稳定性。
（2）在溶解度允许的范围内，尽量选择极性较小的溶剂。
（3）溶剂在样品的吸收光谱区应无明显吸收。
第三节紫外-可见分光光度计
一、组成部件
紫外-可见分光光度计的基本结构是由五个部分组成：
即光源、单色器、吸收池、检测器和信号指示系统。
（一）光源
对光源的基本要求是应在仪器操作所需的光谱区域内能够发射连续辐射，有足够的辐射强度和良好的稳定性，而且辐射能量随波长的变化应尽可能小。
分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类。
热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。
钨灯和碘钨灯可使用的范围在340~2500nm。
这类光源的辐射能量与施加的外加电压有关，在可见光区，辐射的能量与工作电压4次方成正比。
光电流与灯丝电压的n次方（n1）成正比。
因此必须严格控制灯丝电压，仪器必须配有稳压装置。
在近紫外区测定时常用氢灯和氘灯。
它们可在160~375nm范围内产生连续光源。
氘灯的灯管内充有氢的同位素氘，它是紫外光区应用最广泛的一种光源，其光谱分布与氢灯类似，但光强度比相同功率的氢灯要大3~5倍。
（二）单色器
单色器是能从光源辐射的复合光中分出单色光的光学装置，其主要功能：
产生光谱纯度高的波长且波长在紫外可见区域内任意可调。
单色器一般由入射狭缝、准光器（透镜或凹面反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几部分组成。
其核心部分是色散元件，起分光的作用。
单色器的性能直接影响入射光的单色性，从而也影响到测定的灵敏度度、选择性及校准曲线的线性关系等。
能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅。
棱镜有玻璃和石英两种材料。
它们的色散原理是依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开。
由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于350~3200nm的波长范围，即只能用于可见光域内。
石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185~4000nm，即可用于紫外、可见和近红外三个光域。
光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的，它可用于紫外、可见及红外光域，而且在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。
它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。
缺点是各级光谱会重叠而产生干扰。
入射、出射狭缝，透镜及准光镜等光学元件中狭缝在决定单色器性能上起重要作用。
狭缝的大小直接影响单色光纯度，但过小的狭缝又会减弱光强。
（三）吸收池
吸收池用于盛放分析试样，一般有石英和玻璃材料两种。
石英池适用于可见光区及紫外光区，玻璃吸收池只能用于可见光区。
为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。
在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要），吸收池要挑选配对。
因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。
（四）检测器
检测器的功能是检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置。
常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。
硒光电池对光的敏感范围为300~800nm，其中又以500~600nm最为灵敏。
这种光电池的特点是能产生可直接推动微安表或检流计的光电流，但由于容易出现疲劳效应而只能用于低档的分光光度计中。
光电管在紫外-可见分光光度计上应用较为广泛。
光电倍增管是检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比一般的光电管要高200倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。
（五）信号指示系统
它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。
常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。
很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处理。
二、紫外-可见分光光度计的类型
紫外-可见分光光度计的类型很多，但可归纳为三种类型，即单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计。
1，单光束分光光度计
经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。
这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析。
2，双光束分光光度计
经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。
光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。
双光束分光光度计一般都能自动记录吸收光谱曲线。
由于两束光同时分别通过参比池和样品池，还能自动消除光源强度变化所引起的误差。
3，双波长分光光度计
由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长（1和2）的单色光；利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池，然后经过光电倍增管和电子控制系统，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值ΔA（ΔA=A1-A2）。
对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。
利用双波长分光光度计，能获得导数光谱。
通过光学系统转换，使双波长分光光度计能很方便地转化为单波长工作方式。
如果能在1和2处分别记录吸光度随时间变化的曲线，还能进行化学反应动力学研究。
三、分光光度计的校正
通常在实验室工作中，验收新仪器或实验室使用过一段时间后都要进行波长校正和吸光度校正。
建议采用下述的较为简便和实用的方法来进行校正：
镨铷玻璃或钬玻璃都有若干特征的吸收峰，可用来校正分光光度计的波长标尺，前者用于可见光区，后者则对紫外和可见光区都适用。
也可用K2CrO4标准溶液来校正吸光度标度。
定性分析
紫外－可见分光光度法是一种广泛应用的定量分析方法，也是
对物质进行定性分析和结构分析的一种手段，同时还可以测定某些
化合物的物理化学参数，例如摩尔质量、配合物的配合比和稳定常
数、以及酸、碱的离解常数等。
紫外－可见分光光度法在无机元素的定性分析应用方面
是比较少的，无机元素的定性分析主要用原子发射光谱法或化学分
析法。
在有机化合物的定性分析鉴定及结构分析方面，由于紫外－
可见光谱较为简单，光谱信息少，特征性不强，而且不少简单官能
团在近紫外及可见光区没有吸收或吸收很弱，因此，这种方法的应
用有较大的局限性。
但是它适用于不饱和有机化合物，尤其是共轭体系的鉴定，以此推断未知物的骨架结构。
此外，它可配合红
外光谱法、核磁共振波谱法和质谱法等常用的结构分析法进行定量
鉴定和结构分析，是不失为一种有用的辅助方法。
一般定性分析方
法有如下两种：
1.比较吸收光谱曲线法
吸收光谱的形状、吸收峰的数目和位置及相应的摩尔吸
光系数，是定性分析的光谱依据，而最大吸收波长
及相应的
是定性分析的最主要参数。
比较法有标准物质比较法和标准谱图比
较法两种。
利用标准物质比较，在相同的测量条件下，测定和比较未知物与已知标准物的吸收光谱曲线，如果两者的光谱完全一致，则可以初步认为它们是同一化合物。
为了能使分析更准确可靠，要注意如下几点：
一、是尽量保持光谱的精细结构。
为此，应采用与吸收物质作用力小的非极性溶剂，且采用窄的光谱通带；
二、是吸收光谱采用
对
作图。
这样如果未知物与标准物的浓度不同，则曲线只是沿
轴平移，而不是象
曲线那样以
的比例移动，更便于比较分析。
三、是往往还需要用其它方法进行证实，如红外光谱等。
利用标准谱图或光谱数据比较。
常用的标准谱图有以下表中的四种：
[1]SadtlerStandardSpectra（Ultraviolet）,Heyden,London,1978.萨特勒标准图谱共收集了46000种化合物的紫外光谱。
[2]R.A.FriedelandM.Orchin,“UltravioletandVisibleAbsorptionSpectraofAromaticCompounds”,Wiley,NewYork,1951.本书收集了597种芳香化合物的紫外光谱。
[3]KenzoHirayama：
“HandbookofUltravioletandVisibleAbsorptionSpectraaofOrganicCompounds.”,NewYork,Plenum,1967。
[4]“OrganicElectronicSpectralData”。
2.计算不饱和有机化合物最大吸收波长的经验规则
有伍德沃德（Woodward）规则和斯科特（Scott）规则。
当采用其它物理或化学方法推测未知化合物有几种可能结构后，可用经验规则计算它们最大吸收波长，然后再与实测值进行比较，以确认物质的结构。
伍德沃德规则
它是计算共轭二烯、多烯烃及共轭烯酮类化合物π—π*跃迁最大吸收波长的经验规则，如表13.7和表13.9所示。
计算时，先从未知物的母体对照表得到一个最大吸收的基数，然后对连接在母体中π电子体系（即共轭体系）上的各种取代基以及其他结构因素按上所列的数值加以修正，得到该化合物的最大吸收波长
。
。
结构分析
紫外－可见分光光度法可以进行化合物某些基因的判别、共轭体系及构型、构象的判断。
1.某些特征集团的判别
有机物的不少基团（生色团），如羰基、苯环、硝基、共轭体系等，都有其特征的
紫外或可见吸收带，紫外－可见分光光度法在判别这些基团时，有时是十分有用的。
如在270～300nm处有弱的吸收带，且随溶剂极性增大而发生蓝移，就是羰基n－π*跃迁所产生R吸收带的有力证据。
在184nm附近有强吸收带（E1带），在204nm附近有中强吸收带（E2带），在260nm附近有弱吸收带且有精细结构（B带），是苯环的特征吸收，等等。
可以从有关资料中查找某些基团的特征吸收带。
2.共轭体系的判断
共轭体系会产生很强的K吸收带，通过绘制吸收光谱，可以判断化合物是否存在共轭体系或共轭的程度。
如果一化合物在210nm以上无强吸收带，可以认为该化合物不存在共轭体系；若在215～250nm区域有强吸收带，则该化合物可能有两至三个双键的共轭体系，如1－3丁二烯，
为217nm，
为21,000；若260～350nm区域有很强的吸收带，则可能有三至五个双键的共轭体系，如癸五烯有五个共轭双键
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